Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53193
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

Introduction

היכולת להשתמש במערכות מודל במבחנה שיפרה מאוד בתחומי נוירוביולוגיה מדעי המוח. תאים בתרבית לספק פלטפורמה יעילה לאפיין פונקציונליות חלבון מנגנונים מולקולרי תופעות ספציפיות בסיסיות, להבין את הפתולוגיה של מחלות וזיהומים, וכדי לבצע הערכות בדיקות סמים ראשוניות. בנוירוביולוגיה, הסוגים העיקריים של מודלי תרבית תאים כוללים תרבויות עצביות עיקריות נגזרו חולדות ועכברים, שורות תאי נוירובלסטומה כגון תאי העכברוש B35 5, בתאים עכבר נוירו-2A 6, ותאי PC12 עכברוש 7. למרות השימוש של שורות תאים כאלה התקדמה בתחום מזה, אך קיימים מספר גורמים מבלבלים הקשורים בטיפול הלא-אנושי תאים ורקמות. אלה כולל מינים ספציפי הבנת הבדלים בתהליכי חילוף חומרים, פנוטיפים של ביטוי מחלה, בפתוגנזה בהשוואה לבני אדם. כמו כן, חשוב לציין כימחדש הבדלים משמעותיים בין עכבר ביטוי גנים אנושיים ואיתות גורם שעתוק, המדגישות את המגבלות של מודלים מכרסמים ואת החשיבות של הבנה אשר מסלולים שמורה בין מכרסמים ובני אדם 8-11. אחרים המועסקים השימוש של שורות תאים עצביים האנושי כולל N-Tera-2 (NT2) בקו האנושי teratocarcinoma התא בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה (iPSCs). שורות תאים אלה מספקים מודל טוב במבחנת מערכות אדם. עם זאת, התמיינות של תאי NT2 עם חומצה רטינואית (RA) תוצאות בדור של אוכלוסייה המעורבת של נוירונים, האסטרוציטים, ותאי גלייה רדיאלי 12, דבר מחייב צעד טיהור נוסף כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של נוירונים. בנוסף, תאי NT2 להפגין קריוטיפ משתנה מאוד 13, עם יותר מ -60 כרומוזומים 72% של תאים. iPSCs להפגין השתנות בידול בין שורות תאים שונות, ונבדלים זה מזה יעיל בידול 14. לכן רצוי שיהיה מודל תאים עצבי אדם עקבי לשחזור כדי להשלים חלופות אלה.

SH-SY5Y תאים דמויי neuroblast הם subclone של הקו הסלולרי נוירובלסטומה הורית SK-N-SH. שורת תא ההורים נוצרה בשנת 1970 מתוך ביופסית מח עצם המכיל את שני neuroblast דמוי תאים דמויים אפיתל 15. יש תאי SH-SY5Y קריוטיפ יציב המורכב של 47 כרומוזומים, והוא יכול להיות מובחן ממצב neuroblast הדמוי אל הנוירונים שמהם מתפתחים שורה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים שונים כולל שימוש RA, אסטרים phorbol, ו neurotrophins הספציפי כגון מוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF). ראיות לפני עולה כי שימוש בשיטות שונות ניתן לבחור עבור תת נוירונים ספציפיים כגון אדרנרגיים, כולינרגית, ו נוירונים דופאמינרגיים 16,17. ההיבט השני הזה גורם לתאי SH-SY5Y שימושי עבור מספר רב של ניסויים לנוירוביולוגיה.

ontent "> מספר מחקרים הראו ההבדלים חשובים בין תאי SH-SY5Y במדינות המובחנות בדיל שלהם. כאשר תאי SH-SY5Y הם מובחנים, הם מתרבים במהירות להיראות בלתי מקוטב, עם מעט מאוד, תהליכים קצרים. הם לרוב גדלים בגושים ולהביע סמנים המעידים על נוירונים בשלה 18,19. כאשר בדיל, תאים אלה להאריך ארוכים, מסועפים תהליכים, ירידה בהתרבות, ובמקרים מסוימים לקטב 2,18. תאי SH-SY5Y בדיל באופן מלא כבר הוכיחו בעבר להביע מגוון של סמנים שונים של נוירונים בוגרים לרבות גידול הקשורים החלבון (GAP-43), גרעינים עצביים (NeuN), synaptophysin (SYN), הסינפטי שלפוחית ​​חלבון II (SV2), נוירון אנולאז ספציפי (NSE) ו microtubule הקשורים החלבון (MAP) 2,16,17,20, ואת חוסר ביטוי של סמנים גליה כגון חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) 4. ב תמיכה נוספת שהבדילו SH-SY5Y תאים represeNT אוכלוסייה עצבית הומוגנית, הסרת BDNF התוצאה הסלולר אפופטוזיס 4. הדבר מצביע על כך ששיעור ההישרדות של תאי SH-SY5Y בדיל תלוי בגורמים תזונתיים, בדומה להבשיל נוירונים.

