Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse
Summary
Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.
Abstract
Indirekte Immunfluoreszenz dient zum Erfassen und Lokalisieren von interessierenden Proteinen in einem Gewebe. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein vollständiges und einfaches Verfahren für die Immunerkennung von Proteinen, wobei die Maus laktierenden Milchdrüse als ein Beispiel genommen. Ein Protokoll für die Herstellung von Gewebeproben, insbesondere in Bezug auf die Präparation von Maus-Brustdrüsen, Gewebefixierung und gefrorenem Gewebe Schnitte, sind detailliert. Ein Standardprotokoll, um die indirekte Immunfluoreszenz durchführen, einschließlich eines optionalen Antigen-Retrieval-Schritt wird ebenfalls vorgestellt. Die Beobachtung der markierten Gewebeschnitte als auch die Bildaufnahme und Nachbehandlungen sind ebenfalls angegeben. Dieses Verfahren ergibt eine vollständige Übersicht, aus der Sammlung von Tiergewebe auf die zelluläre Lokalisation eines Proteins. Obwohl diese allgemeine Methode kann auf andere Gewebeproben angewendet werden, sollte es zu jedem Gewebe / primären Antikörper paar studierte angepasst werden.
Introduction
Die Brustdrüse ist ein atypisches Säugetier exokrinen Organ, dessen Hauptfunktion ist die Milch für Neugeborene zu ernähren. Die Entwicklung der Brustgewebe tritt vor allem nach der Geburt und wird durch ein einzigartiges Verfahren, in dem das Epithel dringt in die umgebenden Stroma ist. Dieses Gewebe viele Veränderungen (Wachstum, Differenzierung und Regression), insbesondere während des Erwachsenenlebens gleichzeitig mit Variationen in der Fortpflanzungszustand (Figur 1). Zusätzlich zu der Gesamtmorphologie des Gewebes, wobei die Anteile der verschiedenen Zelltypen sowie deren Anordnung innerhalb des Brustdrüsen dramatisch während der Entwicklung 1-5 ändern.
Während des embryonalen Lebens leitet das Brustepithel von Brustmilchleitungen, die durch eine geringfügige Verdickung und Schichtung des Ektoderms definiert ist, zwischen den Vorder- und Hinterbeinen an jeder Seite der Mittellinie herum Embryonaltag 10,5 (E10,5) (1A ).Auf E11.5 bricht der Milchleitung in einzelne Plakoden, die symmetrisch entlang der Brustmilchleitung an reproduzierbaren Stellen positioniert werden, und die umgebende Mesenchym beginnt zu kondensieren. Die Plakoden beginnen, tiefer in die Dermis Waschbecken und die Brust Mesenchym organisiert in konzentrischen Schichten rund um die Brustknospe (E12.5-E14.5). Ab E15.5 die Brustepithel, beginnt sich zu vermehren und zu verlängern, um die primäre sprießen, die durch den Brust Mesenchym gegen die Fettpolster drückt bilden. Der primäre Spross entwickelt ein hohles Lumen mit einer Öffnung an der Haut, durch die Ausbildung des Nippels Hülle gekennzeichnet. Auf E18.5 hat die Verlängerung Kanal in die Fettpolster gewachsen und hat sich zu einem kleinen arborized Gangsystem in das Fettpolster umgeben verzweigt. Im Wesentlichen wird festgenommen und die rudimentäre Brustdrüsen bleibt morphogenetisch Ruhe bis zur Pubertät. Beim männlichen Embryo, die Aktivierung des Androgen-Rezeptoren führt zur Degeneration der Knospen, die verschwindenvon E15.5. Ab E18, hört bis zur Pubertät 6-9 Brustentwicklung.
