Abstract
Il reticolo endoplasmatico (ER) contiene il più alto livello di calcio intracellulare, con concentrazioni di circa 5000 volte superiore a livelli citoplasmatici. Stretto controllo sulla ER calcio è un imperativo per ripiegamento proteico, la modifica e il traffico. Perturbazioni ER calcio può provocare l'attivazione della risposta unfolded proteina, un meccanismo di risposta allo stress ER tre poli, e contribuire alla patogenesi di varie malattie. La capacità di monitorare alterazioni ER calcio durante l'insorgenza e la progressione della malattia è importante in linea di principio, ma stimolante in pratica. Metodi attualmente disponibili per monitorare ER calcio, come coloranti e proteine fluorescenti calcio-dipendente, hanno fornito visione dinamica ER calcio nelle cellule, tuttavia questi strumenti non sono adatti per gli studi in vivo. Il nostro laboratorio ha dimostrato che una modifica al carbossi-terminale della luciferasi Gaussia conferisce la secrezione del reporter in risposta aER deplezione di calcio. I metodi per l'utilizzo di una base luciferasi, ER secreta proteina monitoraggio calcio (SERCaMP) in vitro e per applicazioni in vivo sono qui descritti. Questo video mette in evidenza le iniezioni epatiche, manipolazione farmacologica del GLUC-SERCaMP, la raccolta e il trattamento del sangue, e parametri del test per il monitoraggio longitudinale ER calcio.
Introduction
Il reticolo endoplasmatico (ER) funzioni in molte capacità cellulari tra cui il ripiegamento delle proteine, la secrezione di proteine, lipidi omeostasi, e intracellulare di segnalazione 1. Centrale alla funzione ER normale è mantenere le concentrazioni di calcio luminali in ~ 5.000 volte quelli trovati nel citoplasma 2-4. Questo processo intensità energetica è regolata dalla ATPasi sarco / reticolo endoplasmatico calcio (SERCA), una pompa che si muove ioni calcio al pronto soccorso. Passaggio di calcio dalle ER è mediato principalmente dal rianodina (RyR) e trifosfato inositolo (IP3R) recettori. Poiché molti processi ER dipendono calcio, interrompendo il negozio può portare a ER stress e la morte delle cellule.
ER disregolazione del calcio è stata osservata in malattie tra cui cardiomiopatia, diabete, morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e 5. A causa della natura progressiva di queste malattie, è stato impegnativo per delineare la causa-effetto rerappor- tra la patogenesi e alterazioni del negozio ER calcio. Un certo numero di tecnologie hanno permesso significativi progressi nella nostra comprensione delle dinamiche ER calcio, compresi i coloranti e gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS). Coloranti di calcio a bassa affinità, che aumentano di fluorescenza quando si lega a Ca 2+, possono essere caricati in cellule per esaminare compartimenti subcellulari con elevate concentrazioni di calcio 6. GeCIS, quali D1ER e catcher consentire un monitoraggio delle fluttuazioni di calcio con un controllo più preciso della localizzazione subcellulare 7-9. Recentemente, un'altra classe di GECIS chiamati indicatori di proteine organelli-intrappolato-calcio misura (Cepia) sono stati descritti 10. Un terzo approccio che combina la genetica e la piccola molecola chimica è mirata-esterasi dye carico (TED), che utilizza un carbossilesterasi geneticamente codificato (mirato al pronto soccorso), con un calcio di colorante a base di estere-11.
Mentre il aforapprocci ementioned hanno punti di forza e debolezze intrinseche, possono fornire informazioni preziose dinamiche di calcio ER attraverso misure acuti di fluorescenza. Sono, tuttavia, non è ottimale per gli studi longitudinali spesso necessarie per determinare la progressione della malattia. Con l'obiettivo di escogitare un metodo per monitorare dinamiche di calcio per periodi di tempo prolungati, abbiamo identificato e sviluppato una modifica proteina per creare le proteine secrete calcio ER supervisione (SERCaMPs) 12.
SERCaMP elude diversi limiti associati con altre metodologie, fornendo un approccio mini-invasivo per interrogare più volte il negozio ER calcio. Abbiamo precedentemente dimostrato che il peptide ASARTDL carbossiterminale (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-aspartico-leucina) è sufficiente a favorire la ritenzione ER; Tuttavia, in condizioni che causano diminuzioni ER calcio, la sequenza di peptidi non è più in grado di trattenere ER localization e la proteina è secreta 13. La base della tecnologia SERCaMP è l'appendice di ASARTDL al carbossi-terminale di una proteina secreta (es Gaussia luciferasi o Gluc) tale che la secrezione è innescato dalla deplezione ER calcio, creando così un robusto giornalista di ER calcio disregolazione 12. L'espressione di GLUC-SERCaMP tramite metodi transgenici permette fluidi biologici tra cui coltura cellulare di medio e di plasma da analizzare per i cambiamenti nell'attività GLUC come indicatore dell'omeostasi ER calcio. Il metodo ha applicazioni per lo studio longitudinale alterazioni progressive nell'archivio calcio ER sia in vitro che in vivo. Il protocollo che segue è scritto come un quadro generale per l'uso di base-GLUC SERCaMP studiare ER calcio omeostasi, ma il protocollo può servire come guida per SERCaMPs giornalista alternative.
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Protocol
1. In vitro: Individuare SERCaMP uscita da una linea cellulare SH-SY5Y stabile
- Piastra SH-SY5Y-GLUC-ASARTDL (SERCaMP) in coltura trattata piastre a 150.000 cellule per cm 2 di superficie. Per piastre da 96 pozzetti, per esempio, seme 50.000 cellule per pozzetto (Figura 1A). Crescere cellule SH-SY5Y in DMEM (alto glucosio, Glutamax, piruvato) + 10% della crescita bovina di siero + 1x penicillina / streptomicina.
- Cellule Passage fino a 15 volte (Figura 1B). Numero più elevato passaggio non è stato testato.
- Ritorno a cellule incubatore umidificato a 37 ° C con 5,5% di CO 2 e incubare durante la notte.
- Prima del trattamento sperimentale (s), raccogliere un campione di riferimento per ciascun pozzetto con il trasferimento di 5 ml di cultura surnatante in un opaco murato 96 pozzetti. Prima di raccogliere, picchiettare delicatamente la piastra su tutti i lati e agitare per evitare effetti di sfumatura. Sigillare la piastra opaca con un adesivo sfoglio di Ealing e conservare a 4 ° C fino al momento del test enzimatico.
Nota: Secreted GLUC-SERCaMP è molto stabile nel terreno di coltura. Abbiamo precedentemente riportato circa il 5-10% di attività Gluc è stato perso dopo una incubazione 72 ore a 37 ° C (incubato sulle cellule SH-SY5Y) 12. - Il trattamento di cellule, se lo desideri esaminare ER calcio esaurimento (ad esempio ambientale, farmacologico, manipolazioni genetiche). Evitare l'esposizione a lungo condizioni ambientali (al di fuori dell'incubatore controllata) come variazioni di pH sarà rapidamente verificarsi in CO 2 atmosferica. Aggiungere HEPES al mezzo di coltura a 20 mM, per stabilizzare il pH 14, se sono necessarie manipolazioni prolungate. Evitare l'esposizione alla luce durante l'utilizzo HEPES in terreno di coltura 15.
- Controllo positivo: Trattare cellule con 100 tapsigargina nM (Tg) o 50 mM acido ciclopiazonico (CPA) per 4-6 ore per esperimenti in cellule SH-SY5Y. Risposta massima in altre linee cellulari possono richiedere incubazione più lunghi o diverso concenstrazioni di composti.
- Controllo negativo: terreno di coltura Raccogliere da cellule SH-SY5Y parentali. Nella nostra esperienza, la luminescenza di fondo per questo dosaggio è inferiore al 0,05% della secrezione basale di cellule stabili SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP.
- Raccogliere e campioni negozio 5 microlitri di media condizionata al timepoints desiderati, come indicato al punto 1.2.
- Valutare l'attività enzimatica nel medio come indicato nella Sezione 5.
- Esaminare GLUC intracellulare da immunoblot o dosaggio luminescenza.
- Per immunoblot: cellule in tampone RIPA Lisare modificato contenente Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 0,25% sodio desossicolato, 1 mM EDTA, 1% NP40, e inibitori della proteasi. Separato su gel di SDS-poliacrilammide e trasferimento a membrana PVDF 0.20 micron. Incubare a membrana con GLUC anticorpi (1: 2.000 diluizione) notte a 4 ° C. Eseguire incubazione anticorpi e membrana lavaggi secondarie come da protocollo definito dall'utente per reagente rilevamento di scelta.
- Perluminescenza test (Figura 2): eseguire le seguenti operazioni sul ghiaccio:
- Rimuovere tutti i media da pozzetti della piastra di coltura tissutale e risciacquare con 200 ml di PBS freddo.
- Aggiungere 75 ml di tampone di lisi contenente Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% NP40 e inibitori della proteasi in ciascun pozzetto.
- Ruotare la piastra su un agitatore orbitale (120 rpm) a 4 ° C per 20 min.
- Pipetta delicatamente il lisato su e giù con una pipetta multicanale, evitando bolle d'aria. Trasferire 5 ml di lisato ad una piastra opaco e valutare luminescenza come indicato nella Sezione 5.
2. In vitro: trasfezione transiente di cellule immortalati con SERCaMP
Nota: Abbiamo osservato che le procedure di trasfezione transiente può indurre stress cellulare e smorzare la conseguente risposta GLUC-SERCaMP. Il seguente metodo è stato sviluppato per minimizzare trasfezione eff riflette nelle cellule SH-SY5Y. Ottimizzazione della procedura (compreso scelta di reagente di trasfezione) per linee cellulari alternati può essere richiesto. Quando possibile, si consiglia di utilizzare le linee cellulari stabili o metodi di trasduzione virale descritti rispettivamente nei punti 1 e 3.
- Piastra cellule SH-SY5Y in un piatto di 100 mm a 4 x 10 6 cellule. Questo piatto sarà sufficiente riseminare circa 300 pozzetti (96 pozzetti) formato seguendo la procedura di trasfezione.
- Cellule trasfezione con il reagente xfect con 20 mg di DNA plasmidico (codifica GLUC-SERCaMP) e 6 ml di xfect reagente. Scala del DNA e xfect reagente conseguenza per recipienti di coltura più o meno grandi.
- Cellule tornare a incubatore per 48 ore.
- Trypsinize cellule e reseed a 96 pozzetti a 60.000 cellule per pozzetto. Seguire le successive fasi descritte nella Sezione 1.
3. In vitro: mediata vettore virale Espressione di GLUC-SERCaMP
tenda "> Nota: virale adeno-associato (AAV) imballaggio vettore 16 e purificazione 12 e lentivirus produzione 13 sono stati segnalati in precedenza.- Titolo GLUC-SERCaMP AAV utilizzando i seguenti primer e sonde: primer forward, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; primer reverse, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Sonda (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 etichettato), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'per la PCR quantitativa.
