Summary
这份手稿描述了一种在肿瘤转移动物模型中量化肺部肿瘤细胞积累的方法。
Abstract
为了探讨肿瘤转移的分子机制, 提出了以小鼠为模型动物的各种检测方法。在这里, 我们演示了一个简单的方法来评估肿瘤细胞外渗或微转移。在本试验中, 肿瘤细胞通过尾静脉注射, 经过短暂的解剖和消化, 对累积的标记肿瘤细胞进行解剖和消化。该方法跳过原发肿瘤浸润到血管的初始步骤, 并有助于研究肿瘤转移发生的遥远器官的事件。注射到血管中的细胞数量可以优化, 以观察有限数量的转移。据报道, 远处器官中的间质细胞会导致转移。因此, 该方法可以作为一个有用的工具, 探索潜在的治疗药物或设备, 以防止肿瘤转移。
Introduction
肿瘤转移是癌症相关疾病死亡率高的原因。从分子水平的研究来看, 转移可分为多个步骤: 肿瘤在原发肿瘤部位发生、原发肿瘤生长和侵入周围组织、静脉内、血管循环, 在远处器官的外渗, 和肿瘤的再生长。每个步骤涉及不同的分子组信号1。
到目前为止, 研究一直关注肿瘤细胞开始在血液中循环之前发生在遥远器官的事件, 这也被称为转移前阶段2,3,4,5, 6。我们的小鼠模型研究表明, 转移前的阶段通过在肺部产生长期和低水平的炎症反应, 促进肺转移。转移前阶段的特点是微血管高通透性, 骨髓衍生细胞 (bmdc) 的招募, 以及细胞因子/趋化蛋白样分子的兴奋, 包括 s100a8 和 saa3,4.据报道, 溶解氧化酶改变肺细胞外基质, 以招募 bmdc7。另一份报告揭示了 angpt2、mmp3 和 mmp10 在转移前第8阶段的重要性。换句话说, 需要理解和适当调节原发肿瘤、骨髓和远程器官之间复杂的相互作用 (例如, 通过使用针对参与这些相互作用的蛋白质的药物), 以防止未来的转移9.为了调节转移前的阶段, 它应该首先可视化和评估诊断或治疗干预。在这里, 我们报告肺肿瘤细胞招募试验, 使研究的转移前阶段在肺部。
直接注射到小鼠血管中的肿瘤细胞与癌症患者的循环肿瘤细胞相似, 尽管培养的细胞与循环肿瘤细胞可能存在差异。循环肿瘤细胞在从原发肿瘤进入循环时, 会发生一些特征性变化。然而, 培养的细胞可以形成肿瘤免疫缺陷的小鼠时, 他们被注射到尾静脉。此外, 在小鼠模型系统中, 荧光标记的肿瘤细胞可以用来跟踪体内的这些细胞。循环肿瘤细胞的行为至关重要, 因为它们决定了癌症患者的最终后果 10。血液不是肿瘤细胞生存的好地方2。他们需要逃离宿主免疫系统的攻击, 需要抗凋亡信号, 以防止由于缺乏物理支持而凋亡。肿瘤细胞在转移部位具有较高的肿瘤起始能力, 会产生更多的肿瘤结节。如果肿瘤细胞表现出特定的器官取向, 则应在这些特定器官中观察转移。在本试验中, 转移性级联 (原发肿瘤生长和侵袭) 的初始步骤不包括在内, 因此重点是循环肿瘤细胞与间质细胞 (内皮细胞、上皮细胞和血细胞) 之间的相互作用。在常规肿瘤细胞注射检测中, 研究人员必须等到肿瘤结节生长到有形大小才能检测到转移。在这种情况下, 血管中肿瘤细胞的确切数量无法量化。此外, 这个过程包括肿瘤再生阶段, 表明肿瘤细胞中的其他因素可能会影响结果。
在荧光立体显微镜下计数标记的肿瘤细胞是一个简单的过程。立体显微镜提供了一个广阔的视野, 以便可以扫描整个肺。流式细胞术也是一个有用的工具, 立即给出一个准确的数量的肿瘤细胞在组织。在共聚焦显微镜下计数组织中的荧光细胞也是可能的, 并显示转移性肿瘤细胞的最准确的图片, 但它是耗时的, 并可能产生偏置的结果, 如果只计算选定的区域。本试验的最终目的是观察肿瘤细胞在肺部的易受性积累。正如前面3,4, 如果肺是由于炎症信号从原发肿瘤进入转移前阶段, 注射的肿瘤细胞容易积累在肺部, 从而意味着更高的转移肺的机会。其他条件 (类风湿性关节炎、哮喘等), 以及使用抗炎药 (如抗 tnfα) 治疗的疾病, 可减轻肺转移。因此, 我们的结论是, 这种检测是一个强有力的工具, 以评估肺转移的可能性。
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Protocol
所有用老鼠进行的手术都得到了东京女子医科大学动物研究委员会的批准。
1. 刘易斯肺癌 (llc) 细胞尾静脉注射
- 在 dmem 中保持 llc 细胞, 并在37°c 的加湿 5% co2 孵化器中补充10% 的 fcs。细胞应包含荧光蛋白表达系统 (例如, gfp)。
- 使用非酶细胞离解试剂从培养皿中去除细胞。遵循制造商的协议。
- 收集细胞在一个15毫升管, 离心机在 400 x g 3分钟. 通过移液在 pbs 的5毫升中重新移植细胞, 并离心管 (400 x g, 3分钟)。然后, 取出上清液。
- 重复此清洗步骤一次。
- 第二次清洗后, 通过细胞过滤器 (40μm 孔径) 将细胞通过, 然后在 pbs 中重新悬浮, 使细胞的最终密度达到 1 x10 6细胞。
- 通过尾静脉向每只 c57bl6 小鼠 (8-10周大的雄性) 注入0.1 毫升的细胞悬浮液 (1 x 10 5 细胞, 29g 针)。
2. 在荧光立体显微镜下分离肺和计数细胞
- 通过吸入二氧化碳对小鼠进行安乐死。
- 用剪刀切除胸部腹侧表面的皮肤。然后, 割断肋骨和横隔膜, 露出胸腔。冲洗 pbs (100 cmh2o,共15毫升) 通过右心室与有翅膀的输液25g 针和导管。
- 切掉心脏和胸腺。用钳子抓住气管, 然后拉起来, 用剪刀解剖气管周围的结缔组织。解剖肺部, 在 pbs 中清洗。
- 分离每个叶, 并在荧光立体显微镜下观察它。
3. 肺消化
- 在10毫升无血清 dmem 中溶解10毫克胶原酶、10毫克的消解酶和10微克的 dnase。过滤通过0.22μm 注射器过滤器, 以准备酶消化溶液。
- 用剪刀把孤立的尾叶切成。将肺片放入10毫升注射器中, 然后是柱塞。
- 通过将消化液 (5 毫升) 拖回柱塞上, 将消化液 (5 毫升) 吸入注射器。上下操作柱塞, 直到肺沉入溶液中。然后, 将肺和消化缓冲液放入50毫升管中。
- 在对等振动台 (150 转/分) 上, 在37°c 下摇晃管15分钟。在这种孵化过程中, 肺可能会变得破烂不堪。
- 上下移液器, 直到肺细胞完全分散。在对等振动台 (150 转/分) 的37°c 下, 在37°c 下摇管再30分钟。
- 通过40μm 的细胞过滤器传递肺细胞。将细胞向下旋转, 以 400 x g 的速度旋转3分钟。
4. 肺细胞流式细胞仪
- 在10毫升的 pbs 中溶解100毫克 bsa, 并通过0.22μm 注射器过滤器制备 pbs-1% bsa。
- 使用移液器去除在步骤3.6 中获得的样品的上清液, 加入2毫升的红细胞裂解溶液。然后, 以 400 x g 的速度将细胞向下旋转 3分钟, 丢弃上清液。
- 通过移液将 pbs-1% bsa 5 毫升中的细胞重新移植, 并对管进行离心 (400 x g, 3分钟)。放弃上清液。
- 重复此清洗步骤一次。
- 悬浮在1毫升的 pbs-1% bsa 中的细胞, 并通过新的40μm 电池过滤器。
- 用流式细胞仪分析细胞以计数肿瘤细胞 (使用 gfp-llc 的过滤装置 fl1)。
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Representative Results
注射2小时后, 肺部就会出现许多 gfp-llc 细胞 (图 1a)。需要注意的是, 在红色滤光片中也检测到的荧光斑点应排除在细胞数量计数之外。绝大多数 llc 细胞在注射24小时后从肺部消失 (图 1c)。
为了确认肺部 gfp-llc 的数量, 其中一个裂片可用于流式细胞仪分析 (图 2)。
图 1: 在荧光立体显微镜下检测 gfp-llc 细胞.(a) 肺被隔离 2小时 (a: 过滤器集 gfplp, b: 过滤器集 etp cy3) 或 24小时 (c: 过滤器集 gfplp, d: 过滤器集 et/cy3) 注射 3 x 10 4 gfp-llc 细胞后。在 (c) 中, gfp-llc 单元格用黄色箭头标记。蓝色箭头标记的斑点不是 gfp-llc 细胞。刻度栏指示 750μm. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 2: 肺细胞流式细胞仪分析.(a) 及 (b);用于尾静脉注射的 gfp-llc 细胞的流式细胞仪分析。排除细胞中含有碘化物 (1μg ml) 的细胞悬浮液。(a) 显示 fsc与ssc 的图, 并在 (b) 中开发 (c) 区域中的细胞, 以显示 fl1 对 fl3图.区域 (d) 中的细胞被认为是 gfp-llc 细胞。(e) 及 (f);尾静脉注射24小时后, 尾垂细胞点状物分离。在区域 (d) 中观察到 gfp-llc 细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在肿瘤细胞注射之前, 可以用抗体、药物、高脂肪饮食或肿瘤调节的培养基对小鼠进行预处理。在这个试验中最困难的一步是尾巴静脉注射。不完全注射会导致数据不确定。c57bl6 中的尾静脉特别难以识别, 导致注射失败。将小鼠放置在加热垫 (37°c) 上有助于扩张尾静脉, 使注射变得更容易。
该检测使用大量 (1 x 10 4-1x 10 5) 肿瘤细胞,比在患者血液中观察到的要大得多。一次性注射如此大量的细胞可能会引起宿主动物不想要的反应。在荧光立体显微镜计数中, 组织深处的肿瘤细胞很难被检测到。在流式细胞术分析中, 肺被完全消化, 以计数肺部的肿瘤细胞。这个过程会导致失去关于肿瘤细胞位置 (血管内部或外部) 的有价值的信息。相反, 在共聚焦荧光显微镜下检测肿瘤细胞可以区分血管中的细胞肿瘤和其他10.
荧光立体显微镜是一种非常简单的方法。用流式细胞术对肿瘤细胞进行计数与显微镜扫描相比没有偏差。在共聚焦荧光显微镜下扫描整个肺切片是可能的;然而, 该检测将是费力的。其他类型的肿瘤细胞或间质细胞可以与注射的肿瘤细胞混合。共同注射癌症相关细胞可增强转移的可能性。肿瘤转移率在很大程度上取决于肿瘤细胞的类型和所使用的动物。
如上所述, 在这个协议中最关键的一步是尾巴静脉注射。需要在没有泄漏的情况下注入准确数量的细胞, 但在技术上是困难的。仔细观察熟练的研究人员的处理可能会有很大的帮助。
一系列小鼠模型研究报告说, 20% 的注射肿瘤细胞接受了外渗, 3% 的细胞形成微转移, 只有0.02% 发展成有形转移瘤 2.在 gfp-llc 细胞注射 (3 x10 4个细胞) 的情况下, 通过流式细胞仪分析检测 15-300 gfp-llc 细胞, 在注射后2小时分离的尾叶中检测到。假定肺部 gfp-llc 的总数为 600-1200, 这表明2-4 的注射细胞仍然存活。此比率以依赖于时间的方式降低 3,11。由于缺乏身体支持或营养, 或由于免疫系统排斥, 其他细胞被认为会细胞凋亡。在我们最近的数据中, 在注射 gfp-llc (6 x10 4个细胞) 24小时后, 发现肺部的 gfp-llc 数量约为20。这些结果可能会受到小鼠株、肿瘤细胞和其他因素的影响。例如, 据报道, 肺中肿瘤细胞的数量在转移前的12阶段, 或在基因修饰小鼠13,14中升高。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
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