Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for å kvantifisere svulst celle akkumulering i lungene i en dyremodell av svulst metastasering.
Abstract
For å undersøke de molekylære mekanismene som styrer svulst metastasering, foreslått ulike analyser ved hjelp av musen som en modell dyr. Her viser vi en enkel analysen for å evaluere svulst cellen bloduttredelse eller micrometastasis. I denne analysen, kreftceller ble injisert gjennom halen åre, og etter en kort periode, lungene ble dissekert og fordøyd vil telle akkumulert merket kreftceller. Denne analysen hopper det første trinnet av primære svulst invasjonen i blodkaret og muliggjør studiet av hendelsene i det fjerne orgelet der svulst metastasering skjer. Antall celler injiseres blodkaret kan optimaliseres for å observere et begrenset antall metastaser. Det har blitt rapportert at stromal celler i fjerne organ bidra til metastasering. Derfor kan denne analysen være et nyttig verktøy for å utforske potensielle terapeutiske narkotika eller enheter for forebygging av svulst metastasering.
Introduction
Svulst metastasering står for høy dødelighet i kreft-relaterte sykdommer. Fra synspunktet til undersøkelser på molekylært nivå, metastasering kan deles inn i flere trinn: svulst innvielse på primære svulst området, primære tumor vekst og invasjonen til omkringliggende vev, intravasation, sirkulasjon gjennom blod fartøy , bloduttredelse fjerne organer, og svulst ettervekst. Hvert trinn omfatter ulike sett av molekyler/signaler1.
Studier hittil har vært opptatt av hendelser som forekommer i fjerne organer før kreftceller sirkulerer i blodet, som er også pre metastatisk fase2,3,4,5, 6. Våre mus modell studier viste at den pre metastatisk fasen muliggjør lunge metastasering ved å skape varige og lavt nivå inflammatorisk respons i lungene. Pre metastatisk fasen er preget av hyperpermeability av themicrovasculature, rekruttering av benmarg avledet celler (BMDC) og oppregulering av cytokin/chemokine-lignende molekyler inkludert S100A8 og SAA33,4 . Det har blitt rapportert at lysyl oksidase endrer den ekstracellulære matrisen i lungene å rekruttere BMDCs7. En annen rapport har avdekket betydningen av Angpt2, MMP3 og MMP10 i den pre metastatisk fase8. Med andre ord, intrikate samspillet mellom primære svulster, benmargen og eksterne organer må bli forstått og riktig modulert (for eksempel ved å bruke narkotika som mål proteiner involvert i disse interaksjoner) å hindre fremtidige metastasering9 . For å regulere pre metastatisk fasen, bør først bli visualisert og vurdert for diagnostiske eller terapeutiske tiltak. Her rapporterer vi en lunge svulst celle rekruttering analysen som muliggjør studiet av pre metastatisk fase i lungene.
Kreftceller direkte injiseres i blodkaret museklikk er lik sirkulerende kreftceller i kreftpasienter, selv om det kan være forskjeller mellom kulturperler celler og sirkulerende kreftceller. Sirkulerende kreftceller gjennomgå selv noen karakteristiske endringer når de angir sirkulasjon fra den primære svulsten. Likevel kan kultivert cellene danner svulster i immunodeficient mus når de blir injisert i halen blodåre. I tillegg i mus modell systemet, kan fluorescens merket kreftceller brukes som tillater sporing av disse cellene i kroppen. Virkemåten av sirkulerende kreftceller er avgjørende som de bestemmer de endelige konsekvensene i kreft pasienter10. Blod er ikke et godt sted for overlevelse av tumor celler2. De trenger å flykte fra angrep av immunsystemet vert og trenger anti-apoptotisk signaler å hindre apoptose på grunn av fysisk støtter. Kreftceller med høyere evner av svulst på metastatisk områder generere mer svulst nodules. Hvis kreftceller viser bestemte orgel tropism, praktiseres metastasering i de bestemt organene. De første trinnene i metastatisk kaskade (primære tumor vekst og invasjonen) er ikke inkludert i denne analysen, og så fokuset er på samspillet mellom sirkulerende kreftceller og stromal cellene (endotelceller, epitelceller og blodlegemer). Konvensjonelle svulst celle injeksjon analyser må forskere vente inntil svulsten knuter vokse til en håndgripelig størrelse å oppdage metastasering. I dette tilfellet kan kreftceller i blodkaret antallet ikke tallfestes. Denne prosessen inneholder i tillegg en svulst gjenvekst fase, som angir at andre faktorer i kreftceller kan påvirke utfallet.
