The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Construiu-lineares fechados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como uma alternativa vetor de administração de genes não virais produzidas através de uma plataforma simples in vivo. Ministrings ADN possuem um perfil de segurança elevado e também produzir com eficiência de carga de ADN para células alvo. vectores de ADN convencionais transportar sequências procarióticas indesejáveis, incluindo os genes de resistência a antibióticos, motivos de CpG, e as origens bacterianas de replicação, o que pode levar à estimulação de respostas imunológicas do hospedeiro. A biodisponibilidade de vectores de ADN convencionais também está comprometida devido ao seu tamanho molecular maior. A sua natureza circular também pode conferir a integração cromossômica, levando a mutagénese de inserção.
sequências bacterianas são excisadas do ADN minivectors, deixando apenas o gene de interesse (GOI) e necessários elementos de expressão eucarióticos. Nossos minivectors DNA LCC, ou ministrings DNA, são desprovidos de sequências bacterianas imunogénicas; melhorando assim thbiodisponibilidade EIR e expressão GOI. No caso do vector de integração no cromossoma, o ADN ministring LCC letalmente vai perturbar o cromossoma do hospedeiro, removendo desse modo o mutante potencialmente perigosos a partir da população de células em proliferação. Consequentemente, ministrings ADN proporcionam os benefícios de ADN 'minicrculo' enquanto elimina o potencial para eventos de integração vector indesejáveis. Em comparação com os plasmídeos e os seus homólogos convencionais (CCC) isogénicas circular covalentemente fechado, ADN ministrings demonstrar biodisponibilidade superior, a eficiência de transfecção, e a cinética citoplasmáticos – se, assim, necessitam de quantidades inferiores de agentes tensioactivos catiónicos para a transfecção eficaz das células alvo.
Construímos um um passo indutível sistema in vivo para a produção de ministrings ADN em Escherichia coli, que é simples de utilizar, rápido, e escalável.
O objetivo é produzir quantidades escaláveis de linear covalentemente fechada minivectors (LCC) de ADN usando uma uma etapa in vivo DNA sistema de produção ministring induzida pelo calor da eficiência simples e alta. ministrings ADN fornecer uma estratégia não virai seguro e eficaz para entregar ADN. Elas combinam a segurança dos vectores LCC com a eficiência de minicirculos de ADN, e também oferecer uma alternativa mais segura para os vectores derivados de vírus sem comprometer a eficiência da transfecção.
Para que um sistema de fornecimento de transgene a ser bem sucedida, o vector de ADN deve entrar na célula hospedeira alvo e expressam o transgene (s) codificados. Existem várias barreiras celulares que precisam de ser ultrapassados na prática, particularmente em sistemas de mamíferos. A fim de evitar a degradação pelas nucleases do soro e detecção imunológica pelo sistema reticulo-endotelial, o vector de ADN devem ser bio- e imuno-compatível com o sistema de destino. DNA desprotegido é rapidamente digerido por nucleases de plasmae a membrana de plasmídeo é composto de barreiras de lipoproteínas densos de modo que o vector de ADN deve ser capaz de atravessar rapidamente a membrana plasmática das células alvo. Uma vez na célula, os vectores têm de atravessar o citoplasma e passar através da membrana nuclear para o núcleo para introduzir a expressão do transgene. técnicas de entrega de genes não virais concentrar no reforço da Tecido e célula-alvo. No entanto, a utilização de plasmídeos com estas técnicas convencionais reduz a eficiência da transfecção, devido à presença de sequências bacterianas imunogénicas, que silencia a expressão do gene rapidamente 1,2. plasmídeos convencionais normalmente carregam genes de resistência a antibióticos para manutenção em sistemas procariotas. No entanto, estes podem produzir efeitos adversos potenciais em hospedeiros humanos, a conferir resistência à ocorrência natural flora hospedeiras através de efeitos transferência horizontal de genes. Plasmídeos convencionais também contêm motivos dinucleótido CpG 2, o que pode desencadear uma resposta imunoestimuladora não desejada, potencialmentereduzir ou silenciar a expressão do transgene.
