Abstract
Het endoplasmatisch reticulum (ER) bevat het hoogste niveau van intracellulair calcium, bij concentraties die ongeveer 5000-voudig hoger dan cytoplasmatische niveaus. Strakke controle over ER calcium is noodzakelijk voor het vouwen van eiwitten, modificatie en mensenhandel. Storingen ER calcium leidt tot activering van het ongevouwen eiwit respons, een driepolige ER stress respons mechanisme, en bijdragen aan de pathogenese van diverse ziekten. De mogelijkheid om ER calcium veranderingen volgen tijdens begin van de ziekte en progressie van belang in principe maar uitdagende praktijk. Momenteel beschikbare methoden voor de controle ER calcium, zoals calcium-afhankelijke fluorescerende kleurstoffen en eiwitten hebben inzicht gegeven in ER calcium dynamiek in cellen, maar deze instrumenten zijn niet geschikt voor in vivo studies. Ons laboratorium heeft aangetoond dat een wijziging van het carboxy-uiteinde van Gaussia luciferase verleent uitscheiding van de reporter als reactie opER calciumdepletie. De werkwijzen voor het gebruik van luciferase gebaseerde, afgescheiden ER calciumspiegel eiwit (SERCaMP) in vitro en in vivo toepassingen worden hierin beschreven. Deze video belicht de lever injecties, farmacologische manipulatie van Gluc-SERCaMP, bloedafname en verwerking, en test parameters voor longitudinale monitoring van ER calcium.
Introduction
Het endoplasmatisch reticulum (ER) functies in vele cellulaire capaciteiten zoals het vouwen van eiwitten, eiwit secretie, lipide homeostase, en intracellulaire signalering 1. Centraal in normale ER functie handhaaft luminale calciumconcentraties bij ~ 5000 keer die gevonden in het cytoplasma 2-4. Deze energie-intensief proces wordt gereguleerd door de Sarco / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), een pomp die calciumionen verhuist naar de ER. Efflux van calcium uit het ER wordt gemedieerd voornamelijk door de ryanodine (RyR) en inositoltrifosfaat (IP3R) receptoren. Omdat veel ER processen zijn afhankelijk van calcium, verstoren de winkel kan leiden tot ER stress en uiteindelijk celdood.
ER calcium disregulatie waargenomen bij ziekten zoals cardiomyopathie, diabetes, ziekte van Alzheimer en Parkinson 5. Als gevolg van het progressieve karakter van deze ziekten, is het een uitdaging om de oorzaak-effect opnieuw af te bakenenlationship tussen pathogenese en veranderingen in de ER calcium winkel. Een aantal technologieën hebben geleid tot significante vooruitgang in ons begrip van ER calcium dynamiek, waaronder kleurstoffen en genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş). Lage affiniteit calcium kleurstoffen, die toenemen in fluorescentie indien gebonden aan Ca2 +, kan in cellen worden geladen subcellulaire compartimenten met een hoge concentratie calcium 6 onderzocht. Geçiş, zoals D1ER en catcher zorgen voor monitoring van calcium fluctuaties met meer nauwkeurige controle van de subcellulaire lokalisatie 7-9. Onlangs, een andere klasse van Geçiş genoemd calcium meten organel ingesloten eiwit indicators (CEPIA) beschreven 10. Een derde benadering combineert genetica en kleine molecule chemie is gericht loading dye-esterase (TED), waarin een genetisch gecodeerde carboxylesterase (gericht naar de ER) met een op ester gebaseerde calcium kleurstof 11 gebruikt.
Terwijl de AFORementioned benaderingen hebben inherente sterke en zwakke punten, kunnen ze waardevol inzicht in ER calcium dynamiek bieden door middel van acute metingen van de fluorescentie. Ze zijn echter niet optimaal voor longitudinale studies vaak vereist om ziekteprogressie te onderzoeken. Met als doel het ontwerpen van een werkwijze voor calciumdynamiek monitoren gedurende langere tijdsperioden, identificeerden we en ontwikkelde een eiwit wijziging van het uitgescheiden ER calcium controle eiwitten (SERCaMPs) 12 maken.
