Abstract
Vi konstruerte lineære kovalent lukket (LCC) DNA minivectors som en ikke-virale gen-avgivelsesvektor alternativ fremstilt via en enkel plattform in vivo. DNA ministrings ha en økt sikkerhetsprofil og også effektivt levere DNA last til målrettede celler. Konvensjonelle DNA-vektorer som bærer uønskede prokaryote sekvenser, inkludert antibiotikaresistensgener, CpG-motivene og bakterielle opprinnelsessteder for replikasjon, noe som kan føre til stimulering av verts immunologiske responser. Biotilgjengeligheten av konvensjonelle DNA-vektorer er også kompromittert på grunn av deres større molekylstørrelse. Deres sirkulær naturen kan også formidle kromosomal integrasjon, som fører til insertional mutagenese.
Bakterielle sekvenser er fjernet fra DNA minivectors, slik at bare det aktuelle genet (GOI) og nødvendige eukaryote uttrykk elementer. Våre LCC DNA minivectors, eller DNA ministrings, er blottet for immunogene bakterielle sekvenser; derfor bedre thEIR biotilgjengelighet og GOI uttrykk. I tilfelle vektor integrering inn i kromosomet, vil LCC DNA ministring letalt forstyrre vertskromosomet, for derved å fjerne den potensielt farlige mutanten fra den prolifererende cellepopulasjonen. Derfor DNA ministrings tilby fordelene med 'minicircle' DNA mens de eliminerer faren for uønskede vektor integrering hendelser. Sammenlignet med konvensjonelle plasmider og deres isogene sirkulære kovalent lukket (CCC) motstykker, DNA ministrings demonstrerer overlegen biotilgjengelighet, transfeksjonseffektivitet, og cytoplasmatiske kinetikk - de således krever lavere mengder av kationiske overflateaktive midler for effektiv transfeksjon av målceller.
Vi har konstruert en ett-trinns induserbar in vivo system for fremstilling av DNA-ministrings i Escherichia coli som er enkel å bruke, hurtig, og skalerbar.
Introduction
Målet er å produsere skalerbare mengder lineær kovalent lukket (LCC) DNA minivectors ved hjelp av en enkel og høy effektivitet ett-trinns varme induserbar in vivo DNA ministring produksjonssystem. DNA ministrings tilveiebringe en trygg og effektiv ikke-viral strategi for å levere DNA. De kombinerer sikkerheten til LCC vektorer med effektiviteten av DNA-minicircles, og også gi et tryggere alternativ til virus-avledede vektorer uten at det går transfeksjonseffektivitet.
For at et transgen leveringssystem for å være vellykket, må DNA-vektor gå inn i mål-vertscellen og uttrykke det kodede transgenet (ene). Det er flere cellulære hindringer som må overvinnes i praksis, spesielt i pattedyrsystemer. For å unngå degradering av serum nukleaser og immundeteksjon av retikuloendoteliale system, må DNA-vektor være bio- og immun-kompatibel med target system. Ubeskyttet DNA er raskt fordøyd av plasma nukleaserog plasmidet membranen består av tett lipoprotein barrierer, slik at DNA-vektoren må være istand til hurtig å krysse plasmamembranen av målceller. En gang i cellen, må vektorene traversere cytoplasma og passerer gjennom kjernemembranen å gå inn i kjernen for transgene uttrykk. Ikke-virale genet levering teknikker fokus på forbedring av vevs- og celle målgruppe. Men bruk av konvensjonelle plasmider med disse teknikkene reduserer transfeksjonseffektivitet på grunn av tilstedeværelsen av immunogene bakterielle sekvenser, som hurtig demper genekspresjon 1,2. Konvensjonelle plasmider vanligvis bærer antibiotikaresistensgener for vedlikehold i prokaryote systemer. Imidlertid kan disse gi potensielle negative effekter i humane verter eller meddele motstand til naturlig forekommende verts flora via horisontal genoverføring effekter. Konvensjonelle plasmider inneholder også dinucleotide CpG motiver to, noe som kan utløse en uønsket immunrespons, potensieltredusere eller stanse transgene uttrykk.