Como eles são unicamente composta de a cassete de expressão eucariótica, minivectors ADN, tais como minicirculos de ADN 3, são a melhor alternativa para a entrega de genes que exibam uma biodisponibilidade melhorada extracelular e intracelular e expressão melhorada do gene devido ao seu tamanho reduzido e ausência de elementos procarióticas imunoestimuladores 4. As tarifas reduzidas tamanhos vector melhores no que diz respeito a resistência a forças de corte associadas com a administração in vivo a um local alvo 5. O maior número de cópias do vector por unidade de massa requer menos reagente de transfecção, diminuindo assim a toxicidade. No entanto, no caso de vector de integração aleatória num cromossoma do hospedeiro, circular covalentemente fechada (CCC) vectores, incluindo ambos os minicirculos de DNA e plasmídeos convencionais, conferir continuidade molecular e, por conseguinte, pode levar à mutagénese de inserção, que pode ter consequências devastadoras <s-se> 6. Comparativamente, a integração de um vector de DNA linear interrompe o cromossoma e inicia percursos de morte celular, removendo assim a célula mutante a partir da população de células a proliferar e prevenção mutagénese de inserção 7. Vetores minimalistas expressão de genes imunologicamente definido (MIDGE) 8 e vetores micro-linear 9 (MiLV) são vectores de DNA LCC desenvolvidos in vitro. Vetores Midge exibiram até 17 vezes melhorada expressão do transgene in vivo em comparação com DNA plasmídeo convencional vetores 11, e têm demonstrado resultados promissores em terapia genética vacina 10 e câncer 8. Além disso, devido à estrutura livre de torção da minivector LCC, menos reagente de transfecção é necessário, em comparação com o homólogo CCC super-enrolado, reduzindo assim a toxicidade 7.
Nossos vectores de DNA LCC avançados, ministrings DNA, demonstraram a eficiência expressão superior e bioavailabilidade 7. Além disso, ministrings de DNA são produzidos em um sistema de produção in vivo induzida pelo calor de um passo, uma alternativa conveniente e de baixo custo aos vectores MIDGE e MiLV LCC, que requerem etapas múltiplas in vitro. O sistema de produção ministring DNA a ser demonstrado é um processo termo-inducible simples realizado in vivo, tornando-a eficaz e facilmente escalável. Este sistema explora a Yersinia enterocolitica bacteriófago derivada-PY54 Tel / PAL protelomerase sistema de recombinação 12 para separar a cassete de expressão eucariótica mínima a partir da estrutura do plasmideo procariótica. Temos engenharia Escherichia coli (W3NN) para expressar Tel protelomerase sob o controle do promotor do bacteriófago λ induzida pelo calor, cl [TS] 857 13. Após expressão, Tel protelomerase age em locais-alvo pal presente dentro de "Super Sequence" (SS) sítios localizados no plasmídeo precursorpara produzir produtos LCC, a partir do qual o ministring ADN pode então ser purificado (Figura 1). Os locais de SS no plasmídeo de ADN ministring precursor também codificam locais alvo para outras recombinases incluindo a recombinase Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) e Flp recombinase (FRT), facilitando assim a produção de LCC isogénico e minivectors CCC a partir de um plasmídeo precursor. Além disso, cada sítio SS é flanqueado em ambos os lados por sequências de SV40 (SV40e), que servem para melhorar a translocação nuclear 14. Nós demonstramos noutro local que a adição sucessiva de SV40e confere progressivamente aumentos correspondentes na eficiência de transfecção 7. O plasmídeo precursor (pADN MiniString ou PDMS) contém um poli-ligante (Figura 1) para facilitar a inserção de qualquer gene desejado de interesse em fusão transcricional com o repórter fluorescente verde (GFP).
A tecnologia de DNA minivector podeser utilizado em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, e as avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de "mini" vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. Nossa plataforma robusta de produção de uma etapa rápida e facilmente produz ministrings de DNA para qualquer aplicação de transferência de genes e oferece um perfil de segurança mais elevado.
Descrevemos aqui um sistema simples para a produção de ADN ministrings LCC utilizando um protocolo induzida pelo calor de um passo, o qual não requer nenhum equipamento especial para além de que o que é utilizado no crescimento bacteriano típico e manipulação. ministrings DNA são, cassetes lineares estáveis livre de torção de expressão de ADN, desprovido de elementos genéticos procariotas. Eles podem ser utilizados em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, bem como nas avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de "mini" vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. A nossa robusta de um só passo em plataforma de produção in vivo de forma rápida e facilmente produz ministrings ADN para qualquer aplicação de transferência de genes, sem a necessidade de múltiplos processos dispendiosos in vitro.
Há vários passos críticos paragarantir a produção ministring ideal (Figuras 2 e 3). indução de calor é a etapa mais importante para a produção ministring. Ministring completa falta de produção é muito provavelmente devido à falta de indução de calor (células retidos a 30 ° C), em que a repressão da expressão protelomerase impede a conversão do plasmídeo precursor para ministring LCC. Seguindo o protocolo de indução de calor, esperar uma eficiência de produção de aproximadamente 75%. indução de calor é optimizada, enquanto as células estão na fase log. Embora não haja nenhuma diferença estatisticamente significativa na ministring PE ao utilizar células em fase estacionária ( "Overgrown", Figura 3), fizemos observar quase uma diminuição de 50% no rendimento global plasmídeo. Os rendimentos vão depender do protocolo de extracção de plasmídeo utilizado. Para a produção ministring ideal, desencadear indução de calor, enquanto as células estão em fase de registro. produção ministring pobres provavelmente será resultado de upshift temperatura prolongada ou insufficient downshift temperatura. Prolongada upshift temperatura é desencorajado, pois isso ativa a E. resposta de choque de calor coli 15, que pode inibir a actividade protelomerase e interferir com a estabilidade do plasmídeo. Portanto, cronometrando o downshift temperatura é mais um passo crítico para a produção ministring eficiente. Sem tempo de incubação adicional a 30 ° C, ministring eficiência de produção verificou-se ser muito baixa ( "remoção precoce", Figura 3). Isto pode ser atribuído ao período de tempo necessário para a expressão e a actividade Tel. A originários profago PY54 codificação Tel protelomerase normalmente infecta Yersinia, que cresce optimamente cerca de 28 ° C 12, indicando que a 30 ° C também podem ser mais óptimo para a actividade Tel.
O sistema de produção DNA minivector utiliza uma plataforma in vivo para gerar alta qualidade minivectors ADN livre de sequências bacterianas. Modificações para o protocolo pode include alterando os meios de crescimento para optimizar plasmídeo e produção de proteína, a fim de promover o crescimento de células durante a fase de crescimento (em vez de TB LB), ou aumentar ministring produção e eficiência de conversão. Para volumes maiores de cultura (200 ml e maiores), downshift temperatura e incubação a 30 ° C pode ser alargado durante a noite, sem impacto negativo severo sobre ministring PE. Nós incluímos modificações em nosso protocolo para 500 ml culturas como um exemplo. A purificação do ADN ministrings pode ser acelerada através de digestão in vitro de endonuclease da espinha dorsal procariótica. Há um número de locais-alvo da endonuclease de (por exemplo, PI-Scel, Pvul, ScaI) disponível na espinha dorsal do plasmídeo procariótica precursor, o qual pode ser cortado para expor linear extremidades abertas, para permitir que a degradação in vitro de a espinha dorsal procariótica. Isolamento de ministrings a partir de outras espécies de vectores pode também ser alcançada através de cromatograf ia de membrana de permuta aniónica 16.
Uma limitação de corrente associado com o sistema de produção de vector de ADN LCC é a necessidade de purificação do DNA a partir de ministring outros produtos LCC e CCC. Embora facilmente purificado utilizando métodos de isolamento de plasmídeo padrão, o passo de isolamento pode ainda ser uma desvantagem numa configuração em larga escala. Separação do ministring pode ser usando idade, se o ministring e a espinha dorsal procariótica LCC são muito semelhantes em tamanho demorado. Alternativamente, a cromatografia de membrana de troca aniônica podem proporcionar uma melhor separação de ministrings a partir de espécies CCC vetor 16. Temperatura upshift pode ser outra limitação potencial como altas temperaturas também ativar a resposta ao choque térmico em E. coli, que afeta negativamente a proteína recombinante produz 17 e, consequentemente, reduzir as taxas de plasmídeo para ministring conversão. Nós relatamos em outros lugares otimizações da plataforma de produção para contornar e / ou mitigar esses efeitos de choque térmico 18. NósTambém estão otimizando os métodos actualmente para eliminar ou reduzir a contaminação LCC backbone procariotas in vivo.
integração cromossómica do ADN ministring LCC perturba o cromossoma do hospedeiro e sujeita a célula a apoptose. Isto não só reduzir potenciais consequências negativas da mutagénese de inserção, tais como oncogênese e silenciamento de genes adjacentes, melhorando assim a sua segurança; o efeito letal pode também servir como um método ideal para a knock-in e estudos de substituição de genes, sem os efeitos colaterais associados e danos de integração. Os vectores de ADN ministring pode ser aplicado para a transferência e expressão de genes para proteínas terapêuticas, ARN, anticorpos ou antigénios num dado alvo in vivo ou substituir um alelo funcional inadequadamente ou não. O calor indutível-in vivo sistema simples de uma etapa de produção permite vectores de ADN ministring para ser facilmente produzidas para aplicações clínicas ou industriais.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem as Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) pelo financiamento deste trabalho.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |