Introduction
Возможность использования в пробирке модельных систем значительно расширили поля нейробиологии и неврологии. Клетки в культуре обеспечивают эффективную платформу для характеристики функциональности белка и молекулярные механизмы, лежащие специфические явления, чтобы понять патологию заболевания и инфекции, а также для выполнения предварительных оценок по тестированию на наркотики. В нейробиологии, основные типы моделей клеточных культур включают первичные нейрональные культуры, полученные от крыс и мышей, и клеток нейробластомы линий, таких как крысы B35 клеток 5, нейро-2A клетками мышиной 6 и крысы РС12 клетки 7. Хотя использование таких клеточных линий значительно продвинулась поле, существует несколько сопутствующих факторов, связанных с обработкой клетки и ткани, отличных от человека. Речь идет о понимании видоспецифические различия в метаболических процессах, фенотипы проявления заболевания и патогенезе, по сравнению с людьми. Важно также отметить, чтоRe значительные различия между мышью и экспрессии генов человека и сигнализации фактора транскрипции, выделяя ограничений моделях грызунов и важности понимания, какие пути обеспечить сохранение грызунов и человека 8-11. Другие использовали использование нейронных клеточных линий человека, включая N-ТЕРА-2 (NT2) линии человеческого тератокарцинома клеток и индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Эти клеточные линии обеспечивают хорошие модели для в пробирке человеческих систем. Тем не менее, дифференциация NT2 клеток с ретиноевой кислотой (RA) приводит к образованию смешанной популяции нейронов, астроциты и радиальных глиальных клеток 12, что требует дополнительной стадии очистки для получения чистых популяций нейронов. Кроме того, NT2 клетки демонстрируют высокую переменную кариотип 13, с более 60 хромосом в 72% клеток. иПСК продемонстрировать вариабельность дифференциации между различными клеточными линиями и различаются по эффективности дифференцировки 14. Поэтому желательно иметь последовательную и воспроизводимую модель нейрона человека дополнить эти альтернативы.
SH-SY5Y Нейробласт-подобные клетки являются подклон из клеток нейробластомы родительской линии SK-N-SH. Клеточная линия родительская сформировалась в 1970 из биопсии костного мозга, который содержит как Нейробласт, как и эпителиальные клетки, как 15. SH-SY5Y клетки имеют стабильный кариотип, состоящую из 47 хромосом, и могут быть дифференцированы от нейробластов состояние, подобное в зрелые человека нейронов с помощью разнообразных различных механизмов, включая использование RA, форболовыми эфиров и конкретных нейротрофинов, таких как полученный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF). До данные свидетельствуют о том, что использование различных методов можно выбрать для конкретных нейронных подтипов, таких как адренергических, холинергических и дофаминергических нейронов 16,17. Этот последний аспект делает SH-SY5Y клетки полезные для множества нейробиологии экспериментов.
ontent "> Несколько исследований отметили важные различия между клетками SH-SY5Y в их недифференцированных и дифференцированных состояний. При SH-SY5Y клетки недифференцированные, они быстро размножаются и кажутся Неполяризованное, с очень немногими, коротких отростков. Они часто растут в комки и экспрессируют маркеры, указывающие незрелых нейронов 18,19. Когда дифференцированы, эти клетки распространяются длинные разветвленные процессы, уменьшение пролиферации, а в некоторых случаях поляризуют 2,18. Полностью дифференцированные клетки SH-SY5Y ранее продемонстрировано выразить множество различных маркеров зрелых нейронов в том числе роста-ассоциированный белок (GAP-43), нейронных ядер (Neun), синаптофизином (SYN), синаптических пузырьков белка II (SV2), нейрон энолаза (NSE) и ассоциированный с микротрубочками белка (MAP) 2,16,17,20 и лишены экспрессии глиальных маркеров, таких как глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) 4. в дальнейшей поддержки, что, дифференцированное SH-SY5Y клетки represeнт однородный нейронов населения, удаление BDNF приводит сотовой апоптоза 4. Это говорит о том, что выживаемость дифференцированных клеток SH-SY5Y зависит от трофических факторов, подобных зрелые нейроны.Использование SH-SY5Y клеток увеличилось с подклон была создана в 1978 3. Некоторые примеры их использования включают расследование болезни Паркинсона 17, болезнь Альцгеймера 21 и патогенез вирусных инфекций, включая полиовируса 22 энтеровирусной 71 (EV71) 23,24 , вирус ветряной оспы (VZV) 1, цитомегаловируса человека 25, и вирус простого герпеса (ВПГ) 2,26. Важно отметить, что ряд исследований с использованием SH-SY5Y клетки использовали эти клетки в их недифференцированном виде, особенно в области neurovirology 27-36. Разница в наблюдаемом фенотипа недифференцированные против дифференцированных клеток SH-SY5Y поднимает вопрос о Wheтермо наблюдаемое прогрессирование инфекции будет отличаться в зрелых дифференцированных нейронов. Например, дифференцированные клетки SH-SY5Y имеют более высокую эффективность HSV-1 поглощение в сравнении недифференцированных пролиферирующих SH-SY5Y клеток, которые могут быть из-за отсутствия поверхностных рецепторов, которые связываются HSV и модулируют запись на недифференцированных клеток SH-SY5Y 2. Поэтому очень важно, что при проектировании эксперимент, направленные на установление нейронов в пробирке, клетки SH-SY5Y следует дифференцировать с целью получения наиболее точных результатов для перевода и сравнения с моделями в естественных условиях.
