Introduction
La capacidad de utilizar en sistemas de modelos in vitro ha mejorado en gran medida el campo de la neurobiología y las neurociencias. Las células en cultivo proporcionan una plataforma eficiente para caracterizar la funcionalidad de las proteínas y los mecanismos moleculares subyacentes fenómenos específicos, para entender la patología de la enfermedad y la infección, y para realizar evaluaciones preliminares de análisis de drogas. En la neurobiología, los principales tipos de modelos de cultivo celular incluyen cultivos neuronales primarios derivados de ratas y ratones, y las líneas celulares de neuroblastoma, tales como células B35 de la rata 5, Neuro-2A células de ratón 6, y las células PC12 de rata 7. Aunque el uso de tales líneas de células ha avanzado de manera significativa el campo, hay varios factores de confusión asociadas con la manipulación de las células y tejidos no humanos. Estos incluyen especies específicas de comprensión de las diferencias en los procesos metabólicos, fenotipos de manifestación de la enfermedad, y la patogénesis en comparación con los seres humanos. También es importante tener en cuenta que lare son diferencias significativas entre el ratón y la expresión de genes humanos y de señalización del factor de transcripción, destacando las limitaciones de los modelos de roedores y la importancia de comprender las vías que se conservan entre roedores y humanos 8-11. Otros han empleado el uso de líneas de células neuronales humanas, incluyendo la N-Tera-2 (NT2) línea celular humana teratocarcinoma y células madre pluripotentes inducibles (CMPI). Estas líneas celulares proporcionan buenos modelos para sistemas humanos in vitro. Sin embargo, la diferenciación de las células NT2 con ácido retinoico (RA) da como resultado la generación de una población mixta de neuronas, astrocitos y células gliales radiales 12, requiriendo una etapa de purificación adicional para obtener poblaciones puras de las neuronas. Además, las células NT2 demuestran un cariotipo muy variable 13, con más de 60 cromosomas en 72% de las células. iPSCs demuestran la variabilidad en la diferenciación entre las diferentes líneas celulares y varían en la eficiencia de la diferenciación 14. Por lo tanto, es deseable tener un modelo de célula neuronal humano consistente y reproducible para complementar estas alternativas.
células de neuroblastos-como SH-SY5Y son un subclón de la línea celular de neuroblastoma padres SK-N-SH. La línea celular parental se generó en 1970 a partir de una biopsia de médula ósea que contiene tanto células de tipo epitelial 15 neuroblastos-como y. células SH-SY5Y tienen un cariotipo estable que consta de 47 cromosomas, y se pueden diferenciar de un estado neuroblast-como en neuronas humanos maduros a través de una variedad de diferentes mecanismos que incluyen el uso de RA, ésteres de forbol, y neurotrofinas específicos, tales como derivados de cerebro factor neurotrófico (BDNF). Antes evidencia sugiere que el uso de diferentes métodos puede seleccionar para los subtipos de neuronas específicas, tales como adrenérgicos, colinérgicos, y las neuronas dopaminérgicas 16,17. Este último aspecto hace que las células SH-SY5Y útiles para una multitud de experimentos neurobiología.
