Summary
ويصف هذه المخطوطة طريقة لقياس تراكم خلية ورم في الرئتين في نموذج حيوان من ورم خبيث.
Abstract
للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تحكم ورم خبيث، وقد اقترحت فحوصات مختلفة باستخدام الماوس كحيوان نموذج. هنا، علينا أن نظهر مقايسة بسيطة لتقييم التسرب خلية ورم أو ميكروميتاستاسيس. في هذا التحليل، تم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد الذيل، وبعد فترة قصيرة، تم تشريح الرئتين وهضمها لعد الخلايا الورم المسمى المتراكمة. هذا التحليل تخطي الخطوة الأولى في غزو الورم الرئيسي في الأوعية الدموية ويسهل دراسة الأحداث التي وقعت في الجهة البعيدة حيث يحدث ورم خبيث. عدد الخلايا التي تحقن في الأوعية الدموية يمكن أن يكون الأمثل لمراقبة عدد محدود من الانبثاث. وأفيد أن الخلايا اللحمية في الجهاز البعيد الذي يسهم في ورم خبيث. وهكذا، يمكن أن يكون هذا التحليل هو أداة مفيدة لاستكشاف الأدوية العلاجية المحتملة، أو أجهزة لمنع ورم خبيث.
Introduction
ورم خبيث حسابات لارتفاع معدل الوفيات في أمراض السرطان. ومن وجهة نظر التحقيقات على المستوى الجزيئي، ورم خبيث يمكن تقسيمها إلى خطوات متعددة: بدء الورم على موقع الورم الرئيسي، ونمو الورم الرئيسي والاجتياح المحيطة بالانسجة، إينترافاسيشن، والتداول عن طريق الأوعية الدموية ، التسرب على الأجهزة البعيدة، وإعادة نمو الورم. كل خطوة تنطوي على مجموعات مختلفة من إشارات الجزيئات/1.
تعني الدراسات حتى الآن بالأحداث التي تحدث في الأجهزة البعيدة قبل أن تبدأ الخلايا السرطانية تنتشر في الدم، والذي يعرف أيضا المرحلة ما قبل المنتشر2،3،4،5، 6. كشفت دراسات نموذجية الماوس لدينا أن ييسر مرحلة ما قبل المنتشر الرئة ورم خبيث بإنشاء استجابات التهابية طويلة الأمد وذات المستوى المنخفض في الرئتين. مرحلة ما قبل المنتشر يتميز هايبربيرميبيليتي ثيميكروفاسكولاتوري، وتجنيد خلايا نخاع العظام المشتقة (بمدك)، و upregulation من جزيئات سيتوكين/تشيموكيني-مثل بما في ذلك3،S100A8 و SAA34 . وقد أبلغ أوكسيديز lysyl أن يعدل المصفوفة خارج الخلية في الرئتين إلى تجنيد بمدكس7. وقد كشف تقرير آخر أهمية Angpt2 و MMP3 MMP10 في مرحلة ما قبل المنتشر8. وبعبارة أخرى، التفاعلات المعقدة بين الأورام الأولية ونخاع العظام والأجهزة البعيدة بحاجة إلى تفهم والتضمين بشكل صحيح (على سبيل المثال، باستخدام العقاقير التي تستهدف البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات) لمنع ورم خبيث المستقبل9 . لتنظيم مرحلة ما قبل المنتشر، ينبغي أولاً أن تصور وتقييم تدخلات تشخيصية أو علاجية. هنا، نحن تقرير الرئة ورم توظيف خلية مقايسة التي تمكن هذه الدراسة مرحلة ما قبل المنتشر في الرئتين.
ورم الخلايا تحقن مباشرة في الأوعية الدموية للماوس مشابهة لتعميم خلايا الورم في مرضى السرطان، رغم أنه قد تكون هناك اختلافات بين الخلايا المزروعة وتعميم الخلايا السرطانية. تعميم خلايا الورم أنفسهم الخضوع لبعض التغييرات المميزة عند دخول الدورة الدموية من الورم الرئيسي. ومع ذلك، يمكن أن تشكل الخلايا المزروعة الأورام في الفئران العوز عند أنها يتم حقنها في الوريد الذيل. بالإضافة إلى ذلك، في النظام النموذجي الماوس، الأسفار المسماة الخلايا السرطانية يمكن استخدامها التي تسمح لتعقب هذه الخلايا في الجسم. سلوك الخلايا السرطانية بتعميم أمر بالغ الأهمية كما أنها تحدد النتائج في نهاية المطاف في مرضى السرطان10. الدم ليس مكاناً جيدا للبقاء على قيد الحياة من ورم الخلايا2. أنهم بحاجة للهروب من الهجوم عن طريق المضيف المناعي وتحتاج إلى إشارات apoptotic المضادة لمنع المبرمج بسبب الافتقار إلى الدعم المادي. توليد الخلايا السرطانية مع قدرات أعلى من بدء الورم في مواقع المنتشر أكثر ورم العقيدات. إذا كان إظهار الخلايا السرطانية انتحاء جهاز معين، ينبغي التقيد بورم خبيث في تلك الأجهزة معينة. في هذا التحليل، لا يتم تضمين الخطوات الأولية لتتالي المنتشر (نمو الورم الرئيسي والغزو)، وحتى يتم التركيز على التفاعل بين تعميم الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية (خلايا بطانية والخلايا الظهارية، وخلايا الدم). في فحوصات حقن خلية الورم التقليدية، الباحثين يجب أن تنتظر حتى ينمو الورم العقيدات لحجم ملموسة للكشف عن ورم خبيث. وفي هذه الحالة، لا يمكن تحديده كمياً العدد الدقيق للخلايا السرطانية في الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن هذه العملية مرحلة نمو ورم، مما يشير إلى أن عوامل أخرى في الخلايا السرطانية قد تؤثر على النتيجة.
عد تسمية الخلايا السرطانية تحت ستيريوميكروسكوبي fluorescence عملية بسيطة. ستيريوميكروسكوبي يوفر مجال رؤية واسع حيث يمكن تفحص الرئة كاملة. التدفق الخلوي هو أيضا أداة مفيدة أن يعطي على الفور دقة عدد الخلايا السرطانية في الأنسجة. عد الخلايا الفلورسنت في الأنسجة تحت مجهر [كنفوكل] من الممكن أيضا وعرض الصور الأكثر دقة لخلايا الورم المنتشر ولكن أنها تستغرق وقتاً طويلاً وقد تعطي نتائج متحيزة إلا إذا كان يتم احتساب مساحة محددة. والهدف النهائي لهذا التحليل مراقبة مدى سهولة تتراكم الخلايا السرطانية في الرئتين. كما ذكرت سابقا4من3،، في حالة الرئتين في المرحلة ما قبل المنتشر بسبب إشارات تحريضية من الورم الرئيسي، الورم حقن الخلايا المعرضة لتتراكم في الرئتين، مما يعني ضمناً فرص أكبر لورم خبيث في الرئة. قد تخفف من الشروط الأخرى (التهاب المفاصل، الربو، إلخ)، ومعاملتهم بالعوامل المضادة للالتهابات (مثل مكافحة-TNFα) ورم خبيث في الرئة. وهكذا نخلص إلى أن هذا التحليل أداة قوية لتقييم إمكانية الرئة ورم خبيث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافق جميع إجراءات تنفيذها مع الفئران "الحيوان البحوث لجنة طوكيو النساء" للجامعة الطبية.
1. ذيل حقن الوريد للخلايا (LLC) سرطان الرئة لويس
- الحفاظ على الخلايا LLC في دميم تكملها FCS 10%، في 5% هوميديفيد CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية. ينبغي أن تحتوي على خلايا نظام تعبير بروتين فلوري (مثل التجارة والنقل).
- إزالة خلايا من صحن الثقافة باستخدام كاشف تفكك خلية غير الأنزيمي. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- جمع الخلايا في أنبوب 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في ز 400 x دقيقة 3 ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني بيبيتينج، والطرد المركزي الأنبوب (400 x ز، 3 دقيقة). ثم، قم بإزالة المادة طافية.
- كرر هذه الخطوة الغسيل مرة أخرى.
- بعد الغسيل الثاني، تمر الخلايا عبر مصفاة خلية (40 حجم المسام ميكرومتر)، وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني لإعطاء كثافة خلية نهائية 1 × 106 خلايا/مل.
- حقن 0.1 مل تعليق خلية (1 × 105 خلايا، إبرة ز 29) في كل الماوس C57BL/6 (8-10 الأسبوع القديمة الذكور) عن طريق الوريد الذيل.
2-عزل الرئتين وعد الخلايا تحت ستيريوميكروسكوبي Fluorescence
- Euthanize الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 .
- قم بإزالة الجلد على السطح البطني للصدر مع المقص. ثم قطع الأضلاع والحجاب الحاجز لفضح تجويف الصدر. مسح برنامج تلفزيوني (غروهارلم 1002س من مجموع 15 مل) عن طريق البطين الأيمن بضخ مجنحة ز 25 إبرة وأنابيب.
- قطع القلب والغدة الصعترية. قبضة القصبة الهوائية بالملقط، وسحب ما يصل، تشريح الأنسجة الضامة حول القصبة الهوائية مع المقص. تشريح خارج الرئتين وغسلها في برنامج تلفزيوني.
- فصل كل الفص والاحتفال به تحت ستيريوميكروسكوبي الأسفار.
3-الرئة الهضم
- حل 10 ملغ كولاجيناز و 10 مغ من ديسباسي 10 ميكروغرام من الدناز في 10 مل دميم خالية من المصل. التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر لإعداد الحل الهضم الأنزيمي.
- الزهر الفص والذيلية معزولة مع المقص. ضع قطعة الرئة في حقنه 10 مل، تليها المكبس.
- نضح الحل الهضم (5 مل) في المحاقن بالانسحاب على المكبس. تعمل المكبس صعودا ونزولاً حتى الرئة المصارف في الحل. ثم، ضع المخزن المؤقت الرئة والهضم في أنبوب 50 مل.
- هز الأنبوب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر المعاملة بالمثل (150 لفة في الدقيقة). قد تصبح الرئتين المتعثرة خلال هذه الحضانة.
- "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حتى خلايا الرئة منتشرة تماما. هز الأنبوب مدة 30 دقيقة إضافية في 37 درجة مئوية على شاكر المعاملة بالمثل (150 لفة في الدقيقة).
- تمر خلايا الرئة عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 400 غرام x لمدة 3 دقائق.
4-التدفق الخلوي لخلايا الرئة
- حل 100 مغ من جيش صرب البوسنة في 10 مل من برنامج تلفزيوني وتصفية من خلال مرشح حقنه 0.22 ميكرومتر بإعداد برنامج تلفزيوني-1% "جيش صرب البوسنة".
- إزالة المادة طافية العينة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6 استخدام ماصة وإضافة 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء. ثم، زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 400 غرام x للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من "جيش صرب البوسنة" PBS-1% من بيبيتينج، والطرد المركزي الأنبوب (400 x ز، 3 دقيقة). تجاهل المادة طافية.
- كرر هذه الخطوة الغسيل مرة أخرى.
- تعليق الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني-1% "جيش صرب البوسنة"، وتمر عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر جديدة.
- تحليل الخلايا مع سيتوميتير تدفق لعد الخلايا السرطانية (باستخدام عامل تصفية الإعداد FL1 للتجارة والنقل-شركة ذات مسؤولية محدودة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرئتين يقدم العديد من الخلايا بروتينات فلورية خضراء-ذ ح 2 بعد الحقن (الشكل 1A). تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي استبعاد البقع الفلورسنت اكتشفت أيضا في تصفية الحمراء من العد رقم الخلية. الغالبية العظمى من الخلايا LLC تختفي من الرئتين 24 ساعة بعد الحقن (الشكل 1).
تأكيد العدد من بروتينات فلورية خضراء-تراخيص المشروبات الكحولية في الرئتين، واحدة من الفصوص يمكن استخدامها لتحليل تدفق سيتوميتريك (الشكل 2).
الشكل 1 : الكشف عن بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة الخلايا تحت مجهر ستيريو fluorescence. (أ) الرئتين معزولة ح 2 (تعيين عامل التصفية ج: جفبلب، تعيين عامل التصفية ب: ET/CY3) أو ح 24 (تعيين عامل التصفية c: جفبلب، تعيين عامل تصفية d: ET/CY3) بعد حقن الخلايا 3 × 104 بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة. في (ج)، يتسم خلية بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية محدودة سهم أصفر. أن البقع التي تميزت بالأسهم الزرقاء ليست الخلايا بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة. شريط مقياس يشير إلى 750 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تدفق التحليل الخلوي لخلايا الرئة. (أ) و (ب)؛ سيتوميتريك تحليل لتدفق التجارة والنقل-شركة الخلايا المستخدمة لحقن الوريد الذيل. لاستبعاد الخلايا الميتة الوارد المخزن المؤقت تعليق خلية يوديد propidium (1 ميكروغرام/مل). (أ) يظهر توضع لجنة المحفل الدائمة مقابل الأرض التعاون بين بلدان الجنوب، والخلايا في المنطقة (ج) في (ب) لإظهار FL1 مقابل FL3 الأرض. تعتبر الخلايا في المنطقة (د) أن تكون الخلايا بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة. (ﻫ) و (و)؛ قطع نقطة من خلايا الفص والذيلية معزولة ح 24 بعد حقن الوريد الذيل. ولوحظت الخلايا بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة في المنطقة (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من الممكن معالجة مسبقة للفئران مع الأجسام المضادة، والأدوية، وحمية عالية الدهون أو مكيفة ورم المتوسطة قبل حقن الخلايا السرطانية. والخطوة الأكثر صعوبة في هذا التحليل هو حقن الوريد الذيل. نتائج الحقن غير مكتملة في البيانات غير حاسمة. على المنوال الذيل في C57BL/6 الصعوبة بمكان تحديد، أدى إلى فشل الحقن. وضع الفئران على وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) يساعد على تمدد الوريد الذيل حيث أن الحقن يصبح أسهل.
يستخدم هذا التحليل خلايا السرطانية (1 × 104 -1 × 105) عدد كبير، وهو أكبر بكثير من التي لوحظت في دم المريض. حقنه مرة واحدة من عدد كبير من الخلايا يمكن أن تسفر عن الاستجابات غير المرغوب فيها من الحيوانات المضيف. الأسفار ستيريو مجهرية العد، ورم الخلايا العميقة داخل الأنسجة من الصعب الكشف عن. في تحليل التدفق الخلوي، يتم هضمها الرئتين تماما لحساب عدد الخلايا السرطانية في الرئتين. هذه العملية تسبب فقدان معلومات قيمة حول موقع خلية الورم (داخل أو خارج الأوعية الدموية). على العكس من ذلك، يسمح للكشف عن الخلايا السرطانية تحت مجهر الأسفار [كنفوكل] الورم المميزة للخلايا في الأوعية الدموية من الآخرين10.
الأسفار ستيريو المجهر أسلوب بسيط جداً. وقد أي تحيز بالمقارنة مع مجهر مسح استخدام التدفق الخلوي لحساب عدد الخلايا السرطانية. فمن الممكن لمسح المقاطع الرئة كاملة تحت مجهر الأسفار [كنفوكل]؛ بيد الفحص ثم ستكون شاقة. أنواع أخرى من ورم الخلايا أو الخلايا اللحمية قد تكون مختلطة مع خلايا الورم حقن. حقن المشارك من الخلايا المرتبطة بالسرطان يعزز إمكانية ورم خبيث. معدل ورم خبيث يتوقف إلى حد بعيد على نوع الخلية الورم والحيوانات المستخدمة.
وكما ذكر أعلاه، أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو حقن الوريد الذيل. دقة عدد الخلايا يحتاج إلى حقن مع لا تسرب، ولكن من الصعب من الناحية الفنية. مراقبة بعناية في المعالجة من قبل الباحثين المهرة قد يكون عونا كبيرا.
سلسلة من الدراسات النموذجية ماوس قد ذكرت أن 20% خلايا الورم حقن خضع للتسرب، وشكلت 3% منهم ميكروميتاستاسيس، وفقط 0.02 في المائة نمواً في العقيدات المنتشر ملموسة2. في حالة حقن الخلية بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة (3 × 104 خلايا)، تم الكشف عن الخلايا بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة 150-300 بتحليل التدفق الخلوي في الفص والذيلية معزولة ح 2 بعد الحقن. العدد الإجمالي للتجارة والنقل-شركة ذات مسؤولية محدودة في الرئتين يفترض أن تكون 600-1,200، مشيراً إلى أن 2-4% من حقن الخلايا لا يزال على قيد الحياة. انخفاض هذه النسبة في3،طريقة تعتمد على الساعة11. الخلايا الأخرى يفترض أن الخضوع للمبرمج بسبب الافتقار إلى الدعم المادي أو التغذية، أو بسبب الاستبعاد بالجهاز المناعي. في بياناتنا الأخيرة، 24 ساعة بعد حقن بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة (6 × 104 خلايا)، وجد أن حوالي 20 عدد بروتينات فلورية خضراء ذات المسؤولية المحدودة في الرئتين. يمكن أن تتأثر هذه النتائج إلى سلالة الماوس وخلية الورم، وعوامل أخرى. على سبيل المثال، أفيد أن عدد الخلايا السرطانية في الرئتين مرتفعة في المرحلة ما قبل المنتشر12، أو تعديل في الجينات للفئران13،14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
لا شيء
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