Создание надежного способа для генерации культур нейронов человека важно, чтобы исследователи для выполнения поступательные эксперименты, которые точно моделируют нервную систему человека. Протокол, представленные здесь это процедура, которая очерчивает лучшие практики, полученные из предыдущих методов 1-4 для обогащения человеческих нейронов, которые дифференцируютсяиспользуя ретиноевой кислоты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общие соображения
- См Таблицу материалы / Оборудование для списка необходимых реагентов. Выполните все шаги под строгим асептических условиях.
- Используйте инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (hiFBS) для всех препаратов медиа, которые включают FBS. Для того чтобы нагреть-Деактивировать, нагреть 50 мл аликвоты FBS при 56 ° С в течение 30 мин, переворачивая каждые 10 мин (смотри также таблицу 1).
Примечание: Когда ФБС используется без термической инактивации, эпителиальный-подобный фенотип прогрессирует быстрее всей культурах клеток SH-SY5Y. - Перед использованием перегрузки носители нагреться и уравновешивают в инкубаторе установить надлежащий баланс рН перед каждым шагом. Например, 50 мл сред занимает около часа, чтобы полностью уравновешиваться (рН 7, 37 ° C, 5% CO 2).
Примечание: Этот протокол использует процедуру расщепления двухступенчатую который требует частично дифференцированные клетки SH-SY5Y быть трипсином и повторно покрытием. Это напряженныйСпособ этих исключительно хрупких клеток. Поэтому, важно, чтобы инкубировать клетки в трипсин для минимального количества времени. Это позволит льготного отрыва нейронов, оставляя эпителиальные клетки, как до сих пор приложенные к блюду. - Выполнение Растирание дифференцированных клеток медленно с 10 мл пластиковый пипеткой с наконечником против нижней части конической трубе, содержащей клетки. Провести растирание на медленной скорости, вверх и вниз не более чем в пять раз.
2. Прохождение SH-SY5Y культур эксплуатационные
- Split культуры обслуживания, когда клетки достигли 70-80% слияния, и не превышают 10 до 15 проходов. Культуры обычно нужно пассировать каждые 3-5 дней (при условии культуры не разбавляют более чем в 5 раз при раскалывании).
- Для прохода клеток из Т-75 колбу, аспирация от средств массовой информации, а затем промыть приблизительно 10 мл 1x PBS.
Примечание: Мы не рекомендуем разделения SH-SY5Y культур обслуживание фуrther чем 1: 5 в течение пассажей, потому что это может привести к клеткам, чтобы умереть из-за низкой слияния. - Аспирировать PBS, а затем добавить 2,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (1x).
- Инкубируйте в инкубатор 2-3 мин и наконечник осторожно, чтобы освободить клетки с поверхности колбы.
- Добавьте 10 мл основной рост носителей (смотри таблицу 2) и растирают 1-2 раза.
- Спин вниз в течение 2 мин при 1000 мкг в, аспирата средств массовой информации, а затем ресуспендируют осадок в 5 мл основной рост Media.
- Развести клетки от 1: 3 до 1: 5 в общем объеме 20 мл в течение нормального обшивки в Т-75 колбу, или рассчитывать и пластина для дифференциации (раздел 5).
3. Замораживание SH-SY5Y Клетки
- Замораживание ранние проходы клетках нейробластомы SH-SY5Y в основной рост, дополненной 5% (V / V) ДМСО.
- Первоначально заморозить аликвот при -80 ° С в течение 24 ч, а затем перенести в жидком азоте в течение длительного хранения.
Примечание: Для справки, сливающийся (75-85%) Т-75 колбу даст пять1 мл аликвоты клеток SH-SY5Y для замораживания. Каждый из этих аликвот должны содержать от 2-5 миллионов клеток общее.
4. Оттепель и культура Недифференцированный SH-SY5Y клетках нейробластомы
- Подготовьте основной рост Media.
- Быстро разморозить замороженных клеток в C водяной бане 37 ° (приблизительно 2 мин).
- Ресуспендируют клеток в 9 мл основной рост средств массовой информации в 15 мл коническую трубку, а затем центрифуги в течение 2 мин при 1000 х г.
- Аспирата супернатант, стараясь при этом не нарушить осажденные клетки и осторожно ресуспендируют клетки в 10 мл основной рост Media.
- Пластина клеток на колбу Т-25 или 60 мм 2 блюдо.
- На следующий день, заменить носитель для удаления мертвых клеток.
5. День 0: Покрытие Клетки для дифференциации
- На рисунке 1 график дифференциации.
- Промыть недифференцированные клетки с 1x PBS, аспирация, а затем Trypsinize использованием 1-2 мл нагревают1x 0,05% Трипсин-ЭДТА.
- Когда клетки находятся в трипсин, инкубировать в течение примерно 3 мин в инкубаторе.
- Quench трипсина путем добавления 10 мл Базовая питательной среды, промыть стенки колбы или блюдо и осторожно растирают 1-3 раза. Передача содержимого конической трубе 15 мл.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 мкг в и аспирации СМИ, следя за тем, чтобы не нарушить гранул.
- Ресуспендируют осадок в 5 мл основной рост медиа и растирают 1-3 раза.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра, затем разбавить с помощью обычной питательной среды до 50000 клеток / мл.
- Пластина 2 мл клеток в 35 мм 2 блюдо на общую сумму 100000 клеток на чашку и поместите обратно в инкубатор.
6. День 1: Изменить Медиа (дифференциация Медиа # 1)
- Аликвотные 50 мл среде для дифференцировки # 1 (смотри Таблицу 2) и инкубировать на водяной бане 37 ° C.
- Когда средства массовой информации подогревают, дают ей, чтобы уравновесить в инкубаторе (37° C, 5% CO 2) в течение по крайней мере одного часа, чтобы установить надлежащий баланс рН до использования.
- Добавить ретиноевой кислоты (RA) (Таблица 1), чтобы нагретый и уравновешенной СМИ непосредственно перед добавлением средств массовой информации для блюд.
Примечание: ретиноевой кислоты является светочувствительным и должен храниться в темных бутылках при 4 ° С - Аккуратно аспирата от старых СМИ и выбросить.
- Добавить 2 мл дифференцировки # 1 с РА на 35 мм 2 блюдо и вернуться к инкубатора.
7. День 3: Изменение Медиа (дифференциация Медиа # 1)
- Повторите Раздел 6 (шаги 1-5)
8. День 5: Изменение Медиа (дифференциация Медиа # 1)
- Повторите Раздел 6 (шаги 1-5)
9. День 7: Разбить ячейки 1: 1
- Добавить РА нагревают и уравновешивают среде для дифференцировки # 1 непосредственно перед добавлением средств массовой информации для блюд.
- Аккуратно аспирата от старых СМИ и выбросить.
- Добавить 200 мклнагревают 0,05% 1x трипсин ЭДТА за 35 мм 2 блюдо и тепло в инкубаторе примерно 2-3 мин или до клеток заметно поднятого с пластины, как под микроскопом.
- Quench трипсина путем добавления 2 мл дифференцировки # 1 с РА за 35 мм 2 блюдо и использовать средства массовой информации для полоскания остальные нервных клеток от пластины. Затем перенесите содержимое в коническую пробирку на 50 мл.
Примечание: Во время обработки трипсином шагов, не Trypsinize слишком много блюд сразу. Это помогает обеспечить нейрональные культуры не инкубируют в трипсином слишком долго, который может быть цитотоксическое. - Объединить содержимое от до 10 блюд в 50 мл коническую трубку и осторожно растирают медленно вверх и вниз не более чем в пять раз с 10 мл пластиковый пипетки.
- Алиготе клеточной суспензии 2 мл в свежие 35 мм 2 блюд и вернуться к инкубатора.
10. День 8: Изменение Медиа (дифференциация Медиа # 2)
- Добавить RA (см <сильный> Таблица 1) нагревают и уравновешивают СМИ непосредственно перед добавлением средств массовой информации для блюд.
- Аккуратно аспирата от старых СМИ и выбросить.
- Медленно добавить 2 мл дифференцировки # 2 (таблица 2) с РА на 35 мм 2 блюдо и вернуться к инкубатора. Не позволяют нейронам подвергаться воздействию воздуха в течение длительного периода времени, поскольку они могут быстро высыхают.
11. День 9: Подготовка внеклеточного матрикса (ЕСМ) с покрытием Посуда
- Оттепель один флакон раствора ECM на льду и разбавляют 1: 100 в холодную DMEM.
- Разлить 2 мл смеси в каждую 35 мм 2 блюдо и обеспечить весь база блюдо покрывается.
- Место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2) в течение 1 ч или в течение ночи.
- Аспирируйте смесь и дайте высохнуть на воздухе в течение приблизительно 1 часа в капюшоне. Хранить при комнатной температуре в течение до 2 месяцев.
12. День 10: Передача клеток наECM пластинок, покрытых 1: 1
- Добавить RA (Таблица 1), чтобы нагретый и уравновешенной СМИ непосредственно перед добавлением средств массовой информации для блюд.
- Аккуратно аспирата от СМИ и выбросить.
- Добавить 200 мкл трипсина прогреваемых каждому 35 мм 2 блюдо и позволяют инкубировать при комнатной температуре в течение приблизительно 1-2 мин или до нейроны заметно поднял с блюда, как под микроскопом.
Примечание: Выполнить этот шаг трипсином при комнатной температуре, чтобы не переусердствовать инкубировать нейроны с трипсином и вызвать повреждения. Нейроны освободить от пластинок гораздо быстрее, чем эпителиальных клеток, как на данном этапе. - Quench трипсина путем добавления 2 мл дифференцировки # 2 за 35 мм 2 блюдо и использовать средства массовой информации для полоскания остальные нервных клеток от пластины. Затем перенесите содержимое в коническую пробирку на 50 мл.
- Объединить содержимое от до 10 блюд в 50 мл коническую трубку и осторожно растирают медленно вверх и вниз не более чем в пять раз с10 мл пластиковые пипетки.
- Разлить 2 мл клеточной суспензии в ECM-покрытием 35 мм 2 блюд и вернуться к инкубатора.
13. День 11: Изменение Медиа (дифференциация Медиа # 3)
- Добавить RA (Таблица 1), чтобы нагретый и уравновешенной СМИ непосредственно перед добавлением средств массовой информации для блюд.
- Аккуратно аспирата от старых СМИ и выбросить.
- Медленно добавить 2 мл дифференцировки # 3 (смотри таблицу 2) с РА за 35 мм 2 блюдо и вернуться к инкубатора. Не позволяют нейронам подвергаться воздействию воздуха в течение длительного периода времени.
14. День 14: Изменение Медиа (дифференциация Медиа # 3)
- Повторите Раздел 13 (шаги 1-3)
15. День 17: Последний Смена носителя (дифференциация Медиа # 3)
- Повторите Раздел 13 (шаги 1-3)
16. День 18: Нейронные Культуры готовы к использованию
- Изменение СМИ на свежий Differentiation Медиа # 3 с РА каждые 3 дня для поддержания здоровья нейронов.