Telle er merket kreftceller under en fluorescens stereomicroscope en enkel prosess. Stereomicroscope gir et bredt synsfelt, slik at hele lungene kan skannes. Flowcytometri er også et nyttig verktøy som umiddelbart gir et nøyaktig antall tumorceller i vevet. Telle fluorescerende celler i vevet under AC confocal mikroskop også og viser de mest nøyaktige bildene av metastatisk kreftceller, men det er tidkrevende og kan gi forutinntatte resultater hvis bare et merket område regnes. Det endelige målet med denne analysen er å observere hvor lett kreftceller akkumuleres i lungene. Som rapportert tidligere3,4, hvis lungene er i pre metastatisk fase på grunn av inflammatoriske signalene fra den primære svulsten, er injisert kreftceller utsatt for akkumuleres i lungene, dermed noe høyere sjansene av lunge metastasering. Andre forhold (Revmatoid leddgikt, astma, etc.), og deres behandling med anti-inflammatoriske midler (for eksempel anti-TNFα) kan attenuere lunge metastasering. Derfor konkluderer vi at denne analysen er et kraftig verktøy for å vurdere muligheten for lunge metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utført med mus ble godkjent av dyr forskning komiteen av Tokyo kvinnenes medisinske universitet.
1. hale blodåre injeksjon av Lewis lunge Carcinoma (LLC) celler
- Opprettholde LLC celler i DMEM med 10% FCS, i en fuktet 5% CO2 inkubator på 37 ° C. Cellene må inneholde et fluorescerende protein uttrykk system (f.eks GFP).
- Fjerne celler fra kultur parabol ved hjelp av en ikke-enzymatisk celle dissosiasjon reagens. Følg produsentens protokollen.
- Samle celler i en 15 mL tube, og sentrifuger 400 x g for 3 min. Resuspend cellene i 5 mL av PBS av pipettering og sentrifuge røret (400 x g, 3 min). Deretter Fjern nedbryting.
- Gjenta dette trinnet for vask en gang.
- Etter den andre vasken, cellene passere en celle sil (40 µm porestørrelse) og resuspend i PBS å gi en siste celle tetthet av 1 x 106 celler/mL.
- Injisere 0,1 mL av cellen suspensjon (1 x 105 celler, 29 G p) i hver C57BL/6 musen (8-10 uke gamle menn) via hale venen.
2. isolering av lungene og teller cellene Under en fluorescens Stereomicroscope
- Euthanize mus ved CO2 innånding.
- Fjern skinnet på ventral overflaten av brystet med saks. Deretter klippet ribbeina og membran å avsløre bryst hulrom. Tømme PBS (100 cmH2O, totalt 15 mL) gjennom høyre ventrikkel bevingede infusjon 25 G nål og rør.
- Kuttet ut hjertet og thymus. Grip luftrøret med tang, og trekke opp, dissekere bindevev rundt luftrøret med saks. Dissekere ut lungene og vaske dem i PBS.
- Koble hver lobe og observere det under en fluorescens stereomicroscope.
3. lunge fordøyelse
- Oppløse 10 mg collagenase, 10 mg av dispase og 10 µg av DNase i 10 mL av serum-free DMEM. Filtrere gjennom et 0.22 µm sprøyte filter å forberede enzymatisk fordøyelsen løsningen.
- Terninger av isolerte caudal flik med saks. Plass lunge bitene i en 10 mL sprøyte, etterfulgt av stempelet.
- Sug opp fordøyelsen løsningen (5 mL) i sprøyten ved å trekke tilbake på stempelet. Operere stempelet opp og ned til lungene synker i løsningen. Deretter plassere lunge og fordøyelse bufferen i en 50 mL tube.
- Riste røret i 15 min på 37 ° C på en gjensidig shaker (150 rpm). Lungene kan bli fillete under denne inkubasjon.
- Pipetter opp og ned til lungekreft cellene er helt spredt. Riste røret i ytterligere 30 min på 37 ° C på en gjensidig shaker (150 rpm).
- Lungekreft cellene passere en 40 µm celle sil. Nedspinning cellene på 400 x g i 3 minutter.
4. flowcytometri lunge celler
- Oppløse 100 mg av BSA i 10 mL PBS og filtrere gjennom et 0.22 µm sprøyte filter å forberede PBS - 1% BSA.
- Fjern nedbryting av utvalget på trinn 3.6 bruke en pipette og legge 2 mL av røde blodlegemer lysis løsning. Deretter Nedspinning cellene på 400 x g for 3 min. forkaste nedbryting.
- Resuspend cellene i 5 mL av PBS - 1% BSA av pipettering og sentrifuge røret (400 x g, 3 min). Kast nedbryting.
- Gjenta dette trinnet for vask en gang.
- Suspendere celler i 1 mL av PBS - 1% BSA og går gjennom en ny 40 µm celle sil.
