Abstract
我々は、in vivoでのシンプルなプラットフォームを介して生成非ウイルス遺伝子送達ベクターの代替として（LCC）のDNA minivectors共有結合した線形を構築した。DNAのministringsが高まり安全性プロファイルを有し、また、効率的に標的細胞へのDNAの貨物を引き渡します。従来のDNAベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含む、望ましくない原核生物配列、CpGモチーフを担持し、細菌の複製起点、宿主の免疫学的応答の刺激につながる可能性があります。従来のDNAベクターの生物学的利用能はまた、それらのより大きな分子サイズに妥協されます。その円形の性質はまた、挿入変異誘発につながる、染色体組み込みを付与することができます。
細菌配列にのみ関心のある遺伝子（GOI）及び必要な真核生物の発現要素を残して、DNAのminivectorsから切除されます。当社のLCCのDNAのminivectors、またはDNA ministringsは、免疫原性細菌配列を欠いています。したがって番目を改善EIR生物学的利用能およびGOI表現。染色体へのベクターの統合の際には、LCCのDNAのministringは致死的に、それによって増殖する細胞集団から潜在的に危険な変異体を除去する、宿主染色体を混乱させるだろう。望ましくないベクター組込み事象の可能性を排除しつつ、DNAのministringsは「ミニサークル」DNAの利点を提供しています。従来のプラスミドおよびその同質遺伝子円形共有結合した（CCC）の対応と比較して、DNAのministringsは、優れた生物学的利用能、トランスフェクション効率、および細胞質の動態を実証する - 彼らは、このように、標的細胞の効果的なトランスフェクションのためのカチオン性界面活性剤の低い量を必要とします。
我々は、使用が簡単で迅速、かつスケーラブルである大腸菌におけるDNA ministringsの生産のためのワンステップ誘導インビボ系を構築しました。
Introduction
目標は、in vivoでの DNA ministring生産システムを簡単かつ高効率ワンステップの熱誘導を用いた線形共有結合した（LCC）のDNA minivectorsのスケーラブルな量を生産することです。 DNAのministringsは、DNAを送達するための安全で効果的な非ウイルス戦略を提供します。それらは、DNAミニサークルの効率でLCCベクターの安全性を兼ね備え、さらにトランスフェクション効率を損なうことなく、ウイルス由来のベクターの安全な代替手段を提供します。
成功するために、導入遺伝子送達システムのために、DNAベクターを標的宿主細胞に入ると、符号化された導入遺伝子（単数または複数）を発現しなければなりません。特に哺乳類系では、実際には克服すべきいくつかの細胞の障壁があります。細網内皮系により、血清ヌクレアーゼおよび免疫検出による分解を回避するために、DNAベクターは、バイオとターゲットシステムと免疫適合性でなければなりません。保護されていないDNAはすぐにプラズマヌクレアーゼによって消化されますDNAベクターは、急速に、標的細胞の形質膜を横切ることができなければならないので、プラスミド膜は緻密なリポタンパク質の壁で構成されています。一旦細胞では、ベクターは、細胞質を横断し、導入遺伝子発現のために核に入ること核膜を通過しなければなりません。非ウイルス遺伝子送達技術は、組織及び細胞標的の強化に焦点を当てます。しかしながら、これらの技術を有する従来のプラスミドの使用は、急速に、遺伝子発現をサイレンシング1,2免疫原性細菌配列の存在によるトランスフェクション効率を低下させます。従来のプラスミドは、通常、原核生物系における保守のための抗生物質耐性遺伝子を運びます。しかし、これらは、ヒト宿主における潜在的な有害作用を生じるか天然に水平遺伝子伝達の影響を介してホスト叢の発生に対する抵抗性を付与することができます。従来のプラスミドはまた、潜在的に、望ましくない免疫賦活応答を誘発することができるジヌクレオチドCpGモチーフ2を含み、導入遺伝子の発現を減少またはサイレンシング。
これらは単独で、真核生物の発現カセットから構成されているように、このようなDNAのミニサークル3のようなDNA minivectorsは、それらの小型化および免疫刺激性原核生物の要素が存在しないため、それらが細胞外および細胞内生物学的利用能および改善された遺伝子発現を向上呈するように遺伝子送達のためのより良い代替手段であります4。より良い標的部位5にインビボ投与に関連した剪断力に対する抵抗性に関して縮小ベクトルサイズの運賃。単位質量あたりのベクターのより高いコピー数は、従って毒性を低下させる、より少ないトランスフェクション試薬を必要とします。しかし、宿主染色体へのランダムベクター組込みの際に、円共有結合、DNAのミニサークルと従来のプラスミドの両方を含む（CCC）ベクターを、閉じた分子の連続性を付与するため、壊滅的な結果をもたらすことができ、挿入変異誘発につながる可能性があり
当社の強化されたLCCのDNAベクターは、DNA ministringsは、優れた発現効率とbioavaiを実証しています不安定性7。さらに、DNAのministringsは、1ステップの熱誘導性のin vivoの産生系、in vitroで複数のステップを必要MIDGEとMiLV LCCベクトル、に好都合で費用対効果の高い代替で製造されています。実証するDNA ministring生産システムは、費用対効果の高い、容易にスケーラブル両方作り、in vivoで実施単純な熱誘導性のプロセスです。このシステムは、 エルシニアエンテロコリチカバクテリオファージPY54由来電話/ PALは 、原核生物プラスミド骨格から最小の真核生物発現カセットを分離するために再結合システム12を protelomerase利用します。我々は、熱誘導性バクテリオファージλプロモーターの制御下のcI [Tsの] 857 13電話のprotelomeraseを表現するために大腸菌細胞（W3NNを）設計されています。発現の際に、電話番号は、前駆体プラスミド上に配置された「スーパーシーケンス」（SS）のサイト内に存在するパル標的部位に作用をprotelomeraseDNAのministring次いで（ 図1）で精製することが可能なLCC製品を得ました。 DNAのministring前駆体プラスミド上のSSサイトも、それによって1前駆体プラスミドから同質遺伝子LCCとCCCのminivectorsの生産を促進する、Creリコンビナーゼ（LOX）、TelNのprotelomerase（telRL）とのFlpリコンビナーゼ（FRT）を含む他のリコンビナーゼのための標的部位をコードします。また、各SSの部位は、核転座14を改善するのに役立つSV40エンハンサー（融合させ、SV40e）配列によって両側に隣接しています。私たちは、融合させ、SV40eの連続添加は、次第にトランスフェクション効率7の対応する増加を与えることを他の場所で実証されています。前駆体プラスミド（pDNAをMiniStringまたはPDMS）は、緑色蛍光レポーター（GFP）との転写融合への関心の任意の所望の遺伝子の挿入を容易にするポリリンカー（ 図1）が含まれています。
DNAのminivector技術かもしれません真核生物系における導入遺伝子発現の効率に向かって遺伝子導入、レポーター遺伝子の発現、および評価するための従来の方法の代わりに使用します。 DNAのministringsは、生体適合性を組み合わせて、直線状のDNAベクターの優れた安全性プロファイルと「ミニ」ベクターのトランスフェクション効率の利益を増加させました。当社の強固なワンステップ生産プラットフォームは、迅速かつ簡単に任意の遺伝子転送アプリケーションのためのDNA ministringsを生成し、高い安全性プロファイルを提供しています。
Protocol
メディアと文化の作製
- LB +アンプの場合：ルリア - ベルターニ培地（LB）の500mlを30分間121℃でオートクレーブを用いて滅菌準備。必要になるまで4℃でアンピシリン及び店舗を100μg/ mlの最終濃度を得るためのアンピシリンを含む栄養補助食品。
- TB +アンプの場合：生産をministringの（500ミリリットル以上）大量の準備をします。調製無菌のTerrificブロス（TB）の600mlを30分間121℃でオートクレーブを用いて滅菌しました。必要になるまで4℃でアンピシリン及び店舗を100μg/ mlの最終濃度を得るためのアンピシリンを含む栄養補助食品。
- LB寒天+アンプの場合：寒天の15グラム/ Lを補充したLB +アンプを用意することにより、滅菌LB寒天プレートを準備します。一定分量は約15 - 必要になるまで4℃で逆さまに滅菌ペトリ皿中の20ミリリットルと保存。
- 無菌的W3NN [PDMS]をストリーキングW3NN [PDMS]のストリークプレートを準備し、LB寒天+アンプ上の細胞。プレートをインキュベートoverni単一のコロニーが観察されるまで、30℃、でGHT。 protelomerase式をderepressing避けるために、この温度以上にW3NNをインキュベートしないでください。
- 無菌的移送無菌試験管にLB +アンプ5mlの。ストリークプレートから単一コロニーを使用してこのボリュームを接種することによりW3NN [PDMS]の一晩培養物を準備します。 230から250 rpmで振とう機で30℃で培養一晩インキュベートします。
2.成長期
- 無菌的に転送滅菌125ミリリットルの三角フラスコにLB +アンプの10ミリリットルと1作り、準備されたLB +アンプに一晩W3NN [PDMS]文化の100μlで接種：100希釈を。
- 大容量の場合は、代わりにLB + AMPの、250ミリリットルの三角フラスコにTB +アンプ50mlに一晩培養液500μlを追加します。
- また、ステップ2.2で第二の「代表」文化としての使用。
- CULまで30℃、250rpmで振盪インキュベーター中でインキュベート600 = 0.8：トゥーレは、光学密度（OD）または吸光度によって示され、後期対数期半ばに達します。 1-2時間後、培地を肉眼で濁っ出現し始めるべきです。
- 無菌的に転送クリーン分光光度計のキュベットへの文化の1ミリリットル。
- 600 nmの設定波長を有するUV-VIS分光光度計を用いて吸光度を測定します。セルが空白（LBまたはTB）を設定するために成長されたメディアの1ミリリットルを使用してください。必要に応じて、代わりにこのステップについて、ステップ2.1.3からの代表的な文化を使用します。
- 文化はまだ適切なODに達していない場合は、シェーカーに戻り、再び半時間ごとに確認してください。 A 600が 0.8に近づくにつれて、より頻繁にODを確認してください。
- 培養物が600 = 0.8で示される後期対数期に達した後、無菌的に滅菌した50mLの遠心管に培養物を移します。
- 10分10,000×gで文化を遠心分離して細胞を収集します。 PEのための点検チューブの底にllet。
- 適切なバイオハザード廃棄物容器に透明な上清をデカント。細胞ペレットを乱さないでください。
- すべての細胞が収集されるまで繰り返して、2.4から2.5を繰り返します。
- 100μlのLB +アンプでペレットを再懸濁します。吸引物は、マイクロピペットを用いて、またはボルテックスミキサーを使用します。大きいministringの生産のために、新鮮なLB +アンプ・メディアの1ミリリットル中に50ミリリットルTB +アンプ培養物からのペレットを再懸濁します。
3. Ministring生産
- 無菌的に42°Cに125ミリリットルの三角フラスコや熱でLB +アンプの20ミリリットルを追加します。大きいministringの生産のために、42℃に予熱したLB +アンプの500ミリリットルを、準備します。
- 予熱した培地中に再懸濁を転送します。
- 42℃で培養し、600 = 1.0で示される過去の対数期まで250rpmで、。 1時間を過ぎて42℃で培養液の20ミリリットルを放置しないでください。
- 37℃まで温度を下げるとのaddiのための文化を残します的な90分。 500ミリリットルのために、90の追加の誘導期間の文化を残す - 120分と温度を低下させません。
- 30℃まで温度を低下させ、2時間の追加の温度ダウンシフトの期間、200rpmで振とう培養を残します。 500ミリリットルのために、4時間または一晩に温度シフトダウンを拡張します。
4.収穫Ministrings
- 無菌的に滅菌した50ml遠心チューブに培養物を移します。 10分10,000×gで遠心分離し、ペレットを検査。
- ペレットを乱すことなく、適切なバイオハザード廃棄物容器に上清を除去。すべての細胞が収集されるまで繰り返します。
- 後で抽出のために-80℃で液体窒素とストア内のすべての市販の抽出とエンドトキシン除去キットまたはフラッシュ凍結してプラスミド抽出のためのペレットを保持します。
Representative Results
DNA抽出後、残りの前駆体プラスミド、LCC原核バックボーン、およびDNA ministringが回復されます。全体的なプラスミド収率及び純度は分光光度計を用いて評価することができます。純度は、1.9〜2.0の比が最適である260 nmでの吸光度の比および280nm（A260 / A280）を用いて推定されます。すべてのLCCおよびCCC産物をアガロースゲル電気泳動（AGE）（ 図2）を介して分離することができます。 AGEは前ministring精製に、熱誘導後の生産をministringの結果を可視化します。 ministring生産の定性的評価は、親プラスミド（5.6 KB）（ 図2）にministring（2.4 KB）のバンド強度を比較することにより、この段階で行うことができます。 Ministring DNAはAGE以下の標準プラスミドゲル抽出プロトコルを介して回収することができる。 図3搬送中に発生する可能性が様々な条件下での生産効率をministring要約プロトコルをる。 Ministring生産効率、製造者の解析プログラムを使用して、DNAバンドの強度に基づいて決定しました。任意の類似した濃度測定プログラムは、AGEの結果を分析するために使用することができます。
図1：生産をministringの概要 （A）親ベクターは、2つのSSサイトに囲まれたレポーター遺伝子と転写融合でポリリンカーを、含まれています。バックボーンは、アンピシリン耐性のβ-ラクタマーゼをコードし、また、in vitro消化のためのバックボーンに固有のいくつかの切断部位が含まれています。 （B）主プロトコルの概要。ステップ2）成長フェーズおよび3）Ministring生産は、プロトコルのシンプルさを強調し、関連する手順の全体概略を提供するために、図に表されています。 （C）Ministring誘導。熱誘導は親プラスミド中のSSサイト上の電話活動が続くTEL発現を可能にする、温度感受性リプレッサーを不活性化する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：プロトコルからの逸脱後に生産をMinistring。 1：コントロール、2：非誘導、3：生い茂る、4：Overinduced、5：早期除去。 DNAのministringはLCC骨格は3キロバイトで、pNN9親プラスミドは5.6キロバイトで、約2.4キロバイトです。 ministringとLCCバックボーンバンドのバンド強度は低いministring収量を示す、プロトコルからの逸脱でドロップします。左から右へ：New England Biolabs社から1キロバイトラダー。コントロール、プロトコルに従って、誘導されていない、ない温度シフトアップ;生い茂る、温度アップシフトドゥリングラム固定相; Overinduced、拡張温度シフトアップ。早期の除去、温度無ダウンシフト。プラスミドはオメガバイオテクEZNAプラスミドミニキットを用いて抽出した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：生産効率（PE）をministring上のプロトコルからの逸脱の影響結果は、3つの試験の平均です。 PEは、AGE後AlphaImager HPを使用して測定された相対バンド強度から推定されます。偏差は、以下の手順で発生します。コントロール、プロトコルに従って、非誘導、ステップ2で、温度無シフトアップ。生い茂る、温度上昇は、ステップ1.6で固定相の間に始まりました。 Overinduced、ステップ2.3で拡張温度シフトアップ。早期の除去は、細胞を除去し、抽出しましたステップ2.3での温度ダウンシフトなし。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここでは代表的な細菌の増殖および操作に使用されているものとは別に特別な設備を必要としないワンステップの熱誘導性プロトコルを使用して、LCCのDNA ministringsの生産のための簡単なシステムを説明します。 DNAのministringsは、原核生物の遺伝的要素を欠いねじれのない、安定した直鎖状DNA発現カセット、あります。それらは、真核生物系における導入遺伝子発現の効率に向かって遺伝子導入、レポーター遺伝子の発現、ならびににおける評価のための従来の方法の代わりに使用することができます。 DNAのministringsは、生体適合性を組み合わせて、直線状のDNAベクターの優れた安全性プロファイルと「ミニ」ベクターのトランスフェクション効率の利益を増加させました。 インビボ生産プラットフォームにおける我々の強固なワンステップは、迅速かつ容易に複数の高価なインビトロの方法を必要とすることなく、任意の遺伝子導入の適用のためのDNA ministringsを生成します。
には、いくつかの重要なステップがあります。最適なministring生産（ 図2、図 3）を確保。熱誘導は生産をministringに最も重要なステップです。生産をministringの完全な欠如は、protelomerase発現の抑制は、LCCのministringに前駆体プラスミドの変換を防止する熱誘導（30℃で保持された細胞）の欠如のために最も可能性が高いです。熱誘導プロトコールに従って、約75％の生産効率を期待します。細胞が対数期にある間、熱誘導が最適です。 （「草むし" 図3）静止期の細胞を使用する場合にPEをministringにおける統計的に有意な差はないが、我々は、全体的なプラスミド収率はほぼ50％の減少を観察しました。収率は使用したプラスミド抽出プロトコルに依存します。細胞が対数期にありながら、最適なministringの生産のために、熱の誘導を誘発します。悪いministring生産は最も可能性の高い長期の温度上昇やinsufficieの結果になりますNT温度シフトダウン。これはE.を活性化させるように長時間の温度上昇は推奨されprotelomerase活性を阻害し、プラスミド安定性を妨げる可能性大腸菌熱ショック応答15。したがって、温度ダウンシフトタイミング、効率的なministring生産のためのもう一つの重要なステップです。 30℃でさらにインキュベーション時間なしで、ministring生産効率が非常に悪いことが判明した（「初期の取り外し」、 図3）。これは、電話の発現および活性のために必要な時間に起因し得ます。発信元プロファージPY54エンコードの電話番号は通常30°Cも電話の活動のためのより最適であり得ることを示している、最適の周りに28°C 12成長エルシニアを 、感染protelomerase。
DNA minivector生産システムは、高品質の細菌の配列遊離DNA minivectorsを生成するために、in vivoでのプラットフォームを利用しています。プロトコルへの変更は、5月増殖期（代わりLBのTB）中に細胞増殖を促進し、またはministring製造及び変換効率を高めるために、プラスミドおよびタンパク質産生を最適化するために、増殖培地を変化させることnclude。より大きな培養容積（200ミリリットル以上）、温度シフトダウンし、30℃でのインキュベーションのためにPEをministringに深刻な悪影響を与えることなく、一晩延長することができます。ここでは、例として、500ミリリットルの文化のための私達のプロトコルでの変更が含まれています。 DNAのministringsの精製は、原核生物の骨格のin vitroでのエンドヌクレアーゼ消化を介して迅速ことができます。原核生物の骨格のin vitroでの分解を可能にする、オープンな線形端を露出するように切 断することができる前駆体プラスミド、原核生物のバックボーン上で利用可能なエンドヌクレアーゼ標的部位の数（ 例えば 、PI-SceIを、PvuIを、ScaIを）があります。他のベクター種からministringsの単離はまた、アニオン交換膜クロマトグラフィー16を介して達成することができます。