השימוש בתאי SH-SY5Y גדל מאז subclone הוקם בשנת 1978 3. כמה דוגמאות של השימוש שלהם כוללות חוקרת מחלת פרקינסון 17, מחלת אלצהיימר 21, ו בפתוגנזה של זיהום ויראלי כולל poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 אבעבועות רוח, שלבקת חוגרת, וירוס (VZV) 1, ציטומגלווירוס אדם 25, ו נגיף הרפס סימפלקס (HSV) 2,26. חשוב לציין כי מספר מחקרים באמצעות תאי SH-SY5Y השתמשו בתאים אלה בצורתם המובחנת, במיוחד בתחום neurovirology 27-36. ההבדל הפנוטיפ הנצפה של מובחן לעומת תאי SH-SY5Y בדיל מעלה את שאלת wheיס את התקדמות הזיהום נצפה יהיה שונה נוירונים בדיל בוגרים. לדוגמה, תאים SH-SY5Y הבדיל יש יעילות גבוהה יותר של ספיגת HSV-1 לעומת תאים שלא עברו התמיינות, SH-SY5Y מתרבים, אשר יכול להיות בגלל חוסר הקולטנים אשר נקלטות HSV ולווסת הכניסה על תאים SH-SY5Y מובחן 2. לכן זה קריטי כי בעת תכנון ניסוי התמקד בבדיקת נוירונים במבחנה, תאים SH-SY5Y צריך להיות מובחן על מנת לקבל את התוצאות המדויקות ביותר עבור תרגום השוואה למודלים in vivo.

פיתוח שיטה אמינה לייצר תרביות נוירונים אדם הוא הכרחי כדי לאפשר לחוקרים לבצע ניסויי translational במדויק מודל מערכת עצבים אנושי. הפרוטוקול המובא כאן הוא הליך תוחם מומלצים נגזר שיטות קודמות 1-4 להעשיר נוירונים אדם נחלקיםבאמצעות חומצה רטינואית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיקולים כלליים

  1. ראה טבלה של חומרים / ציוד כדי לקבל רשימה של ריאגנטים הצורך. ביצוע כל הצעדים בתנאים aseptic קפדנית.
  2. השתמש בסרום שור עובר חום המומת (hiFBS) עבור כל הכנות מדיה הכוללת FBS. כדי לחמם-להשבית, לחמם aliquot 50 מ"ל של FBS ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, היפוך כל 10 דקות (ראה גם לוח 1).
    הערה: כאשר FBS משמש ללא-איון חום, את הפנוטיפ דמוי אפיתל מתקדמת מהר יותר לאורך בתרביות תאים SH-SY5Y.
  3. לפני השימוש, לאפשר התקשורת לחמם לאזן באינקובטור כדי ליצור איזון pH תקין לפני כל צעד. לדוגמה, 50 מ"ל של התקשורת לוקח כשעה כדי לאזן באופן מלא (pH 7, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    הערה: פרוטוקול זה משתמש הליך פיצול שני שלבים הדורש תאים מובחנים חלקית SH-SY5Y להיות trypsinized מחדש מצופה. זהו מלחיץתהליך התאים שברירי במיוחד אלה. לכן, חשוב כדי לדגור התאים טריפסין עבור כמות מינימלית של זמן. זה יאפשר עבור ההמראה המועדפת של נוירונים, עזב דמוי תאי אפיתל עדיין מחובר המנה.
  4. בצע טחינה דקה של תאים מובחנים לאט עם pipet פלסטיק 10 מ"ל עם קצה נגד התחתון של צינור חרוטי המכיל את התאים. בצע טחינה דקה במהירות איטית, מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים.

2. מעבר של תרבויות תחזוקה SH-SY5Y

  1. תרבויות תחזוקת פיצול כאשר התאים הגיעו 70-80% confluency, ואל תעלה על 10 עד 15 קטעים. תרבויות בדרך כלל צריכות להיות passaged כל 3-5 ימים (תרבויות בהנחה אינן מדוללות יותר פי 5 במהלך הפיצול).
  2. עד היום תאים קטע מתוך בקבוק T-75, לשאוב את התקשורת, ולאחר מכן לשטוף עם כ 10 מ"ל 1x PBS.
    הערה: איננו ממליצים לפצל את פו תרבויות תחזוקה SH-SY5Yrther מ -1: 5 במהלך passaging כיוון שהדבר עלול לגרום לתאים למות בשל confluency נמוכה.
  3. לשאוב PBS, ולאחר מכן להוסיף 2.5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (1x).
  4. מדגירים דקות חממה 2-3 ולהטות בעדינות כדי לשחרר תאים מפני השטח של הבקבוק.
  5. הוסף 10 מיליליטר תקשורת צמיחת יסוד (ראה טבלה 2) ו triturate 1-2 פעמים.
  6. ספין למטה במשך 2 דקות XG ב 1000, תקשורת לשאוב, ואז resuspend גלולה ב 5 מיליליטר מדיה צמיחה בסיסית.
  7. לדלל תאים 1: 3 ל -1: 5 בנפח כולל של 20 מ"ל עבור ציפוי נורמלי בקבוק T-75, או לספור צלחת לבידול (סעיף 5).

3. תאים מקפיאים SH-SY5Y

  1. להקפיא קטעים מוקדמים של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y בתקשורת צמיחה בסיסית בתוספת 5% (v / v) DMSO.
  2. בתחילה, להקפיא aliquots ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: לצורך הפניה, ומחוברות (75-85%) בקבוק T-75 תניב חמש1 מ"ל aliquots של תאים SH-SY5Y להקפאה. כל אחד aliquots אלה יכילו מקום בין 2-5 מיליון תאים בסך הכל.

4. הפשרה והתרבות המובחנת SH-SY5Y תאי נוירובלסטומה

  1. כן תקשורת צמיחה בסיסית.
  2. במהירות להפשיר תאים קפואים בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס (כ 2 דקות).
  3. תאים Resuspend ב 9 מ"ל מדיה צמיחה בסיסי בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל, ואז צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1000 x ז.
  4. לשאוב supernatant תוך הקפדה שלא להפריע את תאי pelleted, ותאי resuspend בעדינות 10 מיליליטר תקשורת צמיחה בסיסית.
  5. תאי פלייט על בקבוק T-25 או 60 מ"מ 2 צלחת.
  6. למחרת, להחליף תקשורת להסיר תאים מתים.

5. יום 0: תאי ציפוי לבידול

  1. ראה איור 1 עבור לוח זמני בידול.
  2. לשטוף תאים שלא עברו התמיינות עם 1x PBS, לשאוב, ולאחר מכן trypsinize באמצעות 1-2 מ"ל חימם1x 0.05% טריפסין- EDTA.
  3. כאשר התאים נמצא טריפסין, דגירה במשך כ 3 דקות באינקובטור.
  4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל התקשורת צמיחה בסיסי, יש לשטוף את הצדדים של הבקבוק או צלחת, בעדינות triturate 1-3 פעמים. העבר תוכן אל צינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000, ואת לשאוב התקשורת תוך הקפדה שלא להפריע את הכדור.
  6. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר מדיה צמיחה בסיסית triturate 1-3 פעמים.
  7. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ואז לדלל באמצעות התקשורת צמיחה בסיסי מקסימלי של 50,000 תאים / מ"ל.
  8. פלייט 2 מ"ל של תאים לכל 35 מ"מ 2 צלחת עבור סכום כולל של 100,000 תאים לכל צלחת ומניחים בחזרה לתוך החממה.

6. יום 1: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

  1. Aliquot 50 מ"ל של בידול מדיה # 1 (ראה טבלה 2) דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  2. כאשר התקשורת היא חיממה, ולאפשר לו לאזן באינקובטור (37מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לפחות שעה אחת כדי ליצור איזון pH נאותה לפני השימוש.
  3. הוספת החומצה הרטינואית (ע"ר) (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
    הערה: חומצה רטינואית אור רגיש צריך להיות מאוחסן בקבוקי בחושך ב 4 ° C
  4. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  5. הוסף 2 מ"ל בידול מדיה # 1 עם RA לכל 35 מ"מ 2 צלחת ולחזור חממה.

7. יום 3: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

  1. סעיף 6 חזור (שלבים 1-5)

8. יום 5: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

  1. סעיף 6 חזור (שלבים 1-5)

9. יום 7: תאי פיצול 1: 1

  1. להוסיף RA כדי התחמם equilibrated בידול מדיה # 1 מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  3. הוסף 200 μl1x טריפסין EDTA 0.05% לכל צלחת 35 מ"מ 2 וחמים החממה חיממו כ 2-3 דקות או עד התאים הם הרימו בעליל מהצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
  4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מדיה בידול מ"ל # 1 עם RA לכל 35 מ"מ 2 צלחת ו להשתמש בתקשורת כדי לשטוף הנותרים תאים עצביים מצלחת. ואז להעביר תכנים אל צינור חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: במהלך trypsinization צעדים, לא trypsinize יותר מדי מנות בבת אחת. פעולה זו מסייעת להבטיח תרביות נוירונים אינם וטופחו טריפסין במשך זמן רב מדי, אשר יכול להיות ציטוטוקסיות.
  5. שלב תוכן ממרחק של עד 10 מנות בצינור חרוטי 50 מ"ל בעדינות triturate באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עם pipet פלסטיק 10 מ"ל.
  6. Aliquot ההשעיה תא 2 מ"ל לתוך מנות טריות 35 מ"מ 2 ולחזור חממה.

10. יום 8: מדיה שינוי (# 2 מדיה בידול)

  1. להוסיף RA (ראה <strong> טבלה 1) כדי התחממה equilibrated תקשורת מייד לפני הוספת תקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  3. לאט לאט להוסיף 2 מ"ל בידול מדיה # 2 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 35 מ"מ 2 ולחזור חממה. אל תאפשר נוירונים להיות חשופים לאוויר במשך תקופה ארוכה של זמן כפי שהם יכולים להתייבש מהר.

11. יום 9: כן מטריקס (ECM) צלחות מצופות

  1. להפשיר בקבוקון אחד של פתרון ECM על קרח לדלל 1: 100 לתוך DMEM קר.
  2. לוותר על 2 מ"ל של התערובת לתוך כל מנה 35 מ"מ 2 ולהבטיח את הבסיס כולו של המנה מכוסה.
  3. מקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור שעה 1 או לילה.
  4. תערובת לשאוב ולאפשר לאוויר יבש עבור כ 1 hr במנדף. אחסן בטמפרטורת החדר עד 2 חודשים.

12. יום 10: העברת תאים עלצלחות ECM מצופות 1: 1

  1. להוסיף RA (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את התקשורת וזורקת.
  3. הוסף 200 μl חימם טריפסין על כל מנה 35 מ"מ 2 ולאפשר כדי לדגור בטמפרטורת החדר למשך כ 1-2 דקות או עד נוירונים הם הרימו בעליל מצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
    הערה: Execute trypsinization שלב זה בטמפרטורת החדר כדי לא להפריז דגירה הנוירונים עם טריפסין ולגרום נזק. נוירונים לשחרר מצלחות הרבה יותר מהר מאשר תאים דמויי אפיתל בשלב זה.
  4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל בידול מדיה # 2 לכל 35 מ"מ 2 צלחת ולהשתמש בתקשורת לשטוף הנותרים תאים עצביים מצלחת. ואז להעביר תכנים אל צינור חרוטי 50 מ"ל.
  5. שלב תוכן ממרחק של עד 10 מנות בצינור חרוטי 50 מ"ל בעדינות triturate באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עםpipet פלסטיק 10 מ"ל.
  6. לוותר על 2 מ"ל תרחיף תאים לתוך ECM מצופה 35 מ"מ 2 מנות ולחזור חממה.

13. יום 11: מדיה שינוי (מדיה בידול # 3)

  1. להוסיף RA (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  3. לאט לאט להוסיף 2 מ"ל בידול מדיה # 3 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 35 מ"מ 2 ולחזור חממה. אל תאפשר נוירונים להיות חשופים לאוויר במשך תקופה ארוכה של זמן.

14. יום 14: מדיה שינוי (מדיה בידול # 3)

  1. מקטע חוזר 13 (שלבים 1-3)

15. יום 17: שינוי מדיה האחרון (בידול מדיה # 3)

  1. מקטע חוזר 13 (שלבים 1-3)

16. יום 18: תרבויות עצביות מוכנות להשתמש

  1. שינוי תקשורת כדי הגירסות טריותerentiation מדיה # 3 עם RA כל 3 ימים כדי לשמור על בריאות הנוירון.
    הערה: תאים צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים ולהציג פנוטיפ עצבית. תרבויות הן בדרך כלל יציבה עד 14 יום לאחר בידול הטרמינל, אולם משך הכדאיות נוירון תלויה במספר המעבר של תאים שלא עברו התמיינות בתחילת בידול. מספרים מעבר גבוהים יותר מניבות נוירונים בדיל עם אורך חיים שימושי קצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נכון לעכשיו, ישנם מקרים רבים בתחום נוירוביולוגיה neurovirology שבו תאים SH-SY5Y מובחן נמצאים בשימוש כמודל פונקציונלי עבור נוירונים האדם 27-36, וחשוב מכך, תאים שלא עברו התמיינות עשוי היעדר פנוטיפים כגון ספיגת ויראלי אופטימלי 2 כי הם הכרחי פרשנות מדויקת. זה קריטי, כי בעת שימוש תאים SH-SY5Y או כל סוג אחר במבחנה המערכת העצבית, תאים הם מובחנים כראוי לתוך הנוירונים, על מנת לקבל נתונים כי הוא הייצוג הטוב ביותר האפשרי של מה שעשוי להיות המתרחשים נוירונים in vivo. התשואות בפרוטוקול לעיל ביותר קיימא, הומוגנית, תרביות נוירונים הבדילו בתוך 18 ימים, כי ניתן להשתמש עבור ביוכימיים הדמיה הבאה מנתח. SH-SY5Y המובחן תאי נוירובלסטומה להפגין פנוטיפ גדול, שטוח, אפיתל דמוי עם תהליכים קצרים רבים המתמשכים (איור 2 א), תוך תא בדילים להחזיק כמה תחזיות מדלקת עצבים המתחברים התאים שמסביב (איור 2 ב). חשוב שכאשר הבחנת תאי SH-SY5Y, תאים מודגרת עם טריפסין למשך פרק מינימאלי של זמן על מנת להבטיח כי נוירונים רק משתחררים מהצלחת. זה משאיר מאחורי תאי אפיתל המובחנים שאחרת לזהם את אוכלוסיית התאים העצביות בדיל. המאפיינים העצביים של תאים מובחנים מלא SH-SY5Y מודגמים על ידי טכניקות כגון זיהוי immunofluorescence של סמנים עצביים קלסיים (איור 3).

תאי SH-SY5Y להפגין מגוון של פנוטיפים שונים במהלך התמיינות וזה חשוב להיות מסוגל לזהות נוירונים בריאים מאלו לחוצים. על בידול יום 1, לפני כניסתה של # 1 בידול מדיה, יש תאים פנוטיפ שטוח, חזר בו עם קצר, תהליכים קצרים (איור 4 א).בעקבות 5 ימים של קיפוח בסרום, תאי SH-SY5Y מתחילים לפתח תחזיות כבר ולהפגין פנוטיפ עצבית יותר (איור 4 ב). Passaging היא תהליך קשה עבור תאים SH-SY5Y, ובימים שלאחר passaging, תאים להופיע בריא. עדות לכך היא clumping גוף התא ואת הנוכחות של פחות, תהליכים קצרים. (ראה לפני תמונות: דמויות 4C ו 4E, ואחרי תמונות: 4D דמויות 4F). כ -48 שעות לאחר פיצול, תאים להופיע להתאושש, בשלה לחלוטין, נוירונים בדיל מתקבלים על יום 18 (איור 2 ב). עדות לכך היא צמצום clumping גוף התא, והרחבה של רבים דק, מסועף תהליכים מדלקת עצבים, כי לעתים קרובות להתחבר תאים שכנים.

גורמים חיוניים להשגת תרביות נוירונים לשחזור קיימא כוללים שימוש FBS חום מומת, מזעור דגירת טריפסיןזמן, טחינה דקה ועדינה. חשוב לציין, פרוטוקול זה מפרט את השימוש ארבעה ניסוחי מדיה שונים עם ריכוזים שונים של hiFBS, ובכך ליצור מעבר עדין למצב סרום מורעב עבור תאים. כאשר תאי SH-SY5Y בוגרת הם בריאים, הם מפגינים תחזיות רבות המקשרות את הנוירונים שמסביב (איור 5 א). יצוין כי פנוטיפ אפיתל ייחודי יהיה לעקוף התרבויות העצביות אם הם כשלה במהלך תהליך ההתמיינות (איור 5). בנוסף, אם הנוירונים מתחילים למות, neurites יהיה לסגת, גופי התא יתחילו גוש ביחד ו לאסוף, ופסולת מניוון neurite יתחיל להצטבר סביב תהליכים בתא. תהליך זה דומה למה הפגין 5C דמויות 5D. בעוד איור 5 ג מראה התקדמות טבעית יותר של מוות תא הבאה מחסור באבות מזון סביבתי,איור 5D תערוכות SH-SY5Y הבדיל נוירונים 4 hr זיהום בעקבות עם זן HSV-1, קוס, על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 6 PFU. פרוטוקול זה כבר מותאם באופן יסודי במעבדה והתשואות לשחזור, אוכלוסיות הומוגניות של נוירונים, שהם חיוניים עבור ניתוחים וניסויים במורד הזרם.

איור 1
איור 1:. לוח הזמנים של הליך בידול תהליך בידול מורכב מ -11 שלבים פרושים לאורך תקופה של 18 יום. ביום הראשון של פרוטוקול הבידול (יום 0), בין 25,000 ל -100,000 תאים צופה על ציפוי 35 מנות מ"מ. בימים 1, 3, ו -5, המדיה הישנה מוסר והבחנה מדיה # 1 מוחל. ביום 7, התאים לפצל 1: 1 על מנות 35mm ציפוי ב בידול מדיה # 1. ביום 8, התקשורת משתנה בידולמדיה # 2, וביום 10, התאים שוב לפצל 1: 1, אבל הפעם על מנות ECM מצופה 35 מ"מ בידול מדיה # 2. בימים 11, 14, ו -17, המדיה הישנה מוסר והבחנה מדיה # 3 מוחל. ביום 18, נוירונים הבדיל מוכנים לשימוש עבור יישומים במורד הזרם.

איור 2
איור 2:. המראה מורפולוגי של תאים שלא עברו התמיינות הבדיל SH-SY5Y (א) מובחן תאים SH-SY5Y יש פנוטיפ שטוח עם כמה תחזיות בזמן (B) נוירונים SH-SY5Y הבדיל להפגין תחזיות מדלקת עצבים נרחב ומוארך. תמונות התקבלו בשלב בהגדלה 20X באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה.