Bei der Geburt birgt die Brustdrüse ein rudimentäres Gangsystem, der und verlängert Niederlassungen langsam (isometrische Wachstum). Am Beginn der Pubertät, kugelförmige Gebilde an den Spitzen der Leitungen namens die terminalen Ende Knospen (TEBs), sind aus einer äußeren Schicht der Kappe Zellen und einer mehrschichtigen inneren Kern von Zellen (Körperzellen) gebildet. Diese Strukturen sind hoch proliferative und infiltrieren das umliegende Stroma-Gewebe als Reaktion auf hormonelle Signale. Proliferation innerhalb der TEBS Ergebnisse in duktalen Dehnung, mit Verzweigung Morphogenese gekoppelt. Dieser Prozess führt zur Einrichtung eines Grund epithelialen arborized Netzwerk von dem Nippel (1B Pubertät) ausgeht. Bei ~ 10-12 Wochen nach der Geburt, wenn das Epithel hat die ganze Fettpolster eingefallen, Haltestellen und die Expansion der TEBS verschwinden. Duktale Entwicklung durchläuft dann dynamischen Veränderungen, dh successive Proliferation und Regression von Epithelzellen nach Ovarialzyklen 10 (1B, Erwachsenen).
Vom Beginn der Schwangerschaft durchläuft das Brustgewebe wichtigen Wachstums und morphologische Änderungen für die Stillzeit vorzubereiten. Das Brustepithel ausgiebig proliferieren und differenzieren, was zu einem hochverzweigten tubulo-alveolären Netzwerk. Begleitend Brustepithelzellen (MEC) polarisiert und in der Lage, synthetisieren und sezernieren Milchprodukte. MEC organisieren in zahlreiche alveolären Strukturen (Acini), die von kontraktilen Myoepithelzellen umgeben sind und in einem Stroma der Binde- und Fettgewebe, Blutgefäße und Nervenenden (1B, Schwangerschaft) zusammengesetzt eingebaut. Weiterhin wird die basale Seite des MEC in engem Kontakt mit der Basalmembran (extrazelluläre Matrix) und Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Einheiten eng regulieren sowohl die Morphogenese und sekretorische Funktion der Mammary Epithel 11-13.
Alle diese Verfahren beruhen auf der Wirkung verschiedener Umweltsignale, von denen die wichtigsten sind hormones14, parakrine Faktoren und der extrazellulären Matrix. Zum Beispiel, Progesteron induziert umfangreiche Seitenverzweigung 15 und alveologenesis, dass in Kombination mit Prolaktin (PRL) 16,17 fördert und pflegt die Differenzierung der Lungenbläschen. Zusätzlich zu Steroiden und PRL18, Zytokine und Signalwege mit Entwicklung verbunden (Wnt und Notch Signalwege) sind ebenfalls in Brustlinie Engagement und Entwicklung 19-21 beteiligt. Am Ende der Schwangerschaft, beginnen die luminale MEC um eine proteinreiche Milch Kolostrum im Lumen der Alveolen bekannt herzustellen. Außerdem fungiert Progesteron auf den epithelialen Permeabilität und da die Tight Junctions sind noch offen ist Kolostrum auch in den mütterlichen Blutstrom gefunden.
Nach der Geburt, die Mammary Epithel nimmt fast die gesamte Brustdrüsenvolumens und ist hoch organisierten (Abbildung 2, Brustepithel). Milch erzeugenden Einheiten, nämlich Alveolen (Abbildung 2, Alveole) werden von einer Monoschicht von polarisiertem Brustepithelzellen sekretorischen Zellen (MESCs) gebildet ist, mit ihren apikalen Plasmamembran, die das Lumen begrenzende. Alveolen ordnen sich in die Läppchen, die in Lappen, um Kanäle, die Milch an die Außenmilieu (Abbildung 2, Lappen) Drain gruppiert sind. Laktation auftritt, dh., MESCs beginnen reichliche Mengen von Milch, vor allem durch den Rückgang der Plazentahormone (hauptsächlich Progesteron) (1B, Laktation) ausgelöst absondern. Milchprotein-Gene sind in einer definierten zeitlichen zeitlichen Verlauf von Schwangerschaft Laktation 9,22,23 hauptsächlich in Reaktion auf Hypophysen PRL bei der Säugezeit Freigabe aktiviert. Begleitend Kontakte zwischen MESCs und der extrazellulären Matrix sowohl stimulieren Milchprotein synthesis durch Signale, die über die Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrinen und Laminin 24,25 vermittelt werden, und die Apoptose in MESCs 26,27 zu unterdrücken. Diese Signalwege führen zu der Aktivierung von Milchprotein-Genpromotoren 28 durch die Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren 29. Zell-Zell-Kontakte sind ebenfalls wichtig für einige Aspekte der Differenzierung einschließlich der Einrichtung apikalen Polarität und vektoriellen Sekretion von Milchprodukten. Tight Junctions stark nahe nach dem Beginn der Laktation und MESCs fein orchestriert die Aufnahme von Molekülen aus dem Blut sowie die Synthese, den Transport und die Sekretion von Milchbestandteilen, in Reaktion auf die Ernährungsbedürfnisse von Neugeborenen. Zum Zeitpunkt der Säugezeit erfolgt die Kontraktion der Myoepithelzellen umgibt die Alveolen als Reaktion auf Oxytocin und führt zu Milchejektion durch die Kanäle und in die Nippel. Milch ist ein komplexes Fluid, das Proteine enthält (hauptsächlichCaseine), Zucker (hauptsächlich Lactose), Lipiden und Mineralien sowie bioaktiven Molekülen, wie Immunglobulinen A (IgA), Wachstumsfaktoren und Hormone. Caseine synthetisiert, in supramolekularen Strukturen zusammengesetzt, nämlich Caseinmicellen entlang des sekretorischen Wegs transportiert werden und dann durch Exozytose frei, also die Verschmelzung von caseinhaltigen sekretorischen Vesikel (SV) mit der apikalen Plasmamembran der MESC (Abbildung 2).
Intrazelluläre Verkehr stützt sich auf Material des Austauschs zwischen membranFächern und beinhaltet Lösliche N-Ethylmaleimid-Sensitive Fusion (NSF) Befestigung Protein (SNAP) Rezeptor (SNARE) 30,31. Die SNARE-Proteine der Familie ist in vesikulären SNAREs (v-SNAREs), in der Vesikelmembran Gegenwart und Ziel SNAREs (t-SNAREs), auf die Zielmembranen lokalisiert unterteilt. Durch Komprimieren durch ihre Coiled-Coil-Domänen, V- und T-SNARE versammeln, um eine hochstabile Vierhelixbündel-Komplex zu bilden, bezeichnet als the SNARE-Komplex. Dieser Komplex fördert die Fusion von zwei gegenüberliegenden Lipiddoppelschichten durch die schrittweise bringen sie in die Nähe 30,32. Danach werden SNARE-Komplexen durch die NSF Adenosintriphosphatase dissoziiert und seine Adapter Protein SNAP und SNARE-Proteine sind zurück in ihre Herkunftsfach 33 zurückgeführt. Interessanterweise liegt überwiegend jeweils SNARE-Protein in verschiedenen zellulären Kompartimenten und SNARE Paarung kann die Spezifität der intrazellulären Fusionsereignisse 34 beizutragen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass zumindest Synaptosomale-Associated Protein 23 (SNAP23) und Vesikel-assoziiertes Membranprotein 8 (VAMP8) und Syntaxinen (STX) -7 und -12 eine Rolle bei Casein Exozytose 35,36. Diese Proteine wurden ebenfalls in Verbindung mit der Lipidfraktion von Milch, das heißt Milchfettkügelchen (MFG) 37 gefunden. Die aktuelle vorherrschende Modell postuliert, dass zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (CLDs) sind durch die Akkumulation von neutralen l gebildetipids (hauptsächlich Triglyceride und Sterolester) und Cholesterin aus der Ernährung der Mutter zwischen den beiden Blättchen des endoplasmatischen Retikulums (ER) -Membran 38-41 abgeleitet ist. Große CLDs ausgebildet sind, zumindest teilweise durch die Fusion von kleineren CLDs während es an die apikalen Seite MESCs wo sie als MFG freigegeben werden (1-10 & mgr; m im Durchmesser) durch Knospung transportiert, wobei durch den MESC apikalen Plasmamembran umhüllt 40-42. Stillzeit aufhört, nachdem Welpen entwöhnt und die MESCs schrittweise sterben durch Apoptose, was zur Rückbildung des Brustgewebe wieder zu einem pubertären Zustand (1B, Rückbildung).
Immunfluoreszenz (IF) ist ein in fast allen Bereichen der Biologie verwendet gemeinsamen analytischen Labormethode, sowohl in der Forschung und in der klinischen Diagnostik. IF-Techniken können auf Gewebeschnitten durchgeführt werden (Immunhistochemie, IHC) oder Zelle (Immunzytochemie, ICC) Proben. Diese leistungsstarke Ansatz beruht auf der Verwendung von Leuchtstoff-markierte Antikörper, die spezifisch an die (direkt oder indirekt) mit dem Antigen von Interesse, wodurch die Visualisierung der Verteilung im Gewebe durch Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenzsignale meist hängen von der Qualität und der Konzentration der Antikörper und sachgemäße Handhabung der Probe. Eine einfache indirekte Immunfluoreszenz (IIF) -Protokoll wird präsentiert, um Milcherzeugnisse (Kaseine und MFG) und Proteinen in Milchprodukt Sekretion beteiligt erkennen (butyrophilin (btn1), SNARE-Proteine) an Gefrierschnitten von Mausbrustgewebe (Abbildung 3). Während dieses Protokoll bietet eine komplette Übersicht IHC reichen von Gewebesammlung für Bild Nachbehandlung, kritische und optionale Schritte sowie einige technische Empfehlungen werden ebenfalls vorgestellt und diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
IHC ist eine relativ einfache und direkte experimentelle Methode an Antigen in Gewebeschnitten, die in erster Linie auf spezifische Epitop-Antikörper-Wechselwirkungen abhängt lokalisieren. Obwohl eine große Anzahl von Protokollen verwendet werden, um ein Protein von IIF zu lokalisieren, ist der Kern dieser Verfahren fast immer gleich. Es gibt jedoch einige wichtige Aspekte, die einen starken Einfluss auf das Ergebnis und müssen daher für jede einzelne IHC Studie optimiert werden. Der schwierigste Aspekt dieses Ansa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem INRA MIMA2 Imaging Core Facility (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) und an die Mitarbeiter des IERP Einheit (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) für die Tierpflege und Einrichtungen. Wir möchten auch IH Mather, MC Neville und S. Tooze für die Bereitstellung sehr nützlich antibodie danken.
Materials
| Dissection | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pins | |||
| Ethanol | |||
| Scissors | |||
| Scalpel and adapted blades | |||
| Ice | |||
| Towel paper | |||
| Tissue sample preparation | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.4) | Sigma | P-3813 | |
| Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer |
| OCT compound/Tissue Tek | Sakura | 4583 | |
| Sucrose (D-saccharose) | VWR | 27480.294 | |
| Plastic molds | Dominique Dutscher | 39910 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Cryostat/sample support | Leica | CM3050S | |
| Razor blades (SEC35) | Thermo Scientific | 152200 | |
| Slide box | |||
| Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus | Thermo Scientific | 10143560W90/1014356190 | |
| Brushes | |||
| IHC | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Super Pap Pen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Permanent marker (black) | |||
| 50 mM NH4Cl in PBS | Sigma | A-0171 | |
| 0.1 M glycine in PBS | VWR | 24403.367 | |
| Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6 | |||
| Heater (up to 100°C) | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI | Vector Laboratories | H-1000/H-1200 | |
| Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade) | VWR | CORN2980-225 | |
| Nail polish | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution) | generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA) |
||
| Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution) | Biolegend (Covance) | MMS-162P | |
| Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution) | Thermo Scientific | MS-115-P0/P1 | |
| Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution) | generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA) | ||
| Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution) | generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK) |
||
| Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution) | Abcam | ab3348 | |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-025-003 | |
| Counterstains | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bodipy 493/503 | Life Technologies (Molecular Probes) | D-3922 | |
| DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies (Molecular Probes) | D-1306 | |
| Observation/Image capture | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| conventional fluorescence microscope | Leica Leitz DMRB microscope |
Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions, ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus) |
|
| Laser Scanning Microscope (confocal microscopy) | Zeiss LSM 510 microscope |
Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4), CLSM 510 software, Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2) | |
| Image treatment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ImageJ 1.49k software | Free software |
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