Примечание: Клетки должны быть дифференцированы в нейроны и демонстрируют нейронный фенотип. Культуры обычно стабильны в течение 14 дней, следующих терминальной дифференцировки, однако длительность жизнеспособности нейронов зависит от проходного числа недифференцированных клеток в начале дифференциации. Большее число прохождение дают дифференцированные нейроны с более короткой полезной жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящее время существует много примеров в области нейробиологии и neurovirology где недифференцированные клетки SH-SY5Y которые используются в качестве функциональной модели для человека нейронов 27-36 и, что важно, недифференцированные клетки могут не фенотипов, такие как оптимального вирусного поглощения 2, которые необходимо для точной интерпретации. Очень важно, чтобы при использовании SH-SY5Y клетки или любой другой нейронную систему в пробирке, клетки соответствующим образом дифференцировать в нейроны, с тем чтобы получить данные, которые наилучшим представлением того, что может происходить в нейронах в естественных условиях. Вышеуказанные урожайность протокола высоко жизнеспособные, гомогенную дифференцированные нейрональные культуры в течение 18 дней, которые могут быть использованы для последующего биохимического и визуализации анализа. Клетки нейробластомы Недифференцированный SH-SY5Y демонстрируют большой плоский эпителиальных подобный фенотип с многочисленными короткими процессов, проходящих наружу (Фигура 2А), в то время как дифференцированной клеткиы обладают несколько нейритными прогнозы, которые подключаются к окружающими клетками (рис 2b). Важно, что при дифференцировании клетки SH-SY5Y, клетки инкубируют с трипсином в течение минимального промежутка времени, чтобы гарантировать, что только нейроны освобождаются от чашки. Это оставляет недифференцированных эпителиальных клеток, которые иначе загрязняют дифференцированный нейронную популяцию клеток. Нейронные характеристики полностью дифференцированных клеток SH-SY5Y демонстрируются с помощью таких методов, как обнаружение иммунофлюоресценции классических нейронных маркеров (рисунок 3).
SH-SY5Y клетки демонстрируют различные фенотипы в ходе дифференцировки и важно, чтобы быть в состоянии определить здоровые нейроны от тех, которые подчеркнуты. На дифференцировки день 1, до введения среде для дифференцировки # 1, клетки имеют плоскую, втянутого фенотип с короткой, короткими процессов (фиг.4А).После 5 дней в сыворотке лишения, SH-SY5Y клетки начинают развиваться более длинными отростками и продемонстрировать более нейронов фенотип (рис 4б). Пассирование суровая процесс клеток SH-SY5Y, а также в дни сразу после пассирования клетки появляются нездоровым. Об этом свидетельствует слипания клеточного тела и наличием меньше, короче процессов. (См Перед изображений: рисунки 4C и 4E, и после изображений: Фигуры 4D и 4F). Примерно через 48 часов после раскола, клетки появляются восстанавливаться, и полностью зрелые, дифференцированные нейроны получают в день 18 (рис 2В). Об этом свидетельствуют сокращения слипания тела клетки, и расширение многочисленными тонкими, разветвленными нейритными процессы, которые часто подключаются к соседним сотам.
Факторы, которые необходимы для получения воспроизводимых и жизнеспособных нейронов культур включают использование инактивированной нагреванием FBS, минимизируя трипсина инкубацииВремя, и нежный растирание. Важно отметить, что этот протокол подробно использование четырех различных составов СМИ с различными концентрациями hiFBS, тем самым создавая нежный переход в сыворотке голодали государства для клеток. Когда зрелые клетки SH-SY5Y здоровы, они демонстрируют многочисленные прогнозы, которые подключаются к окружающим нейронов (рис 5А). Следует отметить, что отличительной эпителиальных фенотип обойдет нейронные культуры, если они неправильно во время процесса дифференцировки (рис 5B). Кроме того, если нейроны начинают умирать, невриты убирается, клеточные тела начнут слипаться и округлить, и мусор из аксонов дегенерации начнет накапливаться в и вокруг клеточных процессов. Этот процесс сродни тому, что демонстрируется на фиг 5С и 5D. В то время как 5С показывает более естественное развитие клеточной смерти следующую питательную и экологической депривации,Рисунок 5D показывает дифференцированные SH-SY5Y нейронов 4 ч после инфицирования с ВПГ-1 штамм, Кос, при множественности инфекции (MOI) 10 6 БОЕ. Этот протокол был тщательно оптимизирован в лабораторных и дает воспроизводимые, однородных популяций нейронов, которые имеют важное значение для последующих анализов и экспериментов.
Рисунок 1:. Расписание процедуры дифференциации Процесс дифференциации состоит из 11 шагов разложенные в течение периода 18 дней. В первый день протокола дифференцировки (день 0), между 25000 и 100000 клеток высевали на непокрытых мм чашках 35. В дни 1, 3, 5 и, старый среду удаляют и дифференциация Медиа # 1 применяется. На 7-й день, клетки делятся 1: 1 на непокрытых 35мм блюд в среде для дифференцировки # 1. На 8-й день, средства массовой информации меняется на дифференциацииМедиа # 2, а на 10-й день, клетки снова разделить 1: 1, но на этот раз на ECM-покрытием 35 мм чашках в среде для дифференцировки # 2. В дни 11, 14, и 17, старый среду удаляют и дифференциация Медиа # 3 применяется. На 18 день, дифференцированные нейроны готовы использовать для последующих применений.