ONTENIDO "> Varios estudios han señalado importantes diferencias entre las células SH-SY5Y en sus estados no diferenciadas y diferenciadas. Cuando las células SH-SY5Y son indiferenciada, rápidamente proliferan y parecen ser no polarizado, con muy pocos procesos, cortos. A menudo crecen en grupos y expresar marcadores indicativos de las neuronas inmaduras 18,19. Cuando diferenciadas, estas células se extienden largas, ramificado procesos, disminución en la proliferación y, en algunos casos polarizan 2,18. SH-SY5Y células completamente diferenciadas se han demostrado previamente para expresar una variedad de diferentes marcadores de las neuronas maduras incluyendo la proteína asociada al crecimiento (GAP-43), los núcleos neuronales (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína de la vesícula II (SV2), enolasa neuronal específica (NSE) y la proteína asociada a microtúbulos (MAP) 2,16,17,20, y carecer de la expresión de marcadores gliales tales como la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) 4. En apoyo que diferencian SH-SY5Y células represent una población neuronal homogénea, la eliminación de BDNF da como resultado la apoptosis celular 4. Esto sugiere que la supervivencia de las células SH-SY5Y diferenciadas depende de factores tróficos, similares a neuronas maduras.El uso de células SH-SY5Y se ha incrementado desde el subclón fue establecida en 1978 3. Algunos ejemplos de su uso incluyen la investigación de la enfermedad de Parkinson 17, enfermedad de Alzheimer 21, y la patogénesis de la infección viral, por ejemplo poliovirus 22, el enterovirus 71 (EV71) 23,24 , virus de la varicela-zoster (VZV) 1, citomegalovirus humano 25, y el virus de herpes simplex (HSV) 2,26. Es importante tener en cuenta que varios estudios utilizando células SH-SY5Y han utilizado estas células en su forma no diferenciada, especialmente en el campo de la Neurovirology 27-36. La diferencia en el fenotipo observado de no diferenciado frente a las células SH-SY5Y diferenciadas plantea la cuestión de wheTher la progresión observada de infección sería diferente en las neuronas diferenciadas maduras. Por ejemplo, células SH-SY5Y diferenciadas tienen una mayor eficiencia de HSV-1 absorción frente a, la proliferación de células SH-SY5Y diferenciadas, que pueden ser debido a la falta de receptores de superficie que se unen HSV y modulan la entrada en las células SH-SY5Y diferenciadas 2. Por tanto, es fundamental que en el diseño de un experimento se centró en las pruebas de neuronas in vitro, las células SH-SY5Y se deben diferenciar el fin de obtener los resultados más precisos para la traducción y la comparación con los modelos in vivo.
El desarrollo de un método fiable para generar cultivos neuronales humanos es imprescindible para permitir a los investigadores realizar experimentos de traslación que modelan con precisión el sistema nervioso humano. El protocolo que se presenta aquí es un procedimiento que delinea mejores prácticas derivadas de los métodos anteriores 1-4 para enriquecer en neuronas humanas que se diferencianutilizando ácido retinoico.
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Protocol
1. Consideraciones generales
- Véase la Tabla de Materiales / Equipos para obtener una lista de los reactivos necesarios. Realizar todos los pasos bajo estrictas condiciones de asepsia.
- Utilice suero bovino fetal inactivado por calor (hiFBS) para todas las preparaciones de medios de comunicación que incluyen FBS. Para calentar-inactivate, calentar una parte alícuota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invirtiendo cada 10 min (véase también la Tabla 1).
Nota: Cuando se utiliza sin FBS inactivación térmica, el fenotipo epitelial progresa más rápidamente a través de cultivos de células SH-SY5Y. - Antes de su uso, Deja que el material se caliente y se equilibran en una incubadora para establecer un equilibrio apropiado del pH antes de cada paso. Por ejemplo, a 50 ml de medio tarda aproximadamente una hora para equilibrar completamente (pH 7, 37 ° C, 5% de CO 2).
Nota: Este protocolo utiliza un procedimiento de división de dos etapas que requiere células parcialmente diferenciadas SH-SY5Y que ser tratadas con tripsina y re-plateado. Este es un estresanteproceso para estas células excepcionalmente frágiles. Por lo tanto, es importante incubar las células en tripsina durante una cantidad de tiempo mínima. Esto permitirá el despegue preferencial de las neuronas, dejando a las células de tipo epitelial todavía unido al plato. - Realizar trituración de células diferenciadas lentamente con una pipeta de plástico de 10 ml con la punta contra la parte inferior del tubo cónico que contiene las células. Realizar trituración a una velocidad lenta, arriba y abajo de no más de cinco veces.
2. La aprobación de SH-SY5Y culturas mantenimiento
- culturas mantenimiento de división cuando las células han alcanzado el 70-80% de confluencia, y no excedan de 10 a 15 pasajes. Culturas típicamente necesitan ser passaged cada 3-5 días (cultivos asumiendo no se diluyen más de 5 veces durante la división).
- Para células pasaje de un matraz T-75, Aspirar los medios de comunicación, luego enjuague con aproximadamente 10 ml de PBS 1x.
Nota: No se recomienda dividir el SH-SY5Y culturas mantenimiento further de 1: 5 durante los pases ya que esto puede causar que las células se mueren debido a la baja de confluencia. - Aspirar el PBS y, a continuación, añadir 2,5 ml de 0,05% tripsina-EDTA (1x).
- Incubar en incubadora 2-3 min y la punta suavemente para liberar las células de la superficie del matraz.
- Añadir 10 ml de crecimiento básico de los medios de comunicación (véase la Tabla 2) y se tritura 1-2 veces.
- Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg, medios de aspirado, a continuación, volver a suspender sedimento en 5 ml Crecimiento medios básicos.
- Diluir las células de 1: 3 a 1: 5 en un volumen total de 20 ml para chapado normal en el matraz T-75, o contar y la placa para la diferenciación (sección 5).
3. La congelación de las células SH-SY5Y
- Congelación de primeros pasajes de células de neuroblastoma SH-SY5Y en Básico Crecimiento medio suplementado con 5% (v / v) de DMSO.
- Inicialmente, congelar alícuotas a -80 ° C durante 24 horas, luego se transfieren a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
Nota: Para tener una referencia, un confluentes (75-85%) matraz T-75 producirá cincoAlícuotas de 1 ml de SH-SY5Y células para la congelación. Cada una de estas alícuotas debe contener de 2-5 millones de células totales.
4. Las células Descongelar y Cultura indiferenciado SH-SY5Y de neuroblastoma
- Preparar crecimiento básico de los medios de comunicación.
- Descongelar rápidamente las células congeladas en un baño de agua a 37 ° (aproximadamente 2 minutos).
- Resuspender las células en 9 ml de Medios de Crecimiento básico en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 2 minutos a 1.000 x g.
- Aspirar el sobrenadante con cuidado de no molestar a las células sedimentadas, y las células suavemente resuspender en 10 ml Crecimiento medios básicos.
- Células de la placa en un matraz T-25 o 60 mm 2 plato.
- Al día siguiente, en lugar de los medios de comunicación para eliminar las células muertas.
5. Día 0: placas células para la diferenciación
- Véase la Figura 1 para el programa de diferenciación.
- Enjuagar las células indiferenciadas con 1x PBS, aspirado, y luego trypsinize de 1-2 ml calentado1x 0,05% de tripsina-EDTA.
- Cuando las células están en tripsina, se incuba durante aproximadamente 3 min en una incubadora.
- Se inactiva la tripsina mediante la adición de 10 ml de crecimiento básico de los medios de comunicación, enjuagar los lados del matraz o un plato, y se tritura suavemente 1-3 veces. Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg, y aspirar los medios de comunicación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
- sedimento se vuelve a suspender en 5 ml de Medios de Crecimiento básico y triturar 1-3 veces.
- Contar las células usando un hemocitómetro, y luego diluir con crecimiento básico de los medios de comunicación a 50.000 células / ml.
- Placa de 2 ml de células por 35 mm 2 plato para un total de 100.000 células por placa y se coloca de nuevo en la incubadora.
6. Día 1: Cambiar medios (Diferenciación de Medios # 1)
- Alícuota de 50 ml de Diferenciación de Medios # 1 (ver Tabla 2) y se incuban en un baño de agua a 37 °.
- Cuando se calienta medios de comunicación, permitir que se equilibre en una incubadora (37° C, 5% de CO 2) para al menos una hora a establecer un equilibrio apropiado del pH antes de su uso.
- Añadir ácido retinoico (RA) (ver Tabla 1) para calentar y los medios de comunicación equilibrada inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
Nota: El ácido retinoico es sensible a la luz y debe ser almacenado en botellas oscuras a 4 ° C - Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
- Añadir 2 ml Diferenciación de Medios # 1 con AR por 35 mm 2 plato y volver a la incubadora.
7. Día 3: Cambiar medios (Diferenciación de Medios # 1)
- Repita la sección 6 (pasos 1-5)
8. Día 5: Cambiar medios (Diferenciación de Medios # 1)
- Repita la sección 6 (pasos 1-5)
9. Día 7: Dividir celdas 1: 1
- Añadir a la AR se calentó y se equilibró Diferenciación de Medios # 1 inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
- Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
- Añadir 200 lcalentado 0,05% 1x Tripsina EDTA por 35 mm 2 plato y caliente en incubadora aproximadamente 2-3 min o hasta que las células se levantan visiblemente de la placa tal como se observa bajo un microscopio.
- Se inactiva la tripsina mediante la adición de 2 ml Diferenciación de Medios # 1 con AR por 35 mm 2 plato y el uso de los medios de comunicación para enjuagar las células neuronales restante de la placa. A continuación, transferir el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
Nota: Durante tripsinización pasos, no trypsinize demasiados platos a la vez. Esto ayuda a asegurar cultivos neuronales no se incubaron en tripsina durante demasiado tiempo, que puede ser citotóxico. - Combine el contenido de hasta 10 platos en el tubo cónico de 50 ml y se tritura suavemente lentamente arriba y abajo no más de cinco veces con una pipeta de plástico de 10 ml.
- Alícuota de suspensión celular de 2 ml en 35 mm frescas 2 platos y volver a la incubadora.
10. Día 8: Cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 2)
- Añadir RA (ver <strong> Tabla 1) para calentar y se equilibró medios inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
- Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
- Poco a poco agregue 2 ml Diferenciación de Medios # 2 (véase la Tabla 2) con AR por 35 mm 2 platos y retorno a la incubadora. No permitir que las neuronas que se exponen al aire durante un período prolongado de tiempo, ya que pueden secarse rápidamente.
11. Día 9: Preparar la matriz extracelular (ECM) placas revestidas
- Descongelar un vial de solución ECM en hielo y se diluye 1: 100 en DMEM frío.
- Dispensar 2 ml de mezcla en cada placa de 35 mm 2 y asegúrese de toda la base de la cápsula está cubierta.
- Colocar en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 1 hora o durante la noche.
- Aspirar mezcla y dejar secar al aire durante aproximadamente 1 hora en una campana. Almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 2 meses.
12. Día 10: Las células de transferencia sobreLas placas recubiertas de ECM 1: 1
- Añadir RA (véase la Tabla 1) a los medios de comunicación y calentado equilibrada inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
- Se aspira suavemente fuera de los medios de comunicación y desechar.
- Añadir 200 l calentado tripsina a cada placa de 35 mm 2 y permitir incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 min o hasta que las neuronas se levantan visiblemente desde el plato como se observa bajo un microscopio.
Nota: Ejecutar este paso tripsinización a temperatura ambiente con el fin de no sobre-incubar las neuronas con tripsina y causar daños. Neuronas liberan a partir de placas mucho más rápido que las células de tipo epitelial en esta etapa. - Se inactiva la tripsina mediante la adición de 2 ml Diferenciación de Medios # 2 por 35 mm 2 plato y utilizar los medios de comunicación para enjuagar las células neuronales restante de la placa. A continuación, transferir el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
- Combine el contenido de hasta 10 platos en el tubo cónico de 50 ml y se tritura suavemente lentamente arriba y abajo no más de cinco veces conuna pipeta de plástico de 10 ml.
- Prescindir de 2 ml de suspensión celular en 35 mm 2 platos recubiertos de ECM y de retorno a la incubadora.
13. Día 11: Cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 3)
- Añadir RA (véase la Tabla 1) a los medios de comunicación y calentado equilibrada inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
- Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
- Poco a poco agregue 2 ml Diferenciación de Medios # 3 (véase la Tabla 2) con AR por 35 mm 2 plato y volver a la incubadora. No permitir que las neuronas que se exponen al aire durante un período prolongado de tiempo.
14. Día 14: Cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 3)
- Repita la sección 13 (pasos 1-3)
15. Día 17: último cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 3)
- Repita la sección 13 (pasos 1-3)
16. Día 18: cultivos neuronales listo para usar
- Cambiar medios para Dif frescaerentiation Medios # 3 con AR cada 3 días para mantener la salud de las neuronas.
Nota: Las celdas deben diferenciarse en neuronas y exhiben un fenotipo neuronal. Los cultivos son típicamente estables durante hasta 14 días después de la diferenciación terminal, sin embargo la duración de la viabilidad de las neuronas depende del número de pases de las células no diferenciadas en el inicio de la diferenciación. números de pases más altos producen neuronas diferenciadas con una vida útil más corta.
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Representative Results
En la actualidad, hay muchos casos en el campo de la neurobiología y Neurovirology donde se utilizan células SH-SY5Y diferenciadas como un modelo funcional para neuronas humanas 27-36, y de manera importante, las células indiferenciadas pueden carecer de fenotipos tales como la absorción viral óptima 2 que son necesaria para la correcta interpretación. Es fundamental que al utilizar células SH-SY5Y o cualquier otro sistema neuronal in vitro, las células se diferencian en neuronas apropiadamente, con el fin de obtener datos que es la mejor representación posible de lo que puede estar ocurriendo en las neuronas in vivo. Los rendimientos protocolo anterior, altamente homogéneos, cultivos neuronales diferenciadas viables dentro de 18 días, que se pueden utilizar para la posterior bioquímicos y formación de imágenes análisis. Células de neuroblastoma SH-SY5Y indiferenciado demuestran un gran apartamento, fenotipo, epitelial-como con numerosos procesos cortos se extienden hacia fuera (Figura 2A), mientras célula diferenciadas poseen varias proyecciones neuríticas que se conectan a las células circundantes (Figura 2B). Es importante que la hora de diferenciar células SH-SY5Y, las células se incubaron con tripsina para una longitud mínima de tiempo para asegurar que sólo las neuronas se liberan del plato. Esto deja detrás de las células epiteliales no diferenciadas que de otro modo contaminar la población celular neuronal diferenciada. Las características neuronales de las células SH-SY5Y diferenciadas completamente se demuestran mediante técnicas tales como la detección de inmunofluorescencia de marcadores neuronales clásicos (Figura 3).
SH-SY5Y células demuestran una variedad de diferentes fenotipos durante el curso de la diferenciación y es importante ser capaz de identificar las neuronas sanas de los que se subrayó. En la diferenciación día 1, antes de la introducción de una diferenciación medios # 1, las células tienen un fenotipo plana, retraída con corto, procesos cortas (Figura 4A).Después de 5 días de privación de suero, las células SH-SY5Y comienzan a desarrollar proyecciones más largas y demostrar un fenotipo más neuronal (Figura 4B). Pases es un proceso severo para SH-SY5Y células, y en los días inmediatamente posteriores a los pases, las células parece poco saludable. Esto se evidencia por la formación de grumos cuerpo de la célula y la presencia de un menor número de procesos, más cortos. (Ver imágenes antes: Figuras 4C y 4E, y después de imágenes: Figuras 4D y 4F). Aproximadamente 48 horas después de la escisión, las células parecen recuperarse, y totalmente maduras, neuronas diferenciadas se obtienen en el día 18 (Figura 2B). Esto se evidencia por una reducción en la formación de grumos cuerpo de la célula, y la extensión de numerosos delgado, ramificado procesos neuríticas que a menudo se conectan a las células vecinas.
Factores que son esenciales para la obtención de cultivos neuronales reproducibles y viables incluyen el uso de FBS inactivado por calor, minimizando la incubación de tripsinatiempo, y trituración suave. Es importante destacar que este protocolo se detalla el uso de cuatro formulaciones de medios diferentes con diversas concentraciones de hiFBS, creando de ese modo una transición suave en un estado privaron de suero para las células. Cuando las células SH-SY5Y maduros son saludables, demuestran numerosas proyecciones que se conectan a las neuronas circundantes (Figura 5A). Cabe señalar que un fenotipo epitelial distintivo superará los cultivos neuronales si se manipulan durante el proceso de diferenciación (Figura 5B). Además, si las neuronas comienzan a morir, neuritas se retraerán, cuerpos celulares comenzarán a agruparse y redondear al alza, y los escombros de la degeneración de axones comenzarán a acumularse en y alrededor de los procesos celulares. Este proceso es similar a lo que se demuestra en las Figuras 5C y 5D. Mientras que la Figura 5C muestra una progresión más natural de la muerte celular después de la privación de nutrientes y ambiental,La Figura 5D muestra diferenciadas neuronas SH-SY5Y 4 hr después de la infección con una cepa de HSV-1, KOS, a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 6 PFU. Este protocolo ha sido optimizado a fondo en el laboratorio y los rendimientos reproducibles, poblaciones homogéneas de neuronas, que son esenciales para los análisis posteriores y la experimentación.
Figura 1:. Horario de procedimiento de diferenciación El proceso de diferenciación consta de 11 pasos repartidos a lo largo de un período de 18 días. En el primer día del protocolo de diferenciación (día 0), entre 25.000 y 100.000 células se sembraron en placas de 35 mm sin revestir. En los días 1, 3 y 5, los viejos medios se retira y se aplica Diferenciación de Medios # 1. En el día 7, las células se dividieron 1: 1 en placas de 35 mm sin revestir en la diferenciación de los medios de comunicación # 1. En el día 8, el medio se cambió a DiferenciaciónMedios # 2, y en el día 10, las células se dividen de nuevo 1: 1, pero esta vez en placas de ECM recubiertos de 35 mm en la diferenciación de los medios # 2. En los días 11, 14 y 17, los viejos medios se retira y se aplica Diferenciación de Medios # 3. El día 18, las neuronas diferenciadas están listos para usar para aplicaciones posteriores.
Figura 2:. Apariencia morfológica de las células SH-SY5Y diferenciadas y diferenciadas células (A) indiferenciado SH-SY5Y tienen un fenotipo plana con pocas proyecciones mientras que (B) diferenciadas neuronas SH-SY5Y demuestran extensas y alargados proyecciones neuríticas. Las imágenes se obtuvieron en la fase de 20 aumentos utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido.
Figura 3:Los marcadores de diferenciación neuronal. Inmunofluorescencia ilumina características neuronales de las células SH-SY5Y diferenciadas completamente. (A) Anti-SMI31 (verde) tiñe la neurofilamentos fosforilados H en la extensa red de neuritas. (B) anti-MAP2 (rojo) Etiquetas de la proteína asociada a microtúbulos 2, revelando el soma neuronal y la porción proximal de las neuritas. Imagen fase correspondiente para cada panel de inmunofluorescencia se muestra a la derecha. Las imágenes se obtuvieron en un aumento de 10X utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido. Barra de escala, 100 micras.
Figura 4: Los pasos intermedios del protocolo de diferenciación (A) Día 1 de la diferenciación.. Las células mantienen un fenotipo retraída con proyecciones cortas. (D) Día 5 de la diferenciación. Las células han sido expuestas a 5 díass de la privación de suero (Diferenciación de Medios # 1). Las células supervivientes comienzan a alargarse y formar procesos más largos que conectan con las células vecinas. (C) Día 7 de la diferenciación antes de dividir. Las células demuestran un alto número de procesos largos, con un menor número de células que muestran un fenotipo epitelial. (D) Día 8 de diferenciación, un día después de la primera paso. Después de la división, los cuerpos celulares forman grumos y procesos parecen cortos como resultado del procedimiento de pases. (E) Día 10 de la diferenciación, antes de dividir en placas recubiertas de ECM. Las células demuestran los procesos más largos que hacen conexiones con las células cercanas. agrupación cuerpo celular es también evidente. (F) Día 11 de diferenciación, un día después de la segunda división. Las células se destacaron después del segundo paso, y muchas neuronas se pierden en última instancia. Sin embargo, la población restante es viable, homogénea, y neuronal en el fenotipo. Los cuerpos celulares producen lclusters y procesos Ärger comienzan a emitir desde la base de los grupos.
Figura 5:. Sobrecrecimiento epitelial y la muerte neuronal - dos resultados alternativos del proceso de diferenciación (A) saludable, maduros neuronas SH-SY5Y demostrar proyecciones axonales difusas de conexión a las células vecinas. (B) En algunos casos, las células con un fenotipo más tipo epitelial superar culturas de mantenimiento. Esta-población de más de las células epiteliales como puede ser debido a pases poco frecuente de cultivos de mantenimiento. Estos cultivos deben desecharse, ya que las células de tipo epitelial continuarán superando en número a las neuronas. Las flechas indican las células de tipo epitelial. Células (C) Cuando SH-SY5Y no son saludables y comienzan a morir, cuerpos de células redondas y procesos degradan, lo que genera una cantidad significativa de residuos. (D 6 UFP.
| Componente | detalles | Valores | Instrucciones | ||||
| 10 M RA | el ácido trans-retinoico | 5 mM | Resuspender 50 mg AR en 33,3 ml de EtOH al 95%. RA es sensible al calor, la luz y el aire. Guarde en un frasco oscuro y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 6 semanas. Utilice una dilución 1: 500 y se diluye en medio de diferenciación inmediatamente antes de su uso | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Suplemento | 50x | Descongelar botella de 1-10 ml y el resto alícuota en un solo uso alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C. Tienda de botellas de 10 ml a -20 ° C | ||||
| KCl 20 mM | Cloruro de potasio | 1 M | Añadir 250 ml de agua a 18,6 g de KCl y el filtro estéril. Almacenar a temperatura ambiente | ||||
| (74.55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | dibutiril AMP cíclico | 1 M | Resuspender botella completa mediante la adición de 2,04 ml de agua por 1 g db-cAMP. Sensible a la luz y la humedad. Almacenar en alícuotas de 100 l 200 l o en cualquiera de -20 ° C o -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) | - | vial de centrifugación hasta obtener polvo a abajo.60; Resuspender 10 mg vial en 1 ml Neurobasal + 1x B27 o 5 mg vial en 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 para obtener 10 mg / ml. Utilice una dilución 1: 200. Almacenar alícuotas de trabajo a -80 ° C (por ejemplo: 250 l) | ||||
| hiFBS | Suero bovino fetal inactivado por calor | - | Alícuota descongeló FBS en tubos de 50 ml cónicos. Se calienta a 56 ° C en un baño de agua durante 30 minutos. Retire y congelar alícuotas de trabajo a -20 ° C | ||||
Tabla 1: Las soluciones madre y componentes.
| Medios de crecimiento básico | ||
| Componente | Volumen de 500 ml | Dilución |
| EMEM | 415 ml de EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x penicilina / estreptomicina | 5 ml de penicilina / estreptomicina | 1: 100 |
| La glutamina 2 mM | 5 ml de glutamina | 1: 100 |
| * Mantener durante 6 semanas como máximo | ||
| La diferenciación de Medios # 1 | ||
| Componente | Volumen de 50 ml | Dilución |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x penicilina / estreptomicina | 500 l Pen / Strep | 1: 100 |
| La glutamina 2 mM | La glutamina 500 l | 1: 100 |
| 10 M RA | 100 l RA (Foto 5 mM) | 1: 500 |
| * Mantener durante 2 semanas como máximo y añadir inmediatamente antes de la ARusar | ||
| * No deje de material adicional una vez que se añade RA - RA es inestable | ||
| La diferenciación de Medios # 2 | ||
| Componente | Volumen de 50 ml | Dilución |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 l hiFBS | |
| 1x penicilina / estreptomicina | 500 l Pen / Strep | 1: 100 |
| La glutamina 2 mM | La glutamina 500 l | 1: 100 |
| 10 M RA | 100 l RA (Foto 5 mM) | 1: 500 |
| * Mantener durante 2 semanas como máximo y añadir la AR inmediatamente antes de su uso | ||
| * No guarde los medios extra ense añade RA ce - RA es inestable | ||
| La diferenciación de Medios # 3 | ||
| Componente | Volumen de 50 ml | Dilución |
| neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml de B-27 (50X de acciones) | 1:50 |
| KCl 20 mM | 1 ml de KCl (stock 1M) | 1:50 |
| 1x penicilina / estreptomicina | 500 l Pen / Strep | 1: 100 |
| GlutamaxI 2 mM | 500 GlutamaxI l (100x acciones) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 l BDNF madre (10 mg / ml) | 1: 200 |
| 2 mM dibutiril AMP cíclico (db-cAMP) | 100 l db-cAMP (stock 1M) | 1: 500 |
| 10 M RA | 100 l AR (5 mM) | 1: 500 |
| * Mantener durante 2 semanas como máximo y añadir la AR inmediatamente antes de su uso | ||
| * No deje de material adicional una vez que se añade RA - RA es inestable | ||
Tabla 2: Recetas de medios.
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El protocolo anterior proporciona un método sencillo y reproducible para generar cultivos neuronales humanos homogéneas y viables. Este protocolo utiliza técnicas y prácticas que se integran varios métodos publicados anteriormente 1-4 y objetivos para delinear las mejores prácticas de cada uno. La diferenciación de las células SH-SY5Y se basa en la privación de suero gradual; la adición de ácido retinoico, factores neurotróficos y proteínas de la matriz extracelular; y la división de serie para seleccionar para las neuronas maduras diferenciadas adherentes. Esta línea celular comienza como una población heterogénea de células adherentes y en suspensión. Este protocolo tiene como objetivo preservar ambas poblaciones mediante la retención de lavados con PBS antes de pases o medios de cambio, pero alguna pérdida de células suspendidas es necesario para permitir la extracción de las células epiteliales muertas. El método presentado produce una población homogénea de neuronas humano SH-SY5Y diferenciadas para la experimentación adicional.
Aunque other agentes se pueden utilizar para guiar la diferenciación de las neuronas en un colinérgica o adrenérgicos fenotipo 16,17, el uso de RA para diferenciar las células SH-SY5Y se ha utilizado anteriormente para producir neuronas con un fenotipo dopaminérgico 37,38. La adición de RA se ha demostrado que induce la diferenciación celular a través de un número de mecanismos, incluyendo la detención de la progresión del ciclo celular de G0 / G1, aumentando la expresión de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidores de p21 y p27 Kip1 y las proteínas anti-apoptóticas Bcl -2 y Bcl-xL, y la mejora de la actividad / AKT PI3K que desempeña un papel en el desarrollo de las neuritas y la diferenciación 39.
Es imperativo largo de la ejecución de este protocolo a utilizar técnicas de manejo suave y estériles, como SH-SY5Y células son muy sensibles a los cambios repentinos. Es debido a esta sensibilidad que el protocolo de la privación de suero gradual se prefiere sobre protocolos que requieren hacer cambios rápidos en media composición. Al dividir las células en los días 7 y 10, es importante para reducir al mínimo la cantidad de tiempo que las neuronas diferenciadas parcialmente pasan en tripsina. Esto reduce la probabilidad de que las neuronas perjudiciales y promueve la liberación preferencial de las neuronas frente a las células epiteliales, que requieren más tiempo para separar. Esto ayuda a establecer una población neuronal más homogénea de las células y para minimizar la contaminación con el proliferantes y células epiteliales indiferenciadas. También es importante tener en cuenta los reactivos utilizados para el cultivo y la diferenciación de las células SH-SY5Y deben sustituirse de forma rutinaria y no ser mantenido indefinidamente. Por ejemplo, los medios de comunicación de crecimiento básico se puede mantener hasta 6 semanas, mientras que la diferenciación de Medios solamente debe mantenerse hasta 2 semanas. Esto asegura reactivos tales como dbcAMP y BDNF son frescos y estable. Además, prepara la AR sólo debe ser almacenada durante un máximo de 6 semanas y en la oscuridad antes de que se debe hacer un nuevo lote. Hemos observado una mayor coherencia de los resultados neuronales wITH estas precauciones.
Una vez que las células se han diferenciado en neuronas maduras, que pueden mantenerse durante hasta 2 semanas después de la diferenciación terminal y utilizados para la experimentación. Después de la diferenciación terminal, los medios de comunicación deben cambiarse cada 3-4 días (Diferenciación de Medios # 3). En contraste con las neuronas diferenciadas, los matraces de mantenimiento que contienen cultivos de células SH-SY5Y diferenciadas se pueden mantener durante muchas semanas con pases regular. Es importante culturas mantenimiento pasaje regularmente, para evitar la sobre-población de células de tipo epitelial que ya no son capaces de diferenciarse en neuronas. Cuando estas células superan en número a aquellos con neuro-potencial, la privación de suero hará que cantidades desproporcionadas de la muerte celular. culturas indiferenciadas sólo pueden conservarse durante un máximo de aproximadamente 15 pasajes. Una vez que la cultura ha superado a unos 15 pasajes, las células indiferenciadas comienzan a morir y tienen una apariencia áspera, poco saludable. Además, diferenciación de SH-SY5Y células de alto pasaje es más difícil, ya que un menor número de células sobrevivan cada división, y los que lo hacen a menudo agregación de ambos cuerpos celulares y axones, por lo que los análisis posteriores más difícil.
Hay una clara disminución del número de células durante el proceso de diferenciación tantas células se pierden o no sobreviven el proceso de división. Por lo tanto, al inicio de cualquier experimento con células SH-SY5Y diferenciadas, uno debe tener en cuenta la pérdida de ~ 30-40% de las neuronas y asegurar un número apropiado de células se siembran al comienzo para conseguir el rendimiento deseado. Mientras chapado 100.000 células produce un montón de neuronas, SH-SY5Y maduros sanos, menos o más grandes números pueden ser plateado inicialmente dependiendo de las necesidades experimentales.
Está claro que las neuronas completamente diferenciadas SH-SY5Y proporcionan una aproximación más cercana de las neuronas humanos maduros que se encuentran in vivo que sus contrapartes de células progenitoras no diferenciadas (Figura 2). Estas neuronas proporcionarán un modelo ventajoso para futuras caracterizaciones de su neurobiología, para el estudio de virus neurotrópicos, o para la detección de la toxicidad quimioterapéutica en las neuronas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
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