- Preparare la curva standard linearizzazione un plasmide contenente GLUC e purificazione del DNA con uno spin-colonna (ad es Machery-Nagel NucleoSpin Gel e PCR pulizia). Quantificare il DNA separando su un gel di agarosio a fianco di una scala di massa. Preparare 1:10 diluizioni del DNA di 100 pg / ml a 10 fg / ml in PBS. Calcolare le copie / ml di DNA plasmidico Gluc in ciascuna delle concentrazioni in base al peso molecolare del plasmide.
- Diluire le scorte AAV in PBS (opportuna diluizione dipenderàparametri di preparazione virale e determinati empiricamente).
- Eseguire la reazione PCR in un sistema PCR in tempo reale utilizzando le seguenti condizioni: 95 ° C x 5 min, 94 ° C × 20 sec e 60 ° C × 1 min per 41 cicli. Calcola copie / ml usando la curva standard.
- Titolo lentivirus con una p24 Lenti-X kit rapida del titolo. Scongelare aliquote lentivirali sul ghiaccio e diluire la proteina p24 di controllo in SH-SY5Y medio.
- Diluire il lentivirus tale che cadrà sulla curva standard (ad esempio, 1: 20.000 o 1: 100.000). Il fattore di diluizione necessaria varia in base ai parametri di preparazione lentivirali e deve essere determinato empiricamente. Seguire le istruzioni del produttore per tutte le fasi successive.
- Cellule piastra a 96 pozzetti. Per le cellule SH-SY5Y, le procedure di placcatura descritte nella sezione 1 possono essere seguite. Per ratto neuroni corticali primarie, le cellule devono essere isolati e seminate su piastre opportunamente rivestite as descritto in precedenza 16. Mantenere ratto neuroni corticali primarie Neurobasal media integrato con 1x B27 e 500 mM L-glutammina. Effettuare scambi e mezzo di media ogni due giorni.
- Trasdurre le cellule con il virus. L'obiettivo di trasduzione virale è quello di raggiungere l'espressione di basso livello, come Gaussia luciferasi fornisce segnale più forte.
- Cellule SH-SY5Y AAV trasduzione: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire AAV a 6.0 x 10 7 vg / ml in tampone di diluizione AAV (PBS + 0.5mm MgCl 2). Aggiungere 5 ml di AAV diluito (3.0 x 10 8 vg; MOI di circa 6.000) per pozzetto di 96 pozzetti (Figura 3A). Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale.
- AAV trasduzione di neuroni corticali di ratto primarie: trasdurre 6-8 giorni dopo la placcatura. Diluire AAV a 4,0 x 10 6 vg / ml in tampone di diluizione AAV. Aggiungere 5 ml di AAV diluito (2.0 x 10 7 vg; MOI di circa 350) per pozzetto di96 pozzetti (Figura 3B). L'ottimale MOI dovrebbe essere determinata empiricamente per altri tipi di cellule. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale.
- Trasduzione lentivirali di cellule SH-SY5Y: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire lentivirus a 20 pg / ml p24 (concentrazione determinato utilizzando kit di titolazione) in soluzione salina bilanciata di Hank. Aggiungere 5μl del virus diluito per bene (100 pg di p24, pari a 1.250.000 particelle lentivirali, o ~ 1.250 IFUs) di una piastra ben 96 contenente 100 ml di volume. Scala di conseguenza per i formati più grandi. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti virale.
- Raccogliere un campione di pre-trattamento dei media e iniziare le cure sperimentali a 48 ore (SH-SY5Y) o 5-7 giorni (ratto neuroni corticali primarie) dopo trasduzione.
4. In Vivo SERCaMP Assay
Nota: Prima di effettuare qualsiasi procedura sugli animali da essere sicuri di ottenere l'approvazione corretta attraverso il vostro istituto. Tuttiambulatori di sopravvivenza sono da fare in condizioni sterili con anestesia adeguata. Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati e sono in conformità con le linee guida NIH ACUC.
- Strumenti chirurgici autoclave prima dell'inizio della chirurgia (121 ° C, 30 min sterilizzazione, 20 min tempo di asciugatura). Pulire tutti gli strumenti in un ultrasonicatore immediatamente seguenti tutte le procedure e prima della sterilizzazione in autoclave. Mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico la sopravvivenza. Per interventi chirurgici che richiedono più animali, pulire strumenti chirurgici con il 70% di alcol, ultrasonicate e tallone sterilizzare tra ratti. Fare riferimento a Materiali Lista per strumenti necessari.
- Preparare topo per la chirurgia. Qui usiamo maschio Sprague-Dawley (180-200 g).
- Anestetizzare ratti utilizzando isoflurano gas per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min) seguita da iniezioni intraperitoneali di xilazina (8 mg / kg) e ketamina (80 mg / kg). Applicare pomata oftalmica per proteggere cornee si secchi. Bchirurgia EGIN una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda o il piede pizzico.
- Radere la regione dell'addome leggermente sotto le costole (bassa regione toracica) alla regione addominale metà. Scrub l'area chirurgica tre volte, alternando il 70% di alcol e Betadine macchia. Mettere ratto in posizione supina su area chirurgica sterile con teli chirurgici sterili.
- Diluire AAV-GLUC-SERCaMP a 7,6 x 10 9 VG / ml (concentrazione finale). Mescolare bene invertendo il tubo.
Nota: Intervallo di concentrazione virale può variare (Figura 4).- Dispensare 105 ml di AAV diluito in un piatto sterile. Usare un ago da 30 gauge per raccogliere il virus in una siringa.
- Eseguire un intervento chirurgico per esporre il fegato e iniettare AAV-GLUC-SERCaMP.
- Prima di effettuare un'incisione nell'addome, applicare bupivacaina 0,25% alla zona di incisione. Usando un bisturi, fare una incisione orizzontale sotto gabbia toracica (approximately 2-3 cm). Blunt sezionare a separare il tessuto connettivo da ipoderma.
- Tagliare muscoli addominali, esponendo il lobo destro mediale del fegato.
Nota: lobi aggiuntivi possono essere iniettati in base all'applicazione finale. - Mettere animale sotto microscopio operatorio e regolare per ottenere il diritto del lobo mediale del fegato nel campo visivo. Iniettare virus nel parenchima del lobo mediale; 3 siti separati, di circa 33 ml per sito.
Nota: Lasciare l'ago nel tessuto per 5-10 secondi dopo l'iniezione per garantire la consegna di tutto il volume di iniezione. - Suturare il muscolo addominale e la pelle separatamente e aggiungere Neosporin utilizzando cotone dell'applicatore punta. Posizionare ratto in una camera di recupero fino coscienza è recuperato e ratto è in grado di mantenere la posizione eretta. Non lasciare ratto (s) incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa singolarmente fino a quando l'incisione è guarita e le suture sono state rimosse (7-14 giorni).
- Inizia coda raccolta del sangue 4-7 giorni dopo l'iniezione. Preparare le provette di raccolta del sangue, mediante l'etichettatura e pre-pesatura. Aggiungere 50 ml di eparina (1.000 U / ml) per ogni provetta.
- Luogo ratto in camera di isoflurano per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min). Rimuovere ratto dalla camera e posto nel naso cono (2-3% isoflurano consegnato a 500 cc / min). La raccolta del sangue può iniziare una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda piNCH.
- Utilizzando le forbici sterili punta taglio della coda (1-2 mm) e raccogliere il sangue goccia a goccia nel tubo eparina pre-riempita. Raccogliere il sangue fino volume raggiunge maggiore di 2: 1 rapporto sangue eparina (> 100 ml sangue / 50 ml di eparina). I volumi di raccolta del sangue possono essere regolati in base a disegno sperimentale. Utilizzare un applicatore di cotone umido per applicare la polvere emostatico alla coda per fermare l'emorragia.
- Provette di sangue Conservare a 4 ° C se la raccolta di campioni successivi. Pulire forbici con fondello etanolo e tallone sterilizzare tra le collezioni.
- Pesare provette per il prelievo e regolare con eparina per ottenere rapporto 2: 1 (sangue: eparina). Questo passaggio normalizzare la quantità di eparina in ciascun campione (Tabella 1).
- Tubi centrifugare a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante (plasma) in una nuova provetta e conservare a -80 ° C fino al momento della luciferasi test (sezione 5).
Nota: Conservazione dei campioni a 4 ° C fino a 72 ore prima del saggio enzimatico ha minimal effetto sulla luminescenza (Figura 5A). Fino a 3 cicli di gelo-disgelo dei campioni di plasma non hanno alcun effetto sulla luminescenza (Figura 5B).
- Amministrazione tapsigargina (controllo positivo):
- Preparare thapsigargin diluendo in etanolo ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Iniettare tapsigargina a 1 mg / kg ip nel basso addome.
Nota: tapsigargina aumenta trombina piastrinica indotta coagulazione 17 e può fare la raccolta di sangue da coda più difficile.
- Preparare thapsigargin diluendo in etanolo ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Iniettare tapsigargina a 1 mg / kg ip nel basso addome.
- Gaussia luciferasi test:
- Scongelare i campioni di plasma sul ghiaccio.
Nota: Per gli studi longitudinali, disgelo e di eseguire test di luminescenza per tutti i campioni tempo di valutazione nella stessa giornata (utilizzando solo la preparazione del sottofondo). - Trasferimento 10 ml di plasma per un piatto di murato opaco e misurare l'attività enzimatica come descritto nel capitolo 5. Eseguire 3-4 repliche tecniche di ogni campione di plasma.
- Scongelare i campioni di plasma sul ghiaccio.
- Euthanasiun
Nota: Il vantaggio della tecnologia SERCaMP è la capacità di monitorare longitudinalmente ER calcio. A seconda di parametri sperimentali e le analisi degli endpoint, gli animali devono essere eutanasia con misure adeguate per le analisi degli endpoint e secondo gli orientamenti ACUC istituzionali.
5. Luminescence Assay
- Preparare soluzioni coelenterazine (CTZ) stock diluendo il composto in metanolo acidificato (30 ml di HCl 10 N a 3 ml di metanolo) a 20 mM. Preparare aliquote monouso e conservare a -80 ° C.
- Preparare il substrato lavorare il giorno di dosaggio.
- Per i saggi in vitro, diluire coelenterazine a 8 micron di PBS, ad esempio, aggiungere 10 ml di 20 mM magazzino CTZ a 25 ml di PBS (Figura 6A, B).
- Per i saggi in vivo, diluire coelenterazine a 100 micron di PBS, 500 mm acido ascorbico, 5 mM NaCl.
- Incubare preparato CTZ per almeno 30 minutia temperatura ambiente prima di iniziare il test.
Nota: Questo passo è spesso incluso in Gaussia saggi di luciferasi in quanto vi sono segnalazioni di rapido decadimento substrato durante la prima 30 minuti dopo la preparazione. Non abbiamo osservato questo effetto nel nostro sistema (Figura 6C); tuttavia, spesso includiamo la fase di incubazione che abbiamo trovato alcun impatto negativo sul dosaggio. - Utilizzare un lettore di piastre che è capace di monitorare bioluminescenza e dotato di un iniettore substrato. Prime le linee con substrato.
Nota: Il substrato iniziale attraverso le linee possono essere soggette a degrado. Per evitare letture artificialmente bassi per i primi campioni, iniettare 20-30 pozzi vuoti (caricamento di un piatto vuoto sul lettore) prima di misurare campioni sperimentali. - Iniettare 100 ml di substrato in bene, agitare velocità media per 5 secondi, e misurare l'emissione di luce. Per il lettore di piastre Biotek Synergy II, integrare l'emissione di luce oltre 0,5 sec (campioni in vitro) e 5 sec (invivo campioni) per la fase di lettura. Ottimizzare i parametri del lettore piastra Per garantire prestazioni ottimali del test.
Nota: mostre Gaussia luciferasi cinetica flash con rapido decadimento del segnale (rispetto a brillare cinetiche osservate con altri luciferasi). La cinetica d'infiammabilità di GLUC è influenzata dal siero in terreno di coltura cellulare (Figura 7A), mettendo in evidenza l'importanza di controllare per la composizione media tra i campioni. A causa del rapido decadimento della luminescenza dopo l'aggiunta del substrato (cinetica Flash), il tempo tra iniezione e leggere passaggi deve essere uniforme per tutti i campioni. Il lettore di piastre deve essere impostato per iniettare substrato un pozzo, attendere un tempo fisso (ad esempio usiamo un frullato passo 5 sec), e leggiamo che bene. Aggiunta di substrato a un intero piatto prima lettura rappresenta una sfida significativa a meno substrato può essere aggiunto a tutti i pozzetti simultaneamente. Se un iniettore non è disponibile, il problema può essere parzialmente aggirato incubando la piastra per 10 minuti fra il supporto addizione e misurazione (evitando così la parte ripida della curva di decadimento) (Figura 7B). - Ripetere l'iniezione, tempo di attesa, e leggere passaggi per ogni pozzetto della piastra.
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Representative Results
Il metodo GLUC-SERCaMP permette per la valutazione di ER calcio omeostasi campionando fluidi extracellulari. Diversi controlli possono essere inclusi nel disegno sperimentale per migliorare l'interpretazione dei risultati. In primo luogo, l'uso di un reporter costitutivamente secreta (ad esempio GLUC senza il ASARTDL C-terminale o "GLUC-No Tag") può essere impiegato per valutare gli effetti dei trattamenti sperimentali sulla via secretoria (secrezione cellulare globale) e l'espressione del transgene. Ad esempio, un aumento dei livelli extracellulari sia Gluc-SERCaMP e Gluc N. Tag sarebbe considerato un risultato ambiguo. In alternativa, un aumento Gluc-SERCaMP secrezione con una corrispondente mancanza di Gluc N. risposta Tag supporta un evento dipendente ER calcio (Figura 8). La secrezione di GLUC-SERCaMP in risposta ad esaurimento ER calcio può essere ulteriormente valutata misurando intracellulare GLUC, anche se questo è limitato ad un singolo timepoint come è richiesto lisi. Int racellular GLUC-SERCaMP diminuirà in risposta alla deplezione ER calcio, come viene progressivamente secreto, e extracellulare: rapporto intracellulare (calcolato per ogni singolo pozzetto) aumenterà (Figura 2B). Il extracellulare: rapporto intracellulare è utile per controllare per i cambiamenti nella espressione del transgene.
Modulatori farmacologici del negozio di calcio pronto soccorso possono essere utilizzati per confermare il contributo di ER calcio per il rilascio SERCaMP in nuovi paradigmi. Dantrolene, un antagonista RyR, è noto per stabilizzare ER calcio, che dovrebbe ridurre o inibire il rilascio di SERCaMP in risposta a Tg (Figura 8B). Si consiglia, quando possibile, per testare composti aggiuntivi che influenzano il flusso di calcio ER (es Xestospongin C, 4-cloro-m-cresolo) in nuovi paradigmi sperimentali che impiegano SERCaMP. Questi studi sono spesso difficili in vivo, ma può essere fattibile in corrispondenti modelli di coltura dei tessuti.
"> Per gli studi in vitro utilizzando SERCaMP-based GLUC, si raccomanda di calcolare le risposte su piatti individuali relativi al controllo (s). La risposta 'indotta dal trattamento' può essere valutata sulla timecourse tracciando cambiamenti nella risposta relativa rispetto ai controlli ( per tra-piastra i confronti). Non è consigliabile confrontare i numeri grezzi su più piatti, a causa di decadimento di substrato, che può portare a cambiamenti nei valori grezzi tra timepoints (Figura 6C). Fare relativi confronti di un piatto riduce al minimo questo effetto (Figura 6D). Un esempio di analisi dei dati per un esperimento di rilascio in vitro Tg indotta SERCaMP è presentato in Figura 9.Per gli studi in vivo utilizzando GLUC-SERCaMP, i dati dovrebbero essere valutati in modo indipendente per ogni animale, ogni animale che serve come il proprio controllo 'pretrattamento'. Ciò è necessario per tenere conto di variabilità del transgeneIvery e di espressione tra animali (figura 4A).
L'entità delle risposte SERCaMP sarà influenzato da una serie di fattori, molti dei quali sono legati alla salute di base delle cellule e possono essere controllati direttamente dallo sperimentatore. Per la massima SERCaMP risposta, è di importanza fondamentale per ottimizzare le condizioni che favoriscono l'omeostasi basale ER calcio. Questo include cellule di semina a densità ottimale e con titoli virali bassi. I diversi tipi di cellule e tessuti possono avere ulteriori requisiti, che devono essere determinate empiricamente.
Figura 1:. Stabile SH-SY5Y linea cellulare densità di semina e le considerazioni numero di passaggio (A), le cellule SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP sono state seminate a varie densità e incubate per 40 ore. Secreta GLUC-SERCaMP è stata misurata 4 ore dopo il trattamento con 300 Nm Tg ocontrollo del veicolo R (media ± SD, n = 6). Aumento tapsigargina indotto GLUC-SERCaMP secrezione è indicato per ogni densità delle cellule. Cellule (B) SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP al numero di passaggio 2 e 15 sono stati esaminati per la secrezione tapsigargina-indotta. Le cellule sono state trattate con 100 nM Tg per 2 ore o 4 ore, e l'attività Gluc secreta era normalizzato di veicoli trattati controlli (media ± SD, n = 4, nessun effetto significativo di passaggio-factor, 2-way ANOVA). Linea tratteggiata indica y = 1. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Saggio enzimatico per misurare intracellulare Gluc-SERCaMP (A) intracellulare e (B) extracellulare attività enzimatica Gluc stata valutata nel ratto cor primarianeuroni tici (trasdotte con AAV-GLUC-SERCaMP). Sei giorni dopo la trasduzione, le cellule sono state trattate con 60 Nm tapsigargina per 4 ore. Come accumula GLUC-ASARTDL nel mezzo, si osservano diminuzioni corrispondenti livelli intracellulari. (C) Un rapporto di extracellulare: attività Gluc intracellulare può essere calcolato per ogni singolo bene.
Figura 3:. AAV-GLUC-ASARTDL titolo contro risposta tapsigargina indotta per le cellule SH-SY5Y e ratto neuroni corticali primari (A), le cellule SH-SY5Y sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a 5 x 10 4 cellule per bene e ha permesso di aderire durante la notte. Le cellule sono state trasdotte alla molteplicità indicato di infezione (MOI), incubate per 48 ore e quindi trattata con 300 nM Tg o veicolo. Luminescenza è stata misurata nel mezzo dopo 8 ore (media ± SEM, n = 3). * P <0,05, multiple t-test (correzione Holm-Sidak). (B) Rat neuroni corticali primari sono stati trasdotte su div8 con AAV-GLUC-ASARTDL al MOI indicato (calcolato con 60.000 cellule per approssimazione bene al momento della trasduzione). Cinque giorni dopo la trasduzione, le cellule sono state trattate con 100 nM Tg o controllo del veicolo e luminescenza nel mezzo è stata misurata dopo 8 ore (media ± SEM, n = 6). * P <0.05, più t-test (correzione Holm-Sidak).
Figura 4:. Tapsigargina-indotta rilascio GLUC-SERCaMP in sangue dopo iniezioni intraepatici oltre gamma di titoli virali (A) i valori di luminescenza prime da ratti (n = 8) intraepaticamente iniettato con diversi titoli AAV-GLUC-ASARTDL. Tapsigargina (1 mg / kg) di iniezione (ip) è stato somministrato il giorno 12. Il sangue è stato raccolto in momenti indicati e conservato a -80 & #176; C fino al momento dell'analisi. (B) i valori di luminescenza normalizzati da pannello A, dimostrando tapsigargina indotta risposta SERCaMP nei ratti (n = 8) che esprime varie quantità di AAV-GLUC-ASARTDL.
Figura 5:. Manipolazione e stoccaggio dei campioni di plasma GLUC-SERCaMP (in vivo) (A) al plasma sono stati raccolti da ratti intraepaticamente esprimere GLUC-SERCaMP (n = 10), aliquotati e conservati a -80 ° C fino al momento di saggi. Tubi sono stati rimossi da -80 ° C e conservati a 4 ° C per tempi indicati prima di effettuarla luminescenza (media ± SD). (B) Effetto multipli di congelamento / disgelo di campioni di plasma su GLUC attività enzimatica. I campioni di plasma raccolti da ratti intraepaticamente esprimere AAV-GLUC-SERCaMP (n = 10) sono stati sottoposti al numero indicatodi cicli gelo-disgelo e analizzati per luminescenza (media ± SD).
Figura 6:. Preparazione del substrato coelenterazine per test GLUC-SERCaMP medio (A) La cultura è stato raccolto da SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP linee cellulari trattate con 300 nm Tg (o controllo del veicolo) per 5 ore. Attività Gluc nel mezzo è stata valutata iniettando PBS + varie concentrazioni di coelenterazine (media ± SD, n = 6). (B) i valori di luminescenza da pannello A sono stati normalizzati per veicolo trattati controllo in ogni concentrazione del substrato per valutare l'effetto tapsigargina indotto. (C) del substrato decadimento per diverse ore. Luminescence da una quantità nota di Gluc ricombinante (0,1 ng o 0,02 ng) è stato misurato per diverse ore dopo la preparazione del substrato (media ± SD, n = 4). (D) Mentre la prima per la luminescenza ricombinanteGluc diminuito nel tempo a causa substrato decadimento, la differenza piega nei campioni (come determinato dalla luminescenza) è stata mantenuta.
Figura 7:. Considerazioni per saggi GLUC-SERCaMP legate alla cinetica di reazione GLUC / CTZ (A) Terreno di coltura altera il decadimento del segnale di GLUC / CTZ. 5 ml di surnatante contenente GLUC-SERCaMP stati mescolati con diversi rapporti di PBS e terreno di coltura. 100 ul di substrato (15 mM CTZ in PBS + 500 mM acido ascorbico) è stato aggiunto a 50 ml di campione è stato diluito come indicato nella tabella. Emissione di luce è stato monitorato oltre 15 min. (B) 5 ml di media è stato raccolto da cellule SH-SY5Y-GLUC-ASARTDL e 100 ml di substrato (8 micron CTZ in PBS + 5 mM NaCl) è stato aggiunto. Luminescenza è stata misurata immediatamente dopo l'aggiunta del substrato (T = 0) ed ogni 30 sec over corso di 15 min (± SD, n = 12). I dati vengono tracciati come segnale percentuale relativa al precedente intervallo di 30 secondi per valutare la velocità di decadimento. L'inserto mostra i dati grezzi luminescenza.
Figura 8:. Conferme farmacologico di esaurimento ER calcio (A) Effetto di 100 Nm tapsigargina su GLUC secrezione è stata esaminata per GLUC-ASARTDL e GLUC-Nessun controllo Tag (media ± SD, n = 6). (B) stabilizzazione ER calcio con dantrolene (RyR antagonista) inibisce il rilascio SERCaMP Tg-indotta. Le cellule sono state pretrattate con le concentrazioni indicate di dantrolene per 30 minuti o 16 ore prima aggiunta di 100 nM thapsigargin. Attività Gluc nel mezzo è stata misurata dopo 4 ore (media ± DS, n = 6).
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Figura 9:. Risultati rappresentativi Mock per il saggio GLUC-SERCaMP Nota veicolo valori trattati possono diminuire tra le piastre, a causa della rottura del substrato (dipende intervallo di tempo tra la lettura di singoli piatti). Per tenere conto di tale effetto, l'effetto del trattamento specifico è calcolata indipendentemente per ogni piatto e questo rapporto viene confrontato attraverso piatti.
| Data | Ratto | Tubo di massa (mg) | Volume eparina (ml) | Eparina densità (g / ml) | massa eparina (mg) | Messa di tubo + eparina (mg) | Massa totale dopo il prelievo di sangue (mg) | Messa di sangue raccolto (mg) | Sangue Densità (g / ml) | Sangue volume calcolato (ul) | Volume di eparina necessaria per rapporto 2: 1 | ml eparina aggiuntivo per aggiungere prima rotazione |
| 01.01.15 | SD Maschio | 1.135,9 | 50 | 1.117 | 55.83 | 1.191,73 | 1.317,70 | 125.97 | 1.05 | 119.97 | 59.98 | 9.98 |
Tabella 1:. La raccolta di sangue tavolo Esempio di registro di raccolta del sangue per gli studi SERCaMP.
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Discussion
Questo protocollo evidenzia in vitro e in vivo di utilità Gluc-SERCaMP monitorare deplezione di ER calcio. Anche se la modifica della proteina di generare SERCaMP sembra generalizzare ad altre proteine reporter di 12, abbiamo scelto Gaussia luciferasi per la sua robustezza (200-1.000 volte maggiore) bioluminescenza rispetto agli altri luciferasi 18. Dimostriamo rilevabile tapsigargina indotta rilascio GLUC-SERCaMP attraverso un range di dosaggio 100 volte virus GLUC-SERCaMP consegnato al ratto primaria neuroni corticali, cellule SH-SY5Y e fegato di ratto (figure 3 e 4). Abbiamo già descritto la generazione di una linea cellulare stabilmente transfettate che esprimono GLUC-ASARTDL e dimostrato che il minor numero di 20 cellule in una popolazione di 5 x 10 4 cellule senza etichetta possono segnalare un tapsigargina indotta risposta 12. Qui mostriamo che la linea cellulare stabile può sempre segnalare risposta Tg-indotta ad 15 passaggi, il più Analyzed, indicando che continua espressione del reporter nel tempo non influisce la sua capacità di essere rilasciato in risposta alla deplezione ER calcio (Figura 1). I nostri dati indicano che GLUC-SERCaMP si svolge principalmente all'interno del pronto soccorso di una cellula fino ad un tempo di ER calcio esaurimento quando è secreta. In condizioni "normali", vi è una ridotta secrezione basale che permette la creazione di riferimento ER calcio omeostasi 12. Seguendo ER calcio deplezione da thapsigargin, livelli di cambiamento luminescenza intracellulare ed extracellulare in direzioni opposte. Questo può essere espresso come un rapporto per indicare un cambiamento nella distribuzione a regime del sensore (Figura 2). È importante sottolineare che, come il rilascio SERCaMP è modulato da espressione dei recettori KDEL 12, la grandezza di stampa può variare a seconda del tipo di cellulare. Noi immaginiamo che la sostituzione 'ASARTDL' con sequenze carbossi-terminali KDEL simile alterni può essere richiesto per ottenere maxirisposta mal SERCaMP in un tipo di cellula o tessuto specifico.
Per i saggi in vitro, livelli di extracellulare Gluc-SERCaMP si accumulano nel tempo a causa della stabilità del reporter secreto; abbiamo riportato una riduzione di circa il 5-10% in attività dopo 72 ore 12. Come tale, lo scambio di media prima di iniziare un farmacologica o genetica sfida per ER calcio omeostasi può essere necessario ridurre segnale di fondo a causa dell'accumulo di sensore. Al contrario, l'emivita di GLUC-SERCAMP in vivo è 3,5-4,7 min 12 segnale che indica nel plasma rappresenta un recente rilascio del reporter in sangue circolante. Una volta che il sangue è ex vivo e lavorati a plasma, tuttavia, Gluc-SERCaMP è molto stabile (figura 5).
Per le metodologie descritte, medio o plasma viene trasferito piastre a 96 pozzetti opachi prima saggi enzimatici. Due fattori importanti da considerare quando si utilizza giornalista-based GLUCs sono cinetica in flash del enzimatici e rottura del supporto coelenterazine. Lettori di piastre dotati di iniettori sono più adatti per l'esecuzione GLUC saggi enzimatici per normalizzare il tempo tra aggiunta di substrato e le misure di luminescenza. Le proprietà chimiche di coelenterazine rendono incline a decadere, che esclude confrontando i valori di luminescenza prime oggetto di valutazione in diversi momenti dopo la preparazione del substrato. Piegare differenze tra i campioni, tuttavia, sono mantenuti (figura 6), consentendo la differenza relativa tra controllo e campioni sperimentali da tracciare sulla durata degli esperimenti (Figura 9).
La capacità di monitorare fluttuazioni ER calcio in vivo è vantaggioso quando si studiano malattie progressive. Mentre altri metodi, come coloranti citoplasmatici fluorescenti, sono adatti per acuta in studi in vitro, un reporter SERCaMP è il primo a consentire il monitoraggio calcio ER longitudinale. Our protocollo delinea iniezioni epatiche dirette di AAV-GLUC-SERCaMP. Abbiamo rilevato livelli costanti di GLUC-SERCaMP in circolazione di animali non contestati per 56 giorni dopo l'iniezione (ultimo timepoint testato finora) e prevedere gli esperimenti più lunghi sono possibili 12. Vettori AAV sono di piccole dimensioni, che misura circa 20 nm di diametro, e pongono requisiti minimi di biosicurezza 19. Per aggirare la conversione di AAV genoma a singolo filamento di DNA a doppia elica, AAV-SERCaMP è stato confezionato come AAV sierotipo-1 doppio filamento vettore 20. AAV sierotipo-1 ha dimostrato di trasdurre efficacemente fegati di ratto 19,21; tuttavia, l'avvertenza della nostra tecnica di iniezione è il potenziale per il virus di viaggiare in altri tessuti in tutto il corpo. Sebbene il vettore è stato iniettato direttamente nel fegato, la nostra metodologia come presentato non può distinguere la fonte di rilascio SERCaMP, e quindi è possibile che tessuti diversi dal fegato possono contribuire al GLUC-SERCSegnale AMP. Manipolazioni genetiche futuri limitare espressione di indirizzare tipi di tessuto. Ad esempio, le linee Cre conducente tessuto-specifici incrociate con un Cre-dipendente GLUC-SERCaMP consentirà di controllare in tessuto-specifica di ER calcio tramite campionamento plasma.
La tecnica descritta in vivo utilizza titoli virali bassa a causa della robustezza del reporter. Rilascio GLUC-SERCaMP può essere rilevata da una gamma virale di 7.6 x 10 7 vg a 7,6 x 10 9 vg (Figura 4). Questa gamma è 4-400 volte inferiore a quello riportato nel precedente lavoro utilizzando iniezioni a base luciferasi-lucciola virali del fegato 19. A concentrazioni più elevate, abbiamo osservato una perdita di espressione rilevabile nel tempo, che è probabilmente dovuto ad una risposta immunitaria dell'animale alla transgene 22. Titoli più elevati di virus devono essere evitati quando possibile a causa della maggiore probabilità di perdita del segnale. Titoli bassi rispetto a quelli presentati non hanno essereit testato. Questo protocollo delinea iniezioni di AAV-GLUC-SERCaMP in fegato; approcci simili sono teoricamente fattibile per altri tipi di tessuto. Parametri quali la concentrazione virale e sierotipo deve essere ottimizzato per sufficiente espressione in altri tessuti.
Data la robustezza del reporter, piccoli volumi di sangue (100-150 ml) possono essere raccolti da ritagli coda, permettendo ripetuti collezioni di tutto esperimenti. Questo è stato utile per la caratterizzazione longitudinale del rilascio GLUC-SERCaMP in risposta a tapsigargina, dove abbiamo osservato livelli elevati dopo la somministrazione tapsigargina seguita da un ritorno ai livelli basali (Figura 4). Corretta manipolazione dei campioni di plasma seguenti raccolta del sangue è anche importante. Come tale, abbiamo dimostrato che SERCaMP è stabile nel plasma conservato a 4 ° C fino a 72 ore prima del saggio enzimatico (Figura 5). Inoltre, campioni di plasma possono essere sottoposti ad almeno tre congelamento / tcicli haw con effetti minimi sulla luminescenza (Figura 5). In pratica, abbiamo memorizzare tutti i campioni a -80 ° C, evitare inutili cicli di gelo-disgelo prima di valutare saggio enzimatico, e analizzare tutti i campioni per un esperimento, allo stesso tempo.
ER deplezione di calcio è implicata nella patogenesi di varie malattie. Si è spesso pensato per essere un evento a monte che ostacola funzioni cellulari e porta all'attivazione del unfolded proteina risposta (UPR). L'UPR è una risposta adattativa impiegato dal pronto soccorso per ristabilire condizioni omeostatiche 5. Gli stati cronici di ER stress superano la capacità della UPR a ripristinare l'omeostasi, in ultima analisi, che porta alla morte cellulare. ER stress ed ER calcio disregolazione sono osservati in malattie come il diabete di tipo 1, nefropatia diabetica, malattie neurodegenerative e cardiovascolari dieases 5. Il rapporto tra disregolazione calcio e patogenesi della malattia, tuttavia, è difficult a delineare. La tecnologia SERCaMP ha il potenziale per tenere traccia di questo processo sulla durata della vita di un animale, fornendo così spaccato sviluppo della malattia e la progressione. Inoltre, la valutazione dei potenziali terapie volte a prevenire o correggere ER calcio disregolazione può essere valutata attraverso l'uso di SERCaMP. Infine, identificando le malattie in cui si verifica il rilascio GLUC-SERCaMP offre l'opportunità di progettare e utilizzare proteine o peptidi terapeutici secrete come SERCaMPs come mezzo di malattia regolate terapia genica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1 ml luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200 microliter filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200 g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200 g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
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