Рисунок 2:. Морфологические появление недифференцированных и дифференцированных клеток SH-SY5Y (А) Недифференцированный SH-SY5Y клетки имеют плоскую фенотип с нескольких проекциях в то время как (B) дифференцированные SH-SY5Y нейроны демонстрируют широкие и удлиненные нейритными прогнозы. Изображения были получены в фазе при 20X увеличении с использованием инвертированного микроскопа эпифлуоресцентной.
Рисунок 3:Маркеры дифференцировка нейронов. Иммунофлуоресценции освещает нейронные функции полностью дифференцированных клетках SH-SY5Y. (А) Анти-SMI31 (зеленый) окрашивает фосфорилированный нейрофиламентов Н в обширной сети невриты. (B) Anti-КАРТА 2 (красный) этикетки, ассоциированный с микротрубочками белок 2, раскрывая нейронов сому и проксимального участка невриты. Соответствующий фазовое изображение для каждой панели иммунофлюоресценции показано справа. Изображения были получены при 10Х с использованием перевернутый эпифлуоресцентной микроскопа. Масштаб бар, 100 мкм.
Рисунок 4: Промежуточные стадии протокола дифференцировки (А) День 1 дифференцировки.. Клетки поддерживать восстанавливаемую фенотип с короткими выступами. (B) День 5 дифференциации. Клетки были подвержены 5 деньs сывороточного лишения (дифференциация Медиа # 1). Выжившие клетки начинают удлиняться и образуют длинные процессы, которые соединяют с соседними клетками. (C) День 7 дифференциации предварительного разделить. Клетки продемонстрировать большое число длинных процессов, с меньшим количеством числа клеток, демонстрирующих эпителиальных фенотип. (D) День 8 дифференциации, на следующий день после первого прохода. После расщепления, клеточные тела образуют комки и процессы появляются короткие в результате процедуры пассирования. (Е) День 10 дифференцировки, до разделить на ECM-покрытием пластин. Клетки продемонстрировать длинные процессы, которые делают связь с близлежащих клеток. Сотовый тело кластеризации также очевидно. (F) 11 день дифференциации, один день после второго раскола. Клетки подчеркнул после второго прохода и многие нейроны в итоге потеряли. Тем не менее, остальная часть населения является жизнеспособным, однородная, и нейронов фенотипа. Сотовые тела производят лARGER кластеры и процессы начинают излучать от основания кластеров.
Рисунок 5:. Эпителиальный разрастание и гибель нейронов - два альтернативных результаты процесса дифференцировки (А) Здоровый, зрелые нейроны SH-SY5Y продемонстрировать диффузные аксонов проекции, соединяющиеся с соседними клетками. (Б) В некоторых случаях, клетки с дополнительной эпителиального типа фенотипа обогнать культур на обслуживание. Это перенаселение эпителиальных-подобных клеток может быть связано с редким пассирования культур обслуживанию. Эти культуры должны быть отброшены, а эпителиальные-подобные клетки будут продолжать численно превосходят нейроны. Стрелки обозначают эпителиальные типа клеток. (С) При SH-SY5Y клетки являются нездоровыми и начинают умирать, клеточные тела окружить и процессы деградации, создавая значительное количество мусора. (D 10 6 ОРП.
| Компонент | Детали | Акции | инструкции | ||||
| 10 мкМ РА | Полностью транс-ретиноевая кислота | 5 мм | Ресуспендируют 50 мг RA в 33,3 мл 95% этанола. РА чувствителен к теплу, свету и воздуху. Хранить в темной бутыли и хранят при температуре 4 ° С в течение до 6 недель. Использование при разведении 1: 500 и разбавить в среде для дифференцировки непосредственно перед применением | ||||
| (300,44 г / моль) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Дополнение | 50x | Оттепель 1-10 мл бутылку и аликвоты остатка на аликвоты одноразовые 1 мл и хранят при -80 ° С. Магазин 10 мл бутылки при -20 ° С | ||||
| 20 мМ КСl | Хлорид калия | 1 М | Добавить 250 мл воды до 18,6 г KCl и стерильный фильтр. Хранить при комнатной температуре | ||||
| (74,55 г / моль) | |||||||
| 2 мМ DB-цАМФ | дибутирил цАМФ | 1 М | Ресуспендируют полную бутылку, добавив 2,04 мл воды до 1 г DB-цАМФ. Чувствительный к свету и влаге. Хранить в аликвоты 100 мкл или 200 мкл на обоих -20 ° С или -80 ° С | ||||
| (491,37 г / моль) | |||||||
| 50 нг / мл BDNF | Мозговой нейротрофический фактор (BDNF) | - | Центрифуга флакон, чтобы получить порошок вниз.60; Ресуспендируют 10 мкг флакон в 1 мл Neurobasal + 1x В27 или 5 мкг флакон в 0,5 мл Neurobasal + 1x B27, чтобы получить 10 мкг / мл. Использование при разведении 1: 200. Магазин рабочих аликвоты при -80 ° С (например: 250 мкл) | ||||
| hiFBS | Термоинактивировали фетальной бычьей сыворотки | - | Алиготе оттаивают FBS в 50 мл конические пробирки. Нагревают при 56 ° С на водяной бане в течение 30 мин. Удалить и заморозить рабочие аликвот при -20 ° C | ||||
Таблица 1: Исходные растворы и компоненты.
| Основной рост Медиа | ||
| Компонент | Объем 500 мл | разбавление |
| ЕМЕМ | 415 мл ЕМЕМ | |
| 15% hiFBS | 75 hiFBS мл | |
| 1x пен / стреп | 5 мл Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 мМ глутамина | 5 мл Глютамин | 1: 100 |
| * Держите для максимума 6 недель | ||
| Дифференциация Медиа # 1 | ||
| Компонент | Объем 50 мл | разбавление |
| ЕМЕМ | 48 мл ЕМЕМ | |
| 2,5% hiFBS | 1.3 hiFBS мл | |
| 1x пен / стреп | 500 мкл Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 мМ глутамина | 500 мкл Глютамин | 1: 100 |
| 10 мкМ РА | 100 мкл РА (5 мМ АО) | 1: 500 |
| * Держите в течение 2 недель максимум и добавить RA непосредственно передиспользовать | ||
| * Не держите дополнительный носитель сразу добавляется РА - РА неустойчиво | ||
| Дифференциация Медиа # 2 | ||
| Компонент | Объем 50 мл | разбавление |
| ЕМЕМ | 49 мл ЕМЕМ | |
| 1% hiFBS | 500 мкл hiFBS | |
| 1x пен / стреп | 500 мкл Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 мМ глутамина | 500 мкл Глютамин | 1: 100 |
| 10 мкМ РА | 100 мкл РА (5 мМ АО) | 1: 500 |
| * Держите в течение 2 недель максимум и добавить РА непосредственно перед применением | ||
| * Не держите дополнительный носитель наCE РА добавляют - РА неустойчиво | ||
| Дифференциация Медиа # 3 | ||
| Компонент | Объем 50 мл | разбавление |
| Neurobasal | 47 мл Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 мл B-27 (50X акции) | 1:50 |
| 20 мМ КСl | 1 мл KCl (1 М раствор) | 1:50 |
| 1x пен / стреп | 500 мкл Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 мМ GlutamaxI | 500 мкл GlutamaxI (100x АО) | 1: 100 |
| 50 нг / мл BDNF | 250 мкл BDNF складе (10 мкг / мл) | 1: 200 |
| 2 мМ дибутирил цАМФ (DB-цАМФ) | 100 мкл DB-цАМФ (1 М раствор) | 1: 500 |
| 10 мкМ РА | 100 мкл РА (5 мМ исходный) | 1: 500 |
| * Держите в течение 2 недель максимум и добавить РА непосредственно перед применением | ||
| * Не держите дополнительный носитель сразу добавляется РА - РА неустойчиво | ||
Таблица 2: СМИ рецепты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выше протокол обеспечивает простой и воспроизводимый метод для создания однородных и жизнеспособных нейронов культур человека. Этот протокол использует методы и практики, которые объединяют несколько ранее опубликованных методов 1-4 и цели очертить лучшие практики друг. Дифференциация SH-SY5Y клеток зависит от постепенного сыворотки лишения; добавление ретиноевой кислоты, нейротрофических факторов и белков внеклеточного матрикса; и серийный расщепление выбрать для дифференцированных зрелых прилипших нейронов. Эта клеточная линия начинается в гетерогенной популяции адгезивных и взвешенных клеток. Этот протокол направлен на сохранение обеих популяций путем удержания PBS моет перед тем пассирования или медиа изменения, но некоторые потери взвешенных клеток необходимо учитывать удаление мертвых клеток эпителия. Представленный метод производит гомогенную популяцию дифференцированных нейронов человеческого SH-SY5Y для дальнейших экспериментов.
Хотя флористикуг агенты могут быть использованы, чтобы направлять дифференцировку нейронов в холинергической или адренергической фенотипа 16,17, использование RA дифференцировать клетки SH-SY5Y был использован ранее для получения нейроны с фенотипом дофаминергической 37,38. Добавление РА было показано, чтобы вызвать клеточную дифференцировку посредством ряда механизмов, в том числе остановить прогрессирование клеточного цикла из G0 / G1, увеличивая экспрессию циклин-зависимой киназы (CDK) ингибиторов p21 и p27 Kip1 и антиапоптические белков Bcl -2 и Bcl-XL, и повышение / AKT активности PI3K, который играет роль в развитии аксонов и дифференциации 39.
Крайне важно во время выполнения этого протокола использовать нежные и стерильные методы обработки, а SH-SY5Y клетки очень чувствительны к внезапному изменению. Именно из-за этой чувствительности, что постепенное протокол сыворотки лишение предпочтительнее протоколов, которые требуют решений быстрые изменения в MedIA состав. При разделении клетки на дни 7 и 10, важно, чтобы свести к минимуму количество времени, что частично дифференцированные нейроны проводят в трипсин. Это уменьшает вероятность разрушительных нейронов и способствует преимущественное высвобождение нейронов по сравнению с эпителиальных клеток, которые принимают больше времени, чтобы отделить. Это помогает создать более однородную нейронную популяцию клеток и свести к минимуму загрязнение с Пролиферирующий и недифференцированных эпителиальных клеток. Важно также отметить, реактивы, используемые для культивирования и дифференцировки клеток SH-SY5Y должны быть заменены регулярно и не храниться неограниченно долго. Например, основной рост средств массовой информации может быть до 6 недель, пока Дифференциация Медиа должны храниться только до 2 недель. Это гарантирует реагенты, такие как dbcAMP и BDNF свежие и стабильной. Кроме того, подготовлен РА должны храниться только в течение 6 недель и в темноте, прежде чем свежая порция должна быть сделана. Мы наблюдали большую согласованность нервных результатов шIth этих мер предосторожности.
Как только клетки были дифференцированы в зрелые нейроны, они могут сохраняться в течение до 2 недель после терминальной дифференцировки и используется для экспериментов. После терминальной дифференцировки, средства массовой информации должны быть изменены каждые 3-4 дня (дифференцировки # 3). В отличие от дифференцированных нейронов, колбы обслуживание, содержащие недифференцированные культур SH-SY5Y клеток может храниться в течение многих недель при регулярном пассажей. Важно культур обслуживанию проход регулярно, чтобы предотвратить чрезмерное населения эпителиальных-подобных клеток, которые больше не способны дифференцироваться в нейроны. Когда эти клетки больше, чем те, с нервно-потенциала, сывороточного голодания вызовет непропорционально количество клеточной смерти. Undifferentiated культуры можно поддерживать только на протяжении приблизительно 15 пассажей. Как только культура превысил около 15 проходов, недифференцированные клетки начинают умирать и иметь шероховатую, нездоровый вид. Кроме того, диффереференцирование высокого прохода SH-SY5Y клеток сложнее, так как меньше клетки выживут каждый раскол, и те, которые делают часто агрегировать оба тела и аксоны клеток, что делает последующий анализ сложнее.
Существует четкая уменьшение количества клеток в процессе дифференцировки, как многие клетки потеряли или не выжить процесс расщепления. Поэтому, в начале любого эксперимента с участием дифференцированные клетки SH-SY5Y, следует учитывать ~ 30-40% потери нейронов и обеспечить надлежащее количество клеток высевали в начале, чтобы достичь желаемого выхода. В то время как покрытие 100000 клеток производит много здоровых, зрелых нейронов SH-SY5Y, меньше или больше числа могут быть изначально гальваническим зависимости от экспериментальной необходимости.
Понятно, что полностью дифференцированные нейроны SH-SY5Y обеспечить более тесное приближение зрелого человеческого нейронов, найденных в естественных условиях, чем делать их недифференцированные коллеги клеток-предшественников (рисунок 2). Эти нейроны обеспечит выгодное модель для будущих характеристик их нейробиологии, для изучения нейротропных вирусов, или для скрининга химиотерапевтического токсичности в нейронах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
