Summary
Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.
Abstract
Para investigar os mecanismos moleculares que regem a metástase do tumor, foram propostos vários ensaios usando o mouse como um animal de modelo. Aqui, demonstramos um ensaio simples para avaliar o extravasamento de células de tumor ou micrometastasis. Neste ensaio, células tumorais foram injetadas na veia da cauda, e após um curto período, os pulmões foram dissecados e digeridos para contar as células de tumor rotulado acumulada. Este ensaio ignora o passo inicial da invasão do tumor primário para os vasos sanguíneos e facilita o estudo dos acontecimentos no órgão distante, onde ocorre a metástase do tumor. O número de células injetadas dentro do vaso sanguíneo pode ser otimizado para observar um número limitado de metástases. Relatou-se que as células do estroma no órgão distante contribuem para metástase. Assim, este ensaio poderia ser uma ferramenta útil para explorar o potenciais terapêuticas drogas ou dispositivos para prevenção de metástases de tumor.
Introduction
Metástase de tumor responsável por elevada mortalidade em doenças relacionadas ao câncer. Do ponto de vista das investigações a nível molecular, a metástase pode ser dividido em várias etapas: iniciação do tumor no local do tumor primário, o crescimento do tumor primário e invasão em vizinhas tecidos, intravasation, circulação através dos vasos sanguíneos , extravasamento em órgãos distantes e re-crescimento do tumor. Cada etapa envolve diferentes conjuntos de moléculas/sinais1.
Estudos até à data têm se preocupado com eventos que ocorrem em órgãos distantes, antes que as células do tumor começam circulando no sangue, o que também é conhecido como a fase pre-metastática2,3,4,5, 6. Nossos estudos de modelo de rato revelaram que a fase pré-metastática facilita a metástase do pulmão através da criação de longa duração e baixo nível de respostas inflamatórias nos pulmões. A fase pré-metastática é caracterizada por hyperpermeability de themicrovasculature, recrutamento de células derivada de medula óssea (BMDC) e upregulation das moléculas cytokine/chemokine-like, incluindo S100A8 e SAA33,4 . Tem sido relatado que lisil oxidase modifica a matriz extracelular nos pulmões para recrutar BMDCs7. Outro relatório revelou a importância da Angpt2, MMP3 e MMP10 na fase pre-metastática8. Em outras palavras, as intricadas interações entre tumores primários da medula óssea e órgãos remotos precisam ser entendido e corretamente modulada (por exemplo, usando drogas que proteínas envolvidas nessas interações de destino) para evitar futura metástase9 . Para regular a fase pré-metastática, deve primeiro ser visualizado e avaliado para intervenções de diagnósticos ou terapêuticas. Aqui, nós relatamos um ensaio de recrutamento de células do tumor pulmonar que permite o estudo da fase pré-metastático nos pulmões.
Células tumorais injetadas diretamente dentro do vaso sanguíneo do mouse são semelhantes aos circulam células tumorais em pacientes com câncer, embora possa haver diferenças entre culturas de células e células tumorais de circulação. Circulantes de células de tumor se se submeter a algumas mudanças características quando entram em circulação do tumor primário. No entanto, culturas de células podem formar tumores em camundongos imunodeficientes quando eles são injetados na veia da cauda. Além disso, no sistema modelo de rato, fluorescência rotulada células tumorais pode ser usada que permitem o acompanhamento destas células no corpo. O comportamento de células tumorais em circulação é fundamental ao determinar as consequências finais em pacientes de câncer10. Sangue não é um bom lugar para a sobrevivência de células de tumor2. Eles precisam escapar do ataque, o sistema imunológico do hospedeiro e precisar de anti-apoptotic sinais para prevenir apoptose devido a falta de suporte físico. Células tumorais com habilidades superiores de iniciação de tumor metastático locais geram mais nódulos de tumor. Se as células do tumor mostram tropismo de órgão específico, metástase deve ser observada nesses órgãos particulares. Neste ensaio, os passos iniciais da cascata metastática (invasão e crescimento do tumor primário) não estão incluídos e, portanto o foco na interação entre circulantes de células tumorais e as células do estroma (células endoteliais, células epiteliais e células do sangue). Em ensaios de injeção convencional tumor celular, pesquisadores precisa esperar até nódulos de tumor crescem para um tamanho de tangível para detectar metástase. Neste caso, não é possível quantificar o número exato de células tumorais no vaso sanguíneo. Além disso, este processo inclui uma fase de rebrota de tumor, indicando que outros fatores nas células de tumor podem afetar o resultado.