איור 3
איור 3:סמנים של בידול עצבי. Immunofluorescence מאיר תכונות עצביות של תאים-SY5Y SH בדיל באופן מלא. (א) Anti-SMI31 (ירוק) מכתים את H neurofilament פוספורילציה של רשת ענפה של neurites. (ב) Anti-MAP2 (אדום) תוויות המשויכות-microtubule החלבון 2, חושף סומה העצב חלק הפרוקסימלי של neurites. תמונת שלב מקבילה עבור כל פנל immunofluorescence מוצגת בצד ימין. תמונות התקבלו בהגדלה 10X באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.

איור 4
איור 4: פעולות ביניים של פרוטוקול הבידול (א) יום 1 של בידול.. תאים לשמור על הפנוטיפ חזר עם תחזיות קצרות. (ב) יום 5 של בידול. תאים שנחשפו 5 יוםים של קיפוח בסרום (בידול מדיה # 1). התאים השורדים מתחילים להאריך ויוצרי תהליכים עוד מתחברים עם תאי שכנים. (ג) יום 7 של בידול לפני לפצל. תאים להפגין מספרים גבוהים של תהליכים ארוכים, עם מספרים פחות תאי הוכחת פנוטיפ אפיתל דמוי. (ד) יום 8 של בידול, יום אחד לאחר המעבר הראשון. בעקבות פיצול, גופי התא ליצור גושים ותהליכים להופיע קצר כתוצאה של הליך passaging. (E) יום 10 של בידול, לפני לפצל לצלחות ECM מצופה. תאים להדגים תהליכים כבר היוצרות קשרים עם תאים סמוכים. אשכולות גוף התא ניכר גם. (F) יום 11 של בידול, יום אחד לאחר שבריר שנייה. תאי לחוצים בעקבות הקטע שני נוירונים רבים בסופו של דבר הם אבדו. עם זאת, האוכלוסייה שנותרה היא בת קיימא, הומוגני, עצבי הפנוטיפ. תא גופים לייצר lאשכולות ותהליכי arger להתחיל לפלוט מהבסיס של האשכולות.

איור 5
איור 5:. יתר אפיתל ומוות עצבי - שתי תוצאות אלטרנטיביות של תהליך התמיינות (א) בריא, נוירונים SH-SY5Y בוגרת להפגין תחזיות axonal מפוזר חיבור תאים שכנים. (ב) במקרים מסוימים, תאים עם פנוטיפ אפיתל דמוי יותר לעקוף תרבויות תחזוקה. יתר האוכלוסייה של תאים דמויי אפיתל זה יכול להיות בגלל passaging נדיר של תרבויות תחזוקה. תרבויות אלה אמורות להיות מושלכים, כמו התאים הדמויים אפיתל ימשיכו במספרם נוירונים. חצים לציין תאים דמויי אפיתל. (ג) כאשר SH-SY5Y תאים בריאים ולהתחיל למות, גופי התא לאסוף ותהליכים לבזות, מניבים כמות של פסולת משמעותית. (D 6 PFU.

רְכִיב פרטים המניה הוראות
10 מיקרומטר RA חומצה רטינואית All-טראנס 5 מ"מ Resuspend RA 50 מ"ג ב 33.3 מ"ל 95% EtOH. דלקת מפרקים שגרונית היא רגיש לחום, אור ואוויר. שמור בבקבוק חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שבועות. השתמש ב 1: 500 דילול לדלל לתוך תקשורת בידול מייד לפני השימוש
(300.44 g / mol)
1x B-27 מוסף B-27 50x להפשיר 1-10 מ"ל בקבוק ויתר aliquot לתוך aliquots מ"ל 1 לשימוש חד-פעמי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. חנות 10 מ"ל בקבוקים ב -20 ° C
20 מ"מ KCl אשלגן כלורי 1 M הוסף 250 מ"ל מים 18.6 גרם KCl ולסנן סטרילית. חנות בטמפרטורת החדר
(74.55 g / mol)
2 מ"מ db-cAMP dibutyryl המחזורית AMP 1 M Resuspend בקבוק מלא על ידי הוספת 2.04 מ"ל מים 1 גרם db-cAMP. רגישות אור ולחות. חנות aliquots של 100 μl או 200 μl משני -20 ° C או -80 ° C
(491.37 g / mol)
50 ng / ml BDNF גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) - בקבוקון צנטריפוגה להשיג אבקה למטה.60; Resuspend 10 מיקרוגרם בקבוקון ב 1 מ"ל Neurobasal + 1x B27 או 5 מיקרוגרם הבקבוקון 0.5 מ"ל Neurobasal + 1x B27 כדי לקבל 10 מיקרוגרם / מ"ל. השתמש ב 1: דילול 200. חנות aliquots עובדים ב -80 ° C (לשעבר: 250 μl)
hiFBS חום מומת בסרום שור העוברי - Aliquot מופשר FBS לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל. מחממים על 56 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות. הסר ולהקפיא aliquots עובדים ב -20 ° C

טבלה 1: פתרונות מניות ורכיבים.

תקשורת צמיחה בסיסית
רְכִיב נפח 500 מ"ל מְהִילָה
EMEM 415 מ"ל EMEM
15 hiFBS% 75 מ"ל hiFBS
1x פן / סטרפטוקוקוס 5 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס 1: 100
2 מ"מ גלוטמין גלוטמין 5 מ"ל 1: 100
* שמור במשך 6 שבועות מקסימום
בידול מדיה # 1
רְכִיב נפח 50 מ"ל מְהִילָה
EMEM 48 מ"ל EMEM
2.5% hiFBS 1.3 מ"ל hiFBS
1x פן / סטרפטוקוקוס 500 μl פן / סטרפטוקוקוס 1: 100
2 מ"מ גלוטמין 500 גלוטמין μl 1: 100
10 מיקרומטר RA 100 μl RA (המניה 5 מ"מ) 1: 500
* שמור עבור 2 שבועות מקסימום ולהוסיף RA ערבלהשתמש
* אין לשמור מדיה נוספת פעם RA מתווסף - RA אינו יציב
בידול מדיה # 2
רְכִיב נפח 50 מ"ל מְהִילָה
EMEM 49 מ"ל EMEM
1 hiFBS% 500 hiFBS μl
1x פן / סטרפטוקוקוס 500 μl פן / סטרפטוקוקוס 1: 100
2 מ"מ גלוטמין 500 גלוטמין μl 1: 100
10 מיקרומטר RA 100 μl RA (המניה 5 מ"מ) 1: 500
* שמור עבור 2 שבועות מקסימום ולהוסיף RA מיד לפני השימוש
* אין לשמור מדיה נוספת עלRA ce מתווסף - RA אינו יציב
בידול מדיה # 3
רְכִיב נפח 50 מ"ל מְהִילָה
Neurobasal 47 מ"ל Neurobasal
1x B-27 1 מ"ל B-27 (מלאי 50X) 01:50
20 מ"מ KCl 1 מ"ל KCl (1M המלאי) 1:50
1x פן / סטרפטוקוקוס 500 μl פן / סטרפטוקוקוס 1: 100
2 מ"מ GlutamaxI 500 GlutamaxI μl (100x המלאי) 1: 100
50 ng / ml BDNF 250 μl המניות BDNF (10 מיקרוגרם / מ"ל) 1: 200
2 מ"מ dibutyryl מחזורית AMP (db-cAMP) 100 μl db-cAMP (מלאי 1M) 1: 500
10 מיקרומטר RA 100 μl RA (המניה 5 מ"מ) 1: 500
* שמור עבור 2 שבועות מקסימום ולהוסיף RA מיד לפני השימוש
* אין לשמור מדיה נוספת פעם RA מתווסף - RA אינו יציב

טבלה 2: מתכוני Media.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול לעיל מספק שיטה פשוטה לשחזור כדי ליצור תרביות נוירונים אדם הומוגנית ובת קיימא. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ושיטות עבודה המשלבים מספר שיטות שפורסמו בעבר 1-4 ומטרתה להתוות את שיטות העבודה המומלצות של כל אחד. התמיינות של תאי SH-SY5Y מסתמכים על קיפוח בסרום הדרגתי; תוספת של חומצה רטינואית, גורמים neurotrophic וחלבונים מטריקס; פיצול סדר לבחור נוירונים חסידים בוגרת בדיל. שורת תאים יתחילו אוכלוסייה הטרוגנית של תאי חסיד מושעים. פרוטוקול זה נועד לשמר שתי האוכלוסיות באמצעות ניכוי שוטף PBS לפני שינוי passaging או התקשורת, אך כמה אובדן של תאים מושעה הוא הכרחי כדי לאפשר הסרה של תאי אפיתל מתים. השיטה מוצגת מייצרת אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים האדם מובחנים SH-SY5Y לניסויים נוספים.

למרות וטיהורr סוכנים שניתן להשתמש בהם כדי להנחות את הבידול של נוירונים לתוך פנוטיפ כולינרגית או אדרנרגיים 16,17, השימוש RA להבדיל תאים SH-SY5Y כבר השתמשו בעבר כדי לייצר נוירונים עם פנוטיפ דופאמין 37,38. תוספת של RA הוכח להשרות התמיינות הסלולר באמצעות מספר מנגנונים, לרבות מעצר התקדמות מחזור התא מתוך G0 / G1, הגדלת ביטוי של קינאז תלוי-ציקלין (CDK) מעכבי p21 ו- p27 Kip1 והחלבונים אנטי אפופטוטיים Bcl -2 ו Bcl-XL, והגברת הפעילות PI3K / AKT אשר ממלא תפקיד בהתפתחות neurite והבחנה 39.

זה הכרחי ברחבי ביצוע בפרוטוקול זה להשתמש בטכניקות טיפול עדין וסטרילי, כמו תאים SH-SY5Y רגישים מאוד לשינויים פתאומיים. זה בגלל הרגישות הזו כי פרוטוקול מניעת סרום ההדרגתי עדיף על פני פרוטוקולים הדורשים ביצוע שינויים מהירים medרכב IA. כאשר פיצול תאים בימים 7 ו -10, חשוב למזער את כמות הזמן כי נוירונים לבלות הבדיל חלקית טריפסין. זה מקטין את ההסתברות של נוירונים נזק ומקדם שחרור מועדף של נוירונים לעומת תאי אפיתל, אשר לוקח זמן רב יותר לנתק. זה עוזר לבסס אוכלוסייה עצבית הומוגנית יותר של תאים כדי למזער זיהום עם המתרבים ותאי אפיתל מובחנים. כמו כן, חשוב לציין חומרים כימיים המשמשים לתרבות והתמיינות של תאים SH-SY5Y צריך להיות מוחלף באופן קבוע ולא להיות כל הזמן ללא הגבלה. לדוגמא, תקשורת צמיחה בסיסית יכולה להישמר עד 6 שבועות תוך בידול מדיה צריכה להישמר רק עד 2 שבועות. הדבר מבטיח ריאגנטים כגון dbcAMP ו BDNF הם טריים ויציבים. בנוסף, הכין RA יש לאחסן רק עד 6 שבועות בחושך לפני ומשלוח חדש צריך להיעשות. ראינו עקביות רבה יותר של תוצאות עצביות wה- i אמצעי הזהירות הללו.

לאחר התאים כבר הבדיל לתוך נוירונים בוגרים, הם יכולים להישמר עד 2 שבועות לאחר מסוף בידול המשמשים לניסויים. בעקבות בידול הטרמינל, יש לשנות התקשורת כל 3-4 ימים (בידול מדיה # 3). בניגוד נוירונים בדיל, צלוחיות תחזוקה המכילות תרביות תאי SH-SY5Y מובחנים נשמרות במשך שבועות רבים עם passaging הקבוע. חשוב תרבויות תחזוקה המעבר באופן קבוע, כדי למנוע יתר האוכלוסייה של תאים דמויי אפיתל כי הם כבר לא מסוגלים להבדיל לתוך הנוירונים. כאשר תאים אלה משיעור המחזיקים עם נוירו-פוטנציאל, רעב בסרום יגרום כמויות בלתי מידתית של מוות של תאים. תרבויות מובחנות יכולות להישמר רק עד כ 15 קטעים. לאחר בתרבות חרגה סביב 15 קטעים, תאים שלא עבר התמיינות מתחילות למות ויש לי מראה מחוספס, בריא. בנוסף, בידולtiation של תאי SH-SY5Y מעבר גבוה קשה יותר כתאים פחות ישרדו כל פיצול, ואלה עושים לעתים קרובות לצבור הן גופי תא אקסונים, מה שהופך ניתוחים שלאחר מכן קשים יותר.

יש ירידה ברורה במספר התא במהלך תהליך התמיינות תאים רבים הולכים לאיבוד או אינו שורדים את תהליך הפיצול. לכן, בתחילת כל ניסוי, שמקורם בתאי דם SH-SY5Y בדיל, אחד צריך להסביר ~ 30-40% אובדן הנוירונים ולהבטיח מספר נכון של תאים הוא מצופה בתחילה כדי להשיג את התשואה הרצויה. בעוד ציפוי 100,000 תאים מייצר שפע של נוירונים בריאים, בוגרת SH-SY5Y, פחות או במספרים גדולים יותר ניתן בתחילה מצופים תלוי לצורך ניסוי.

ברור כי בדיל באופן מלא נוירונים SH-SY5Y לספק קירוב קרוב של נוירונים שמהם מתפתחים שורה מצאו in vivo מאשר עמיתיהם תא האב המובחנים שלהם (איור 2). נוירונים אלה יספקו מודל יתרון אפיונים בעתיד לנוירוביולוגיה שלהם, לחקר וירוסים neurotropic, או למסך רעילות כימותרפיות בנוירונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B-27 ThermoFisher Scientific 17504-044 See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Sigma SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Sigma D0627 See Table 1 for preparation
DMSO ATCC 4-X -
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) Sigma M5650 -
Fetal Bovine Serum (FBS)  Hyclone SH30071.03 See Table 1 for preparation
GlutamaxI Life Technologies 35050-061 -
Glutamine Hyclone SH30034.01 -
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-1 See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution Sigma E0282 See step 11 of the protocol
Neurobasal Life Technologies 21103-049 -
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life Technologies 15140-122 -
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells ATCC CRL-2266 -
0.5% Trypsin + EDTA Life Technologies 15400-054 -
Falcon 35 mm TC dishes Falcon (A Corning Brand) 353001 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
  24. Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 108 SH-SY5Y נוירובלסטומה בידול נוירוביולוגיה נוירונים זיהום תרבית תאים
בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shipley, M. M., Mangold, C. A.,… More

Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line. J. Vis. Exp. (108), e53193, doi:10.3791/53193 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter