Summary
Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.
Abstract
Para investigar los mecanismos moleculares que rigen la metástasis del tumor, se han propuesto varias pruebas utilizando el ratón como un animal modelo. Aquí, demostramos un simple ensayo para evaluar extravasación de células tumorales o micrometástasis. En este ensayo, las células del tumor fueron inyectadas en la vena de la cola, y después de un corto período, los pulmones fueron disecados y digeridos para contar las células tumorales marcadas acumulada. Este análisis omite el paso inicial de la invasión del tumor primario en el vaso sanguíneo y facilita el estudio de los acontecimientos en el lejano órgano donde se produce la metástasis del tumor. El número de células que inyecta en los vasos sanguíneos puede ser optimizado para observar un número limitado de metástasis. Se ha reportado que las células estromales en el órgano distante contribuyen a la metástasis. Así, este análisis podrían ser una herramienta útil para explorar potenciales medicamentos o dispositivos para la prevención de metástasis del tumor.
Introduction
Metástasis del tumor responsable de alta mortalidad en enfermedades relacionadas con el cáncer. Desde el punto de vista de las investigaciones a nivel molecular, la metástasis se puede dividir en varios pasos: iniciación del tumor en el sitio del tumor primario, el crecimiento del tumor primario e invasión en alrededor de los tejidos, intravasación, circulación a través de los vasos sanguíneos , extravasación en órganos distantes y re-crecimiento del tumor. Cada paso implica diferentes conjuntos de moléculas/señales1.
Estudios hasta la fecha han estado preocupados con los eventos que ocurren en órganos distantes antes las células tumorales circulantes en la sangre, que también es conocida como la fase pre-metastásica2,3,4,5, 6. Nuestros estudios con ratones modelo revelaron que la fase pre-metastásica facilita la metástasis del pulmón mediante la creación de larga duración y bajo nivel de las respuestas inflamatorias en los pulmones. La fase pre-metastásica se caracteriza por hiperpermeabilidad de themicrovasculature y reclutamiento de células de la médula ósea derivada (BMDC), upregulation de citoquinas/quimioquinas-como moléculas incluyendo S100A8 y SAA33,4 . Se ha divulgado que esa lisil oxidasa modifica la matriz extracelular en los pulmones para reclutar BMDCs7. Otro informe ha revelado la importancia de Angpt2, MMP3 y MMP10 en la fase pre-metastásica8. En otras palabras, las intrincadas interacciones entre tumores primarios, médula ósea y órganos remotos necesitan ser comprendidos y modulada correctamente (por ejemplo, mediante el uso de fármacos que atacan las proteínas implicadas en estas interacciones) para evitar futuras metástasis9 . Para regular la fase pre-metastásica, debe primero visualizar y evaluar las intervenciones diagnósticas o terapéuticas. Aquí, Divulgamos un ensayo de reclutamiento de células de tumor de pulmón que permite el estudio de la fase pre-metastásico en los pulmones.
Las células del tumor inyectadas directamente en el vaso sanguíneo del ratón son similares a circulación las células del tumor en pacientes con cáncer, aunque puede haber diferencias entre las células cultivadas y células tumorales circulantes. Células tumorales circulantes se experimentan algunos cambios característicos cuando entran en circulación desde el tumor primario. Sin embargo, las células cultivadas pueden formar tumores en ratones inmunodeficientes cuando se inyectan en la vena de la cola. Además, en el sistema de modelo de ratón, fluorescencia marcada de las células del tumor puede utilizarse que permiten el seguimiento de estas células en el cuerpo. El comportamiento de las células tumorales en circulación es fundamental ya que determinan las consecuencias finales en cáncer pacientes10. Sangre no es un buen lugar para la supervivencia de las células de tumor2. Que necesitan para escapar del ataque por el sistema de inmune del huésped y necesita señales anti-apoptosis para evitar la apoptosis debido a la falta de soporte físico. Las células del tumor con mayores habilidades de iniciación de tumor en sitios metastáticos generan más nódulos del tumor. Si las células tumorales muestran tropismo de órgano específico, se deben observar metástasis en los órganos particulares. En este ensayo, los pasos iniciales de la cascada metastásica (crecimiento del tumor primario y la invasión) no están incluidos, y por lo tanto el foco está en la interacción entre la circulación de las células tumorales y las células del estroma (células endoteliales, células epiteliales y células de la sangre). En estudios de inyección de células de tumor convencional, los investigadores tienen que esperar hasta que los nódulos del tumor crecen hasta un tamaño tangible para detectar la metástasis. En este caso, no se puede cuantificar el número exacto de las células tumorales en los vasos sanguíneos. Además, este proceso incluye una fase de rebrote del tumor, indicando que otros factores en las células del tumor pueden afectar el resultado.