Contando rotulado células tumorais sob um microscópio de fluorescência é um processo simples. O microscópio estereoscópico fornece um amplo campo de visão, para que o pulmão inteiro pode ser digitalizado. Citometria de fluxo é também uma ferramenta útil que instantaneamente dá um número exato de células tumorais no tecido. Contar as células fluorescentes no tecido com um microscópio confocal é igualmente possível e exibe as imagens mais precisas das células do tumor metastático, mas é demorado e pode dar resultados tendenciosos se apenas uma área selecionada é contabilizada. O objetivo deste teste é observar como facilmente as células do tumor se acumular nos pulmões. Como relatado anteriormente3,4, se os pulmões estão em fase pré-metastático devido a sinalização inflamatória do tumor primário, as células do tumor injetado são propensas a se acumular nos pulmões, implicando, portanto, maiores chances de metástase pulmonar. Outras doenças (artrite reumatoide, asma, etc.) e o seu tratamento com agentes anti-inflamatórios (como o anti-TNFa) podem atenuar metástase pulmonar. Assim, podemos concluir que este ensaio é uma ferramenta poderosa para avaliar a possibilidade de metástase pulmonar.
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Protocol
Todos os procedimentos realizados com ratos foram aprovados pela Universidade de medicina Animal pesquisa Comitê de Tóquio feminino.
1. cauda veia injeção de células de Carcinoma (LLC) pulmão de Lewis
- Manter as células LLC em DMEM suplementado com 10% de FCS, em um 5% umidificado incubadora de CO2 a 37 ° C. Células devem conter um sistema de expressão de proteína fluorescente (por exemplo, as boas práticas agrícolas).
- Remova células da placa de cultura, usando um reagente de dissociação de célula não enzimáticos. Siga o protocolo do fabricante.
- Recolha pilhas em um tubo de 15 mL e centrifugar a 400 x g por 3 min. Ressuspender as células em 5 mL de PBS pipetando e centrifugar o tubo (400 x g, 3 min). Em seguida, remova o sobrenadante.
- Repita essa etapa de lavagem mais uma vez.
- Após a segunda lavagem, passar as células através de um filtro de célula (tamanho de poro de 40 µm) e ressuspender em PBS para dar uma densidade celular final de 1 x 106 células/mL.
- Injete 0,1 mL da suspensão de células (1 x 105 células, agulha 29g) em cada rato C57BL/6 (machos de 8 a 10 semanas) através da veia da cauda.
2. isolamento dos pulmões e contando as células sob um microscópio de fluorescência
- Eutanásia por inalação de CO2 em ratos.
- Retire a pele na superfície ventral do peito com uma tesoura. Em seguida, corte as costelas e o diafragma para expor a cavidade torácica. Irrigue o PBS (100 cmH2O, total 15 mL) através do ventrículo direito com uma agulha de 25 G de infusão alado e tubulação.
- Corte o coração e o timo. Pega a traqueia com fórceps e puxe, dissecando os tecidos conectivos ao redor da traqueia com uma tesoura. Dissecar para fora dos pulmões e lavá-los em PBS.
- Separe cada lóbulo e observá-lo sob um microscópio de fluorescência.
3. pulmão digestão
- Dissolva 10 mg de colagenase, 10 mg de dispase e 10 µ g de DNase em 10 mL de DMEM isento de soro. Filtrar com um filtro de seringa de 0,22 µm para preparar a solução de digestão enzimática.
- Corte o lóbulo caudal isolado com uma tesoura. Coloque os pedaços de pulmão em uma seringa de 10 mL, seguida-se o êmbolo.
- Aspire a solução de digestão (5 mL) para a seringa puxando o êmbolo para trás. Opere o êmbolo subir e descer até o pulmão afunda-se na solução. Em seguida, coloque o buffer pulmão e digestão em um tubo de 50 mL.
- Agite o tubo durante 15 minutos a 37 ° C num agitador recíproco (150 rpm). Os pulmões podem tornar-se esfarrapado durante esta incubação.
- Pipete acima e para baixo até que as células do pulmão são completamente dispersos. Agite o tubo para adicional 30 min a 37 ° C num agitador recíproco (150 rpm).
- Passe as células de pulmão através de um filtro de célula 40 µm. Gire para baixo as células a 400 x g, durante 3 min.
4. fluxo Cytometry de pulmão de células
- Dissolva 100 mg de BSA em 10 mL de PBS e filtrar através de um filtro de seringa 0,22 µm para preparar PBS - 1% de BSA.
- Remover o sobrenadante da amostra obtida no passo 3.6 usando uma pipeta e adicionar 2 mL de solução de lise de células vermelhas do sangue. Em seguida, spin-down as células a 400 x g, durante 3 min. descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 5 mL de PBS - 1% de BSA pipetando e centrifugar o tubo (400 x g, 3 min). Desprezar o sobrenadante.
- Repita essa etapa de lavagem mais uma vez.
- Suspender as células em 1 mL de PBS - 1% de BSA e passar através de um novo filtro de célula de 40 µm.
- Analise as células com um citômetro de fluxo para contar as células de tumor (usando a configuração de filtro FL1 para GFP-LLC).