- Analysere cellene med en flyt cytometer telle kreftceller (bruker Filteroppsett FL1 for GFP-LLC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungene presenterer mange GFP-LLC celler 2t etter injeksjon (figur 1A). Det bør bemerkes at de fluorescerende stedene også oppdaget i den røde filteret skal ekskluderes fra cellen antall. De aller fleste LLC celler forsvinner fra lungene 24 timer etter injeksjon (figur 1 c).
For å bekrefte antall GFP-LLC i lungene, kan en av flikene brukes for flyt cytometric analyse (figur 2).
Figur 1 : Gjenkjenning av GFP-LLC celler under fluorescens stereo mikroskop. (A) lungene er isolert 2t (A: filteret satt GFPLP, B: filteret satt ET/CY3) eller 24 h (C: filteret satt GFPLP, D: filteret satt ET/CY3) etter injeksjon av 3 x 104 GFP-LLC celler. (C), er en GFP-LLC celle preget av en gul pil. Stedene preget av blå piler er ikke GFP-LLC celler. Skala måleren indikerer 750 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flow cytometri analyse av lungekreft cellene. (A) og (B); Flow cytometric analyse av GFP-LLC celler brukes til halen blodåre injeksjon. Utelate døde celler inneholder cellen suspensjon bufferen propidium iodide (1 µg/mL). (A) viser FSC vs SSC plot og celler i området (C) er utviklet i (B) for å vise FL1 vs FL3 plot. Celler i regionen (D) anses å være GFP-LLC celler. (E) og (F); Dot tomter caudal lobe celler isolert 24 timer etter halen blodåre injeksjon. GFP-LLC cellene er observert i regionen (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbehandling for mus antistoffer, narkotika, en høy-fett diett eller svulst-conditioned medium før svulst celle injeksjon er mulig. Det vanskeligste trinnet i denne analysen er halen blodåre injeksjon. Ufullstendig injeksjon resulterer i ufullstendige data. Hale venen i C57BL/6 er vanskelige å identifisere, gir injeksjoner. Plassere mus på en varmeputen (37 ° C) dilate hjelper hale venen slik at injeksjon blir enklere.
Denne analysen bruker et stort antall (1 x 104 - 1 x 105) kreftceller, som er mye større enn i pasientens blod. En engangs injeksjon av slike et stort antall celler kan gi uønskede reaksjoner fra vert dyr. I den fluorescens stereo mikroskopi teller, kreftceller dypt inne vev er vanskelig å oppdage. I flyt cytometri analyse, er lungene helt fordøyd vil telle kreftceller i lungene. Denne prosessen forårsaker tap av verdifull informasjon om svulsten celleplassering (i eller utenfor blodkaret). Tvert imot, oppdagelsen av kreftceller under AC confocal fluorescens mikroskop kan skille svulst celler i blodkaret fra de andre10.
Fluorescens stereo mikroskopi er en veldig enkel metode. Bruke flowcytometri for å telle kreftceller har ingen kompensering sammenlignet med mikroskopet skanning. Er det mulig å skanne hele lunge deler under AC confocal fluorescens mikroskop; men vil analysen da være arbeidskrevende. Andre typer kreftceller eller stromal celler kan blandes med injisert kreftceller. Co injeksjon av kreft-assosiert celler forbedrer muligheten for metastasering. Svulst metastasering hastigheten er tungt avhengig av svulst celle og dyret brukes.
Som nevnt ovenfor, er det viktigste trinnet i denne protokollen hale blodåre injeksjon. Et nøyaktig antall celler må være injisert med ingen lekkasje, men teknisk vanskelig. Nøye observere håndtering av dyktige forskere kan være til stor hjelp.
En rekke mus modell studier har rapportert at 20% av injisert kreftceller gjennomgikk bloduttredelse, 3% av dem dannet micrometastases og bare 0.02% utviklet seg til konkrete metastatisk knuter2. Ved GFP-LLC celle injeksjon (3 x 104 celler), ble 150-300 GFP-LLC celler oppdaget av flyt cytometri analyse i caudal flik isolert 2t etter injeksjon. Totalt antall GFP-LLC i lungene antas for å være 600-1200, indikerer at 2-4% av injisert cellene var i live. Dette synker i en tidsavhengige måte3,11. De andre cellene antas for å gjennomgå apoptose på grunn av fysiske støtte eller ernæring, eller utelukkelse av immunsystemet. I vår siste data, 24 timer etter injeksjon av GFP-LLC (6 x 104 celler), ble antall GFP-LLC i lungene funnet for å være om 20. Disse resultatene kan påvirkes av musen belastningen, svulst celle og andre faktorer. For eksempel, har det blitt rapportert at antall kreftceller i lungene ble pre metastatisk fase12, eller i genet endret mus13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