LCC DNAベクター生産システムに関連する一つの電流制限は、他のLCCとCCC製品からのDNA ministringの精製の必要性です。簡単に標準的なプラスミド単離方法を用いて精製したが、単離工程は、依然として大規模な設定において不利であることができます。 ministringとLCC原核バックボーンのサイズがあまりにも類似している場合ministringの分離は、AGEを使用して、時間がかかることがあります。あるいは、アニオン交換膜クロマトグラフィーCCCベクトル種16からministringsのより良好な分離を提供することができます。高温はまた、 大腸菌における熱ショック応答を活性化するような温度アップシフトは、他の潜在的な制限することができます負の組換えタンパク質に影響を与える大腸菌は 、17もたらし、その結果、変換をministringにプラスミドの速度を低下させます。我々は、生産プラットフォームの最適化は、回避および/ または熱ショック18のような効果を緩和するために他の場所で報告します。我々また、現在、in vivoでの LCC原核バックボーン汚染を排除または低減するための方法を最適化しています。
LCCのDNA ministringの染色体組込みは、宿主染色体を破壊し、アポトーシスに細胞を施します。だけでなく、このような発癌と隣接する遺伝子のサイレンシング、それによってその安全性を向上させるなどの挿入突然変異誘発の潜在的な負の影響を減らすん。致死効果はまた、関連する副作用との統合の損傷なしノックインおよび遺伝子置換研究のための理想的な方法としての役割を果たすことができます。 DNAのministringベクターは、 生体内で指定されたターゲットに治療用タンパク質、RNA、抗体、または抗原に対する遺伝子の導入および発現に向けて適用されるか、または不良または非機能的対立遺伝子を交換することができます。シンプルなワンステップの熱誘導性のin vivoの産生系は、DNA ministringベクトルが容易に臨床的または工業的用途のために製造することを可能にします。
Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たない宣言します。
Acknowledgments
作者はこの仕事に資金を供給するための自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）をお願いいたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
| Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
| Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 30 ml KIMAX Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
| Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
| Sterile 15 ml Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
| Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml | BD Falcon | 13-675-20 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml | BD Falcon | 13-668-2 | |
| Micropipettor (100-1,000 μl) | FroggaBio | C1000-1 | |
| Micropipettor (20-200 μl) | FroggaBio | C200-1 | |
| Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) | VWR | 89079-472 | |
| Sterile Pipette Tips (1-200 μl) | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
| Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
| Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| 1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
References
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