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Representative Results
Os pulmões apresentam muitas células GFP-LLC 2 h após a injeção (figura 1A). Note-se que as manchas fluorescentes também detectadas no filtro vermelho devem ser excluídas a contagem do número de células. A grande maioria das células LLC desaparece dos pulmões 24 h após a injeção (Figura 1).
Para confirmar o número do GFP-LLC nos pulmões, um dos lóbulos pode ser usado para análise de fluxo cytometric (Figura 2).
Figura 1 : Deteção de GFP-LLC células sob um microscópio de fluorescência estéreo. (A) os pulmões são isolado 2h (r: filtro definido GFPLP, b: filtro definido ET/CY3) ou 24h (GFPLP de conjunto de filtros de c:, d: filtro definido ET/CY3) após a injeção de células de 3 x 104 GFP-LLC. Em (C), uma célula de GFP-LLC é marcada por uma seta amarela. Os pontos marcados por setas azuis não são células GFP-LLC. Barra de escala indica 750 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Flow cytometry análise de células pulmonares. (A) e (B); Análise de fluxo cytometric de células GFP-LLC, utilizados para injeção de veia da cauda. Para excluir as células mortas do buffer de suspensão celular continha iodeto de propidium (1 µ g/mL). (A) mostra a FSC vs CCD trama e células na região de (C) são desenvolvidos em (B) para mostrar FL1 vs FL3 enredo. As células da região (D) são consideradas células GFP-LLC. (E) e (F); Lotes do ponto do lóbulo caudal células isoladas 24 h após a injeção de veia de cauda. As células GFP-LLC são observadas na região (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pré-tratamento de ratos com anticorpos, drogas, uma dieta high-fat ou tumor-condicionado médio antes da injeção de células de tumor é possível. O passo mais difícil neste ensaio é a injeção de veia de cauda. Injeção incompleta resulta em dados inconclusivos. A veia da cauda em C57BL/6 é particularmente difícil de identificar, resultando em falhadas injeções. Colocando o rato sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C) ajuda a dilata a veia da cauda para que a injeção se torna mais fácil.
Este ensaio utiliza um grande número de (1 x 104 - 1 x 105) células de tumor, que é muito maior do que o observado no sangue do paciente. Uma única injeção de um grande número das células pode provocar respostas indesejadas de animais o anfitrião. Na estéreo microscopia de fluorescência contando, células tumorais no fundo do tecido são difíceis de detectar. Na análise de citometria de fluxo, os pulmões são completamente digeridos para contar as células de tumor nos pulmões. Este processo provoca a perda de informações valiosas sobre a localização do celular do tumor (dentro ou fora do vaso sanguíneo). Pelo contrário, deteção de células de tumor em um microscópio de fluorescência confocal permite o distintivo tumor de células no vaso sanguíneo dos outros10.
Microscopia de fluorescência estéreo é um método muito simples. Usando citometria de fluxo para contar as células de tumor não tem nenhum viés em comparação com o microscópio de varredura. É possível digitalizar secções de pulmão inteiro sob um microscópio de fluorescência confocal; no entanto, o ensaio será trabalhoso. Outros tipos de células tumorais ou células do estroma podem ser misturados com as células do tumor injetado. Co injeção de células de câncer associada aumenta a possibilidade de metástase. A taxa de metástase de tumor depende fortemente do tipo de célula do tumor e o animal utilizado.
Como mencionado acima, o passo mais crítico neste protocolo é a injeção de veia de cauda. Um número exato de células precisa ser injetado com nenhum escapamento, mas é tecnicamente difícil. Observando cuidadosamente que a manipulação por pesquisadores qualificados pode ser de grande ajuda.
Uma série de estudos do modelo de rato relataram que 20% das células injetadas tumor passou por extravasamento, 3% deles formado micrometastases e transformou-se apenas 0,02% de nódulos metastáticos tangível2. Em caso de injeção de células GFP-LLC (3 x 104 células), as células GFP-LLC de 150-300 foram detectadas pela análise de citometria de fluxo no lóbulo caudal isolado 2 h após a injeção. O número total de GFP-LLC nos pulmões é considerado 600-1.200, indicando que o 2-4% das células injetadas permaneceram vivo. Essa proporção diminui em uma maneira tempo-dependente3,11. As outras células são assumidas como sofrem apoptose devido à falta de suporte físico ou nutrição, ou devido à exclusão pelo sistema imunológico. Em nossos dados recentes, 24h após a injeção do GFP-LLC (6 x 104 células), o número de GFP-LLC nos pulmões foi encontrado para ser aproximadamente 20. Estes resultados podem ser afetados por outros fatores, célula de tumor e a cepa de rato. Por exemplo, tem sido relatado que o número das células do tumor nos pulmões foi elevado na fase pré-metastático12ou no gene modificado ratos13,14.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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