Ettersom de er utelukkende består av den eukaryotiske ekspresjonskassetten, DNA minivectors, slik som DNA minicircles 3, er et bedre alternativ for genavlevering som de utviser forbedret ekstracellulær og intracellulær biotilgjengelighet og bedret genekspresjon på grunn av deres reduserte størrelse og fravær av immunstimulerende prokaryote elementer 4. De reduserte vektorstørrelse fares bedre med hensyn til motstand mot skjærkrefter i forbindelse med in vivo-administrering til et målområde 5. Jo høyere kopiantall av vektoren pr masseenhet krever mindre transfeksjon reagens, og dermed redusere toksisitet. Imidlertid, i tilfelle av tilfeldig vektor integrering i en vertskromosomet, sirkulært kovalent lukket (CCC) vektorer, inkludert både DNA minicircles og vanlige plasmider, bibringe molekylær kontinuitet og derfor kan føre til insertional mutagenese, som kan ha ødeleggende konsekvenser
Våre forbedrede LCC DNA vektorer, ministrings DNA, har vist overlegen uttrykk effektivitet og bioavailabilitet 7. Videre er DNA-ministrings produsert på en ett-trinns varme induserbare in vivo produksjonssystem, en hensiktsmessig og kostnadseffektivt alternativ til mygg og MiLV LCC vektorer, som krever flere trinn in vitro. DNA ministring produksjonssystemet som skal påvises er en enkel varme induserbare prosess som utføres in vivo, noe som gjør det både kostnadseffektiv og lett skalerbar. Dette systemet utnytter Yersinia enterocolitica bakteriofag PY54-avledet Tel / pal protelomerase rekombinasjon system 12 for å skille minimal eukaryote uttrykk kassett fra prokaryote plasmid ryggrad. Vi har konstruert Escherichia coli-celler (W3NN) for å uttrykke Tel protelomerase under kontroll av den varme induserbar promoter bakteriofag λ, cl [Ts] 857 13. Ved uttrykk, fungerer Tel protelomerase på pal målse stede i "Super Sequence" (SS) områder som ligger på forløperen plasmidfor å gi LCC-produkter, hvorfra DNA ministring kan deretter renses (figur 1). SS steder på DNA ministring forløper plasmid også kode målwebområder for andre rekombinaser inkludert Cre rekombinase (lox), TELN protelomerase (telRL) og Flp rekombinase (FRT), og dermed legge til rette for produksjon av isogen LCC og CCC minivectors fra en forløper plasmid. I tillegg er hver SS område flankert på begge sider av SV40 enhancer (SV40e) sekvenser, som tjener til å forbedre kjernetrans 14. Vi har vist andre steder at suksessiv tilsetning av SV40e gradvis overfører tilsvarende økning i transfeksjonseffektivitet 7. Forløperen plasmid (pDNA MiniString eller PDMS) inneholder en polylinker (figur 1) for å lette innføring av en hvilken som helst ønsket gen av interesse i transkripsjonen fusjon med den grønne fluorescerende reporter (GFP).
DNA minivector teknologi kanbli brukt i stedet for konvensjonelle metoder for genoverføring, ekspresjon av rapportørgener, og vurderinger mot effektiviteten av transgene ekspresjon i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og økt transfeksjon effektivitet fordelene med "mini" vektorer med den overlegne sikkerhetsprofilen av lineære DNA-vektorer. Vår robust ett-trinns produksjonsplattform raskt og enkelt produserer DNA ministrings for ethvert genoverføring søknad og tilbyr en høyere sikkerhetsprofil.
Protocol
1. Utarbeidelse av Media og kulturer
- For LB + Amp: Fremstill 500 ml Luria-Bertani-medium (LB) steriliseres ved hjelp av en autoklav ved 121 ° C i 30 minutter. Supplement med ampicillin for å gi en endelig konsentrasjon på 100 ug / ml ampicillin og oppbevar ved 4 ° C inntil anvendelse.
- For TB + Amp: Forbered deg på store (500 ml eller høyere) mengder ministring produksjon. Fremstille 600 ml steril Terrific Broth (TB) steriliseres ved hjelp av en autoklav ved 121 ° C i 30 minutter. Supplement med ampicillin for å gi en endelig konsentrasjon på 100 ug / ml ampicillin og oppbevar ved 4 ° C inntil anvendelse.
- For LB agar + Amp: Fremstill sterilt LB-agarplater ved å fremstille LB + amp supplementert med 15 g / l agar. Delmengde ca 15 - 20 ml i sterile petriskåler og store opp-ned ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Forbered en strek plate av W3NN [PDMS] av aseptisk streaking W3NN [PDMS] celler på LB agar + Amp. Inkuber platen overniGHT ved 30 ° C inntil enkeltkolonier kan observeres. Ikke inkuber W3NN over denne temperaturen for å unngå derepressing protelomerase uttrykk.
- Aseptisk overføring 5 ml LB + Amp til et sterilt prøverør. Forbered en overnatting kultur av W3NN [PDMS] ved inokulering dette volumet med en enkelt koloni fra strek plate. Inkuber kulturen over natten ved 30 ° C i en rystemaskin ved 230-250 rpm.
2. vekstfase
- Aseptisk overføring 10 ml LB + amp inn i en steril 125 ml Erlenmeyerkolbe og inokuler med 100 ul av den over natten W3NN [PDMS] kultur i forberedt LB + Amp, slik at en 1: 100 fortynning.
- For større volumer, tilsett 500 pl av kulturen natten over i 50 ml TB + Amp i en 250 ml Erlenmeyerkolbe, i stedet for å LB + Amp.
- Alternativt kan du bruke som den andre "representant" kultur i trinn 2.2.
- Inkuber i en risteinkubator ved 30 ° C og 250 opm inntil Culture når midten til slutten av log fase, angitt med en optisk tetthet (OD) eller absorbans: A 600 = 0,8. Etter 1-2 timer, bør mediet begynner å vises turbid for det blotte øye.
- Aseptisk overførings 1 ml av kulturen til en ren spektrofotometer kyvette.
- Mål lysabsorbans ved hjelp av en UV-VIS spektrofotometer med en bølgelengde satt til 600 nm. Bruk 1 ml av media der cellene ble dyrket for å sette den tomme (LB eller TB). Eventuelt bruke representant kultur fra trinn 2.1.3 for dette trinnet i stedet.
- Hvis kulturen har ennå ikke nådd riktig OD, gå tilbake til shaker og sjekke en gang hver halve time. Sjekk OD oftere som A 600 nærmer 0,8.
- Når kulturen har nådd slutten av log fase, indikert ved A 600 = 0,8, aseptisk overføre kulturen inn i sterile 50 ml sentrifugerør.
- Samle celler ved sentrifugering av kulturen ved 10 000 xg i 10 min. Inspiser for en pellet på bunnen av røret.
- Dekanter ryddet supernatanten til en egnet biohazard avfall. Ikke forstyrr cellen pellet.
- Gjenta trinn 2,4-2,5 inntil alle cellene er blitt samlet inn.
- Re-suspendere pellet i 100 mL LB + Amp. Sug bruke en mikropipette eller bruke en vortex mixer. For større ministring produksjon, re-suspendere pellet fra en 50 ml TB + Amp kultur i 1 ml frisk LB + Amp medier.
3. Ministring Produksjon
- Tilsett aseptisk 20 ml LB + amp i en 125 ml Erlenmeyerkolbe og oppvarm til 42 ° C. For større ministring produksjon, forberede 500 ml LB + Amp, forvarmet til 42 ° C.
- Overfør resuspensjon inn i forvarmet medium.
- Inkuber ved 42 ° C og 250 opm inntil siste log-fase, indikert ved A 600 = 1,0. Ikke la 20 ml kultur ved 42 ° C forbi en time.
- Redusere temperaturen til 37 ° C og lar kulturen for en Addielle 90 min. For 500 ml, lar kulturen for en ekstra induksjonsperiode på 90-120 min, og ikke senke temperaturen.
- Redusere temperaturen til 30 ° C og lar kulturen rysting ved 200 rpm i ytterligere nedgiring temperatur periode på 2 timer. For 500 ml, forlenge temperatur nedgiring til 4 timer eller over natten.
4. Høsting Ministrings
- Aseptisk overføre kulturen inn i sterile 50 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 10 000 xg i 10 min og inspisere for en pellet.
- Dekanter supernatanten i en egnet smittefarlig avfallsbeholder uten å forstyrre pelleten. Gjenta til alle cellene har blitt samlet inn.
- Behold pellet for plasmid ekstraksjon med noen kommersiell utvinning og endotoksin fjerning kit eller flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C for senere utvinning.
Representative Results
Etter DNA-ekstraksjon, rest forløper plasmid, LCC prokaryote ryggrad, og DNA ministring vil bli gjenopprettet. Samlet plasmid utbytte og renhet kan vurderes ved hjelp av et spektrofotometer. Renhet estimeres ved hjelp av forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm (A260 / A280), hvor et forhold på 1,9 til 2,0 er optimal. Alle LCC og CCC produkter kan skilles gjennom agarosegel-elektroforese (AGE) (figur 2). AGE visualiserer resultatene av ministring produksjon etter varme induksjon, før ministring rensing. En kvalitativ vurdering av ministring produksjonen kan gjøres på dette stadium ved å sammenligne bånd intensiteten av ministring (2,4 kb) til moder plasmid (5,6 kb) (fig 2). Ministring DNA kan utvinnes via standard plasmid gel ekstraksjonsmetoder følgende AGE. Figur 3 oppsummerer ministring produksjonseffektivitet under ulike forhold som kan oppstå mens carrying ut protokollen. Ministring produksjonseffektivitet ble fastsatt basert på DNA bandet intensiteten ved hjelp av produsentens analyse program. Enhver lignende densitometry programmet kan brukes til å analysere resultatene av AGE.
Fig. 1: Oversikt over ministring produksjon (A) den overordnede Vektoren inneholder en polylinker i transkripsjonen fusjon med et reportergen, innrammet av de to SS-områder. Ryggraden koder for beta-laktamase for ampicillinresistens og inneholder også flere kutt områder som er unike for ryggraden for in vitro fordøyelse. (B) Oversikt over hovedprotokollen. Skritt 2) vekstfase og 3) Ministring Produksjonen er representert i et diagram for å gi en samlet skjematisk av trinnene involvert, fremhever enkelhet av protokollen. (C) Ministring induksjon. Heat induksjon inaktiverer temperaturen sensitive repressor, slik tlf uttrykk etterfulgt av Tel aktivitet på SS steder i mors plasmider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Ministring produksjon etter avvik fra protokollen. 1: Control, 2: induserte, 3: Overgrodde, 4: Overinduced, 5: Tidlig fjerning. DNA ministring er ca 2,4 kb, LCC ryggrad er 3 kb, og pNN9 forelder plasmid er 5,6 kb. Band intensitet ministring og LCC ryggrad band slippe med avvik fra protokollen, noe som indikerer lavere ministring yield. Fra venstre til høyre: 1 kb stige fra New England Biolabs; Control, følgende protokoll; Ikke-indusert, ingen temperaturoppgiring; Grodde, temperatur gire opp During stasjonær fase; Overinduced, utvidet temperaturoppgiring; Tidlig fjerning, ingen temperatur nedgiring. Plasmider ble hentet ved hjelp av Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini Kit. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Effekter av avvik fra protokollen om ministring produksjonseffektivitet (PE) Resultatene er gjennomsnittet av 3 forsøk. PE er beregnet fra relative bandet intensiteten målt ved hjelp AlphaImager HP etter alder. Avvikene skje på følgende: Kontroll, følgende protokoll; Ikke-indusert, ingen temperaturoppgiring på trinn 2; Grodde, temperatur oppgiring begynte under stasjonær fase i trinn 1.6; Overinduced, utvidet temperatur oppgiring ved trinn 2.3; Tidlig fjerning, celler fjernet og ekstrahertuten temperatur nedgiring i trinn 2.3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi beskriver her et enkelt system for produksjon av LCC DNA ministrings ved hjelp av en ett-trinns varme induserbar protokollen, som ikke krever noen spesialutstyr bortsett fra det som brukes i typisk bakterievekst og manipulasjon. DNA ministrings er vridningsfritt, stabile lineære DNA uttrykk kassetter, blottet for prokaryote genetiske elementer. De kan anvendes i stedet for konvensjonelle metoder for genoverføring, ekspresjon av rapportørgener, så vel som i vurderinger mot effektiviteten av transgene ekspresjon i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og økt transfeksjon effektivitet fordelene med "mini" vektorer med den overlegne sikkerhetsprofilen av lineære DNA-vektorer. Våre robust ett-trinns in vivo produksjonsplattform hurtig og lett produserer DNA ministrings for enhver genoverføring anvendelse uten behov for flere kostbare in vitro-prosesser.
Det er flere viktige skritt for åsikre optimal ministring produksjon (figur 2 og 3). Heat induksjon er den mest kritiske trinnet til ministring produksjon. Fullstendig mangel på ministring produksjon er mest sannsynlig på grunn av mangel på varmeindusert (celler beholdt ved 30 ° C), hvor undertrykkelse av protelomerase ekspresjon hindrer omdannelse av forløperen til plasmid LCC ministring. Etter varmeinduksjonsprotokollen, kan forvente en produksjonseffektivitet på omtrent 75%. Varmeindusert er optimal når cellene er i logaritmisk fase. Selv om det ikke er noen statistisk signifikant forskjell i ministring PE ved bruk av celler i stasjonær fase ( "Tilgrodd", figur 3), vi observere nesten en 50% reduksjon i totale plasmid utbytte. Utbytter vil avhenge av plasmidet utvinning protokollen som brukes. For optimal ministring produksjon, utløse varme induksjon mens cellene er i log fase. Dårlig ministring produksjon vil mest sannsynlig være et resultat av langvarig temperaturoppgiring eller insufficient temperatur nedgiring. Langvarig temperatur oppgiring frarådes da dette aktiverer E. coli heat shock reaksjon 15, som kan hemme protelomerase aktivitet og forstyrrer plasmidstabilitet. Derfor timing temperaturen nedgiring er et annet viktig skritt for effektiv ministring produksjon. Uten ekstra inkubasjonstid på 30 ° C, ble ministring produksjonseffektivitet funnet å være svært dårlig ( "Early fjerning", figur 3). Dette kan tilskrives den tid som kreves for Tel ekspresjon og aktivitet. Den stammer profag PY54 koding Tel protelomerase normalt infiserer Yersinia, som optimalt vokser rundt 28 ° C 12, noe som indikerer at 30 ° C kan også være mer optimal for Tel aktivitet.
DNA minivector produksjonssystemet benytter en in vivo plattform for å generere høy kvalitet bakterie sekvens-fri DNA minivectors. Endringer i protokollen kan jegnclude å endre vekstmedier for å optimalisere plasmid og proteinfremstilling for å fremme cellevekst i løpet av vekstfasen (TB istedenfor LB), eller øke produksjonen ministring og omdannelseseffektiviteten. For større kulturvolumer (200 ml) og større, temperatur nedgiring og inkubering ved 30 ° C kan forlenges over natten uten alvorlig negativ innvirkning på ministring PE. Vi har tatt med modifikasjoner i vår protokoll for 500 ml kulturer som et eksempel. Rensing av DNA-ministrings kan bli fremskyndet ved in vitro-spalting av den prokaryote ryggraden. Det finnes et antall endonuklease målse (for eksempel PI-SCEI, Pvul, Seal) som er tilgjengelig på den prokaryote ryggrad forløperen plasmid, som kan kuttes for å eksponere åpne lineær ender, slik at for in vitro-nedbrytning av prokaryote ryggraden. Isolering av ministrings fra andre vektorarter kan også oppnås ved anionbytter-kromatografi membranen 16.
En strømbegrensning i forbindelse med LCC DNA-vektoren produksjonssystem er det behov for rensing av DNA fra flere ministring LCC og CCC-produkter. Selv om lett renses ved anvendelse av standard plasmid isoleringsmetoder, kan isolasjonstrinnet fremdeles være en ulempe i en stor-skala setting. Separasjon av ministring kan være tidkrevende å bruke AGE hvis ministring og LCC prokaryote ryggrad er for like i størrelse. Alternativt kan anionbyttermembran kromatografi gi bedre separasjon av ministrings fra CCC vektorarter 16. Temperatur oppgiring kan være en annen potensiell begrensning som høye temperaturer også aktivere varmesjokk respons i E. coli, noe som virker negativt rekombinant protein gir 17 og dermed redusere forekomsten av plasmid til ministring konvertering. Vi rapporterer et annet sted optimaliseringer av produksjonsplattformen for å omgå og / eller dempe slike effekter av varmesjokk 18. Vier også for tiden å optimalisere fremgangsmåter for å eliminere eller redusere LCC prokaryot backbone forurensning in vivo.
Kromosomal integrering av LCC DNA ministring forstyrrer vertskromosomet og utsetter celle apoptose. Ikke bare gjør dette redusere eventuelle negative konsekvenser av insertional mutagenese som onkogenese og lyddemping av tilstøtende gener, og dermed forbedre sin sikkerhet; den dødelige virkning kan også tjene som en ideell metode for knock-in og gen-erstatning studier uten de tilknyttede bivirkninger og skader av integrasjon. DNA ministring vektorer kan brukes mot overføring og uttrykket av gener for terapeutiske proteiner, RNA, antistoffer, eller antigener i et gitt mål in vivo eller erstatte en mal- eller ikke-funksjonell allel. Den enkle ett-trinns varme induserbar in vivo produksjonssystem gjør at DNA ministring vektorer for å være lett produsert for kliniske eller industrielle applikasjoner.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) for å finansiere dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
| Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
| Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 30 ml KIMAX Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
| Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
| Sterile 15 ml Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
| Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml | BD Falcon | 13-675-20 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml | BD Falcon | 13-668-2 | |
| Micropipettor (100-1,000 μl) | FroggaBio | C1000-1 | |
| Micropipettor (20-200 μl) | FroggaBio | C200-1 | |
| Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) | VWR | 89079-472 | |
| Sterile Pipette Tips (1-200 μl) | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
| Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
| Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| 1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
References
- Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
- Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
- Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
- Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
- Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
- Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
- Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
- Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
- Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
- López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
- Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
- Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
- Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).
- Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
- Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
- Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).