Conteo de las células del tumor bajo un estereomicroscopio de fluorescencia de etiquetado es un proceso simple. El estereomicroscopio proporciona un amplio campo de visión que puede analizarse el pulmón entero. Citometría de flujo es también una herramienta útil que al instante le da un número exacto de las células tumorales en el tejido. Conteo de células fluorescentes en el tejido bajo un microscopio confocal, es posible y muestra las imágenes más precisas de las células del tumor metastásico, pero requiere tiempo y puede dar resultados sesgados si sólo se cuenta un área seleccionada. El objetivo final de este ensayo es observar cómo fácilmente se acumulan las células del tumor en los pulmones. Como se informó anteriormente de3,4, si los pulmones están en fase de pre-metastásico debido a la señalización inflamatoria del tumor primario, las células tumorales inyectadas son propensas a acumular en los pulmones, por lo tanto, lo que implica mayor probabilidad de metástasis del pulmón. Otras condiciones (artritis reumatoide, asma, etc.) y su tratamiento con agentes antiinflamatorios (como anti-TNFα) pueden atenuar la metástasis del pulmón. Por lo tanto, concluimos que este análisis es una poderosa herramienta para evaluar la posibilidad de metástasis del pulmón.
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Protocol
Todos los procedimientos realizados con ratones fueron aprobados por la Universidad de medicina Animal investigación Comité de Tokio de las mujeres.
1 inyección en la vena cola de pulmón de Lewis (LLC) células
- Mantener las células de la LLC en DMEM suplementado con 10% FCS, en humidificado 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Células deben contener un sistema de expresión de la proteína fluorescente (p. ej., GFP).
- Eliminar las células de la placa de cultivo mediante el uso de un reactivo de disociación no enzimática de la célula. Seguir el protocolo del fabricante.
- Recoger las células en un tubo de 15 mL y centrifugar a 400 x g por 3 minutos resuspender las células en 5 mL de PBS por pipeteo y centrifugue el tubo (400 g de x, 3 min). A continuación, eliminar el sobrenadante.
- Repita este paso de lavado una vez más.
- Después del segundo lavado, pasar las células a través de un tamiz celular (tamaño de poro de 40 μm) y resuspender en PBS a una densidad celular final de 1 x 106 células/mL.
- Inyectar 0.1 mL de la suspensión celular (1 x 105 células, aguja 29 G) en cada ratón C57BL/6 (varones 8-10 semanas de edad) a través de la vena de la cola.
2. aislamiento de los pulmones y contar las células bajo un estereomicroscopio de fluorescencia
- Eutanasia a los ratones por la inhalación de CO2 .
- Retirar la piel en la cara ventral del tórax con tijeras. Luego, corte las costillas y el diafragma para exponer la cavidad torácica. Ras PBS (100 cmH2O, total 15 mL) a través del ventrículo derecho con una aguja de 25 G de infusión alado y tubería.
- Cortar el corazón y el timo. Agarre la tráquea con el fórceps y tire hacia arriba, los tejidos conectivos alrededor de tráquea de disección con tijeras. Diseccionar a los pulmones y lavar en PBS.
- Separe cada lóbulo y observar bajo un estereomicroscopio de fluorescencia.
3. pulmón digestión
- Disolver 10 mg de colagenasa, 10 mg de dispase y 10 μg de DNasa en 10 mL de DMEM libre de suero. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 μm para preparar la solución de digestión enzimática.
- Dados el lóbulo caudal aislado con unas tijeras. Coloque los pedazos de pulmón en una jeringa de 10 mL, seguida por el émbolo.
- Aspirar la solución de digestión (5 mL) en la jeringuilla tirando del émbolo. Funcionar el émbolo hacia arriba y hacia abajo hasta que el pulmón se hunde en la solución. Luego, coloque el buffer de digestión y pulmón en un tubo de 50 mL.
- Agitar el tubo durante 15 min a 37 ° C en un agitador recíproco (150 rpm). Los pulmones pueden ser rota durante la incubación.
- Pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que las células del pulmón se dispersan totalmente. Agite el tubo adicional 30 min a 37 ° C en un agitador recíproco (150 rpm).
- Pasar las células pulmonares a través de un tamiz de célula 40 μm. Desactivación de las células a 400 x g durante 3 minutos.
4. flujo Cytometry de pulmón de células
- Disolver 100 mg de BSA en 10 mL de PBS y el filtro a través de un filtro de jeringa 0,22 μm prepararse PBS - 1% de BSA.
- Retire el sobrenadante de la muestra obtenida en el paso 3.6 con una pipeta y añadir 2 mL de solución de lisis de glóbulos rojos. Entonces, giro de las células a 400 x g durante 3 min descarte el sobrenadante.
- Resuspender las células en 5 mL de PBS - 1% de BSA mediante pipeteo y centrifugue el tubo (400 g de x, 3 min). Deseche el sobrenadante.
- Repita este paso de lavado una vez más.
- Suspender las células en 1 mL de PBS - 1% de BSA y pasar por un colador de celular nuevo de 40 μm.
- Analizar las células con un citómetro de flujo para contar las células tumorales (usando filtro instalación FL1 de GFP-LLC).
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Representative Results
Los pulmones presentan muchas células GFP-LLC 2 h después de la inyección (figura 1A). Cabe señalar que los puntos fluorescentes también detectados en el filtro rojo deben ser excluidos de la cuenta del número de celular. La gran mayoría de las células LLC desaparece de los pulmones 24 h después de la inyección (figura 1).
Para confirmar el número de la GFP-LLC en los pulmones, uno de los lóbulos puede utilizarse para el análisis cytometric del flujo (figura 2).
Figura 1 : Detección de GFP-LLC las células bajo un microscopio de fluorescencia estéreo. (A) los pulmones son 2 h aislado (A: filtro establecido GFPLP, B: filtro establecido ET/CY3) o 24 h (C: filtro establecido GFPLP, D: filtro establecido ET/CY3) después de la inyección de células de 3 x 104 GFP-LLC. En (C), una célula GFP-LLC está marcada por una flecha amarilla. Los puntos marcados por flechas azules no son células GFP-LLC. Barra de escala indica 750 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Flujo cytometry análisis de las células del pulmón. (A) y (B); Análisis cytometric del flujo de células GFP-LLC utilizada para la inyección de la vena de la cola. Excluir las células muertas el buffer de suspensión celular contiene yoduro de propidio (1 μg/mL). (A) muestra la trama de FSC y SSC y células en la región de (C) se desarrollan en (B) para mostrar FL1 vs FL3 parcela. Las células de la región (D) se consideran las células GFP-LLC. (E) y (F); Diagramas de punto de las células del lóbulo caudal aislaron 24 h después de la inyección de la vena de la cola. Las células de la LLC de GFP se observan en la región (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pretratamiento de ratones con anticuerpos, medicamentos, una dieta alta en grasas o medio condicionado por el tumor antes de la inyección de células de tumor es posible. El paso más difícil en este análisis es la inyección de la vena de la cola. Inyección incompleta da lugar a datos no concluyentes. La vena de la cola en C57BL/6 es particularmente difícil de identificar, dando por resultado las inyecciones fallidas. Colocando el ratón sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) ayuda a dilatar la vena de la cola para que la inyección se hace más fácil.
Este ensayo utiliza un gran número de (1 x 104 - 1 x 105) las células del tumor, que es mucho mayor que el observado en la sangre del paciente. Una inyección única de un gran número de las células puede lograr respuestas no deseadas de los animales de acogida. En el estéreo microscopía de fluorescencia contando, las células del tumor profundo dentro del tejido son difíciles de detectar. En el análisis de citometría de flujo, los pulmones son completamente digeridos para contar las células del tumor en los pulmones. Este proceso provoca pérdida de información valiosa sobre la localización de la célula del tumor (dentro o fuera de los vasos sanguíneos). Por el contrario, la detección de células del tumor bajo un microscopio de fluorescencia confocal permite el tumor distintivo de las células en los vasos sanguíneos de los otros10.
Estéreo de microscopía de fluorescencia es un método muy sencillo. Mediante citometría de flujo para contar las células tumorales no tiene ningún sesgo en comparación con el microscopio de la exploración. Es posible analizar las secciones del pulmón entero bajo un microscopio de fluorescencia confocal; sin embargo, el ensayo será laborioso. Otros tipos de células tumorales o células stromal pueden ser mezclados con las células del tumor inyectado. La inyección de las células asociadas con el cáncer aumenta la posibilidad de metástasis. La tasa de metástasis de tumor depende fuertemente del tipo de la célula tumoral y el animal utilizado.
Como se mencionó anteriormente, el paso más crítico en este protocolo es la inyección de la vena de la cola. Un número exacto de las células tiene que ser inyectado con ninguna salida, pero es técnicamente difícil. Observando cuidadosamente el manejo por expertos investigadores puede ser de gran ayuda.
Una serie de estudios con ratones modelo han informado que 20% de las células tumorales inyectadas sufrió extravasación, 3% de ellos formó micrometástasis, y sólo el 0.02% convertido en nódulos metastáticos tangible2. En caso de inyección de células de LLC de GFP (3 x 104 células), las células GFP-LLC de 150-300 fueron detectadas por análisis de citometría de flujo en el lóbulo caudal aislado 2 h después de la inyección. El número total de GFP-LLC en los pulmones se supone que 600-1.200, indicando que 2-4% de las células inyectadas seguía vivo. Esta proporción disminuye en una manera dependiente del tiempo3,11. Las otras células se supone que sufren apoptosis debido a la falta de soporte físico o nutricional, o debido a la exclusión por el sistema inmune. Datos recientes, 24 h después de la inyección de GFP-LLC (6 x 104 células), el número de GFP-LLC en los pulmones fue encontrado para ser cerca de 20. Estos resultados pueden verse afectados por la cepa de ratón, células tumorales y otros factores. Por ejemplo, se ha divulgado que el número de las células del tumor en los pulmones fue elevado en la fase pre-metastásico12o en gen modificado ratones13,14.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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