SERCaMP omzeilt verscheidene beperkingen geassocieerd met andere methoden, door een minimaal invasieve benadering herhaaldelijk ondervragen de ER calcium opslag. We hebben eerder aangetoond dat het carboxy-eindstandige peptide ASARTDL (alanine-serine-alanine-arginine-threonine-asparaginezuur-leucine) voldoende is om ER retentie te bevorderen; echter, onder omstandigheden die leiden tot afname in ER calcium, de peptidesequentie niet meer kan handhaven ER localization en het eiwit wordt uitgescheiden 13. De basis van de SERCaMP technologie is het aanhangsel van ASARTDL het carboxy-uiteinde van een uitgescheiden eiwit (bijv Gaussia luciferase of gluc) zodanig dat secretie veroorzaakt door ER calciumdepletie, waardoor een robuuste reporter van ER calcium disregulatie 12. De expressie van gluc-SERCaMP via transgene werkwijzen maakt biologische vloeistoffen zoals celkweekmedium en plasma worden geanalyseerd op veranderingen in gluc activiteit als indicator van ER calcium homeostase. De werkwijze heeft toepassingen voor longitudinaal onderzoek progressieve veranderingen in het ER calcium opslag zowel in vitro als in vivo. Het volgende protocol is geschreven als een algemene schets voor het gebruik van gluc-gebaseerde SERCaMP ER calciumhomeostase studeren, maar het protocol kan dienen als leidraad voor alternatieve reporter SERCaMPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro test: Het opsporen SERCaMP release van een stabiele SH-SY5Y Cell Line
- Plaat SH-SY5Y-gluc-ASARTDL (SERCaMP) in weefselkweek behandeld platen bij 150.000 cellen per cm2 van de oppervlakte. Voor 96 putjes, bijvoorbeeld zaad 50.000 cellen per putje (figuur 1A). Grow SH-SY5Y cellen in DMEM (hoog glucose, GlutaMAX, pyruvaat) + 10% bovine growth serum + 1x penicilline / streptomycine.
- Passage cellen tot 15 maal (Figuur 1B). Hogere passage nummer is niet getest.
- Terugkeer cellen bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5,5% CO2 en incubeer overnacht.
- Voor experimentele behandeling (en), laat een referentiemonster voor elke wel door de overdracht van 5 ul kweeksupernatant een ondoorzichtige wanden 96 putjesplaat. Voor het verzamelen, tik de plaat aan alle kanten en wervelen om gradiënt effecten te voorkomen. Verzegelen de ondoorzichtige plaat met een lijm sealing blad en bewaar bij 4 ° C op het moment van enzymatische test.
Opmerking: Uitgescheiden gluc-SERCaMP zeer stabiel in celkweekmedium. We eerder gemeld ongeveer 5-10% van GLUC activiteit verloor na 72 uur incubatie bij 37 ° C (geïncubeerd op SH-SY5Y cellen) 12. - Behandel cellen zoals gewenst ER calciumdepletie onderzocht (bv milieu, farmacologische, genetische manipulatie). Vermijd lange blootstelling aan omgevingsomstandigheden (buiten de gecontroleerde incubator) als pH-veranderingen snel zullen plaatsvinden bij atmosferische CO 2. Voeg HEPES aan het kweekmedium bij 20 mM, pH 14 te stabiliseren, indien verlengd manipulaties vereist. Vermijd blootstelling aan het licht bij het gebruik HEPES in kweekmedium 15.
- Positieve controle: Behandel de cellen met 100 nM thapsigargine (Tg) of 50 uM cyclopiazonzuur (CPA) voor 4-6 uur voor experimenten in de SH-SY5Y cellen. Maximale reactie in andere cellijnen kan langer incubaties of verschillende concen vereisentraties van verbindingen.
- Negatieve controle: Collect kweekmedium van ouderlijke SH-SY5Y cellen. In onze ervaring, de achtergrond luminescentie voor deze test is minder dan 0,05% van de basale secretie van stabiel SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellen.
- Verzamelen en opslaan 5 pl monsters van geconditioneerde media op de gewenste tijdstippen, zoals in stap 1,2.
- Beoordelen enzymatische activiteit in het medium zoals beschreven in hoofdstuk 5.
- Onderzoek intracellulaire gluc door immunoblot of luminescentie test.
- Voor immunoblot: lyseren cellen in gemodificeerde RIPA buffer die 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natrium deoxycholaat, 1 mM EDTA, 1% NP40, en proteaseremmers. Afzonderlijk op SDS-polyacrylamidegel en transfer naar 0,20 um PVDF membraan. Incubeer membraan met gluc antilichaam (1: 2000 verdunning) overnacht bij 4 ° C. Voer secundair antilichaam incubatie en wassen membraan volgens gebruiker gedefinieerde protocol voor detectie reagens gekozen.
- Voorluminescentie assay (figuur 2): Voer de volgende stappen op het ijs:
- Verwijder alle medium uit putten van de weefselkweek plaat en spoel af met 200 ul koud PBS.
- Voeg 75 ul lysisbuffer bevattende 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 en proteaseremmers aan elk putje.
- Draai de plaat op een orbitale schudinrichting (120 opm) bij 4 ° C gedurende 20 min.
- Voorzichtig pipet het lysaat op en neer met behulp van een multichannel pipet, het vermijden van luchtbellen. Transfer 5 pi lysaat om een ondoorzichtige plaat en beoordelen luminescentie zoals beschreven in hoofdstuk 5.
2. In Vitro Assay: Transiënte transfectie van geïmmortaliseerde cellen met SERCaMP
Let op: We hebben vastgesteld dat voorbijgaande transfectie procedures cellulaire stress kan veroorzaken en stompe de daaropvolgende gluc-SERCaMP respons. De volgende aanpak is ontwikkeld om transfectie eff minimaliseren ects in SH-SY5Y cellen. Optimalisatie van deze procedure (inclusief keuze van transfectie reagens) voor afwisselende cellijnen nodig zijn. Als het mogelijk is, is het raadzaam om stabiele cellijnen of virale transductie methoden respectievelijk uiteengezet in de punten 1 en 3 te gebruiken.
- Plate SH-SY5Y-cellen in een 100 mm schaal van 4 x 10 6 cellen. Deze schotel voldoende opnieuw seed ongeveer 300 putten (96 well plaat formaat) na transfectie procedure.
- Transfecteren van cellen met Xfect reagens middels 20 ug plasmide DNA (coderende gluc-SERCaMP) en 6 pl Xfect reagens. Grootschalige DNA en Xfect reagens dienovereenkomstig voor grotere of kleinere kweekvaten.
- Terugkeer cellen incubator gedurende 48 uur.
- Trypsinize cellen en reseed 96 putjes bij 60.000 cellen per putje. Volg de volgende stappen in paragraaf 1.
3. In vitro test: Viral Vector-gemedieerde expressie van Gluc-SERCaMP
tent "> Opmerking: adeno-geassocieerde virale (AAV) vector verpakking 16 en de zuivering 12 en lentivirus productie 13 zijn eerder gerapporteerd.- Titer gluc-SERCaMP AAV gebruikmaking van de volgende primers en probes: voorwaartse primer, 5'- CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; reverse primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; probe (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 gemerkte), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'voor kwantitatieve PCR.
- Bereid de standaardcurve door lineariseren een plasmide dat gluc en zuiveren van het DNA met behulp van een spin-kolom (bijv Machery-Nagel NucleoSpin Gel en PCR cleanup). Kwantificeren het DNA door scheiding op een agarosegel naast een massa ladder. Bereid 1:10 verdunningen van DNA van 100 pg / ml op 10 fg / ml in PBS. Bereken de kopieën / ml gluc plasmide-DNA bij elke concentratie op basis van het molecuulgewicht van het plasmide.
- Verdun de AAV voorraden in PBS (geschikte verwatering zal afhankelijk zijnparameters van viruspreparaat en empirisch bepaald).
- Voer de PCR-reactie in een real-time PCR met behulp van de volgende omstandigheden: 95 ° C x 5 min, 94 ° C x 20 sec en 60 ° C x 1 min gedurende 41 cycli. Bereken kopieën / ml met behulp van de standaard curve.
- Titer lentivirus met een p24 Lenti-X snelle titer kit. Dooi lentiviraal monsters op ijs en verdun de controle p24 eiwit in SH-SY5Y medium.
- Verdun het lentivirus zodanig dat deze op de standaardcurve (bijvoorbeeld 1: 20.000 en 1: 100.000) zal vallen. De verdunningsfactor vereiste zal variëren op basis van de lentivirale voorbereiding parameters en moet empirisch worden bepaald. De instructies van de fabrikant voor alle daaropvolgende stappen.
- Plate cellen 96 putjesplaten. Voor de SH-SY5Y cellen, kan plating procedures beschreven in hoofdstuk 1 te worden gevolgd. Voor de rat primaire corticale neuronen, moeten de cellen worden geïsoleerd en gezaaid op de juiste wijze beklede platen eens eerder beschreven 16. Onderhouden rat primaire corticale neuronen in Neurobasal medium aangevuld met 1x B27 en 500 uM L-glutamine. Presteren half medium uitwisselingen om de andere dag.
- Transduceren de cellen met virus. Het doel van virale transductie is te laag niveau van expressie te bereiken, zoals Gaussia luciferase biedt krachtige signaal.
- AAV transductie SH-SY5Y cellen: transduceren de dag na plating. Verdun AAV tot 6,0 x 10 7 vg / ul in AAV verdunningsbuffer (PBS + 0,5 mM MgCl2). Voeg 5 ul van de verwaterde AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI van ongeveer 6000) per putje van 96 well plaat (figuur 3A). Gebruik 10% bleekwater om virale vector afval inactiveren.
- AAV transductie van de rat primaire corticale neuronen: transduceren 6-8 dagen na plating. Verdun AAV tot 4,0 x 10 6 vg / ul in AAV verdunningsbuffer. Voeg 5 ul van de verwaterde AAV (2,0 x 10 7 vg; MOI van ongeveer 350) per well96 putjesplaat (Figuur 3B). De optimale MOI moet empirisch worden bepaald voor andere celtypen. Gebruik 10% bleekwater om virale vector afval inactiveren.
- Lentivirale transductie van SH-SY5Y cellen: transduceren de dag na plating. Verdun lentivirus tot 20 pg / pl p24 (concentratie bepaald met titering kit) in Hank's gebalanceerde zoutoplossing. Voeg 5 pl van de verdunde virus per putje (100 pg van p24, gelijk aan 1.250.000 lentivirale deeltjes, of ~ 1250 IFUs) van een 96 wells plaat met 100 ul volume. Bijgevolg Scale voor grotere formaten. Gebruik 10% bleekwater virale afval inactiveren.
- Verzamel een voorbehandeling steekproef van medium en beginnen experimentele behandelingen 48 uur (SH-SY5Y) of 5-7 dagen (rat primaire corticale neuronen) na transductie.
4. In vivo SERCaMP Assay
Opmerking: Voor het uitvoeren van elk dier procedures moet u de juiste goedkeuring te verkrijgen via uw instelling. Allesurvival ingrepen zijn onder steriele omstandigheden met geschikte anesthesie worden gedaan. Alle procedures hieronder beschreven zijn goedgekeurd en zijn in overeenstemming met NIH ACUC richtlijnen.
- Autoclaaf chirurgische instrumenten voorafgaand aan de start van de operatie (121 ° C, 30 min sterilisatie, 20 min droge tijd). Reinig alle instrumenten in een ultrasonicator direct na alle procedures en voorafgaand aan de autoclaaf. Onderhouden steriele omstandigheden tijdens de operatie te overleven. Voor operaties waarbij meerdere dieren, veeg chirurgische instrumenten met 70% alcohol, ultrasonicate en kralen steriliseren tussen ratten. Raadpleeg Materialen Lijst voor noodzakelijke instrumenten.
- Bereid rat voor een operatie. Hier gebruiken we mannelijke Sprague-Dawley (180-200 g).
- Verdoven ratten met gas isofluraan gedurende 3 min (4-5% isofluraan afgegeven met 1000 cc / min) gevolgd door intraperitoneale injectie van xylazine (8 mg / kg) en ketamine (80 mg / kg). Gelden oogzalf om hoornvliezen beschermen tegen uitdrogen. BEgin operatie zodra de rat is diep verdoofd zoals aangetoond door een gebrek aan terugtrekking reflex volgende staart of voet knijpen.
- Scheren de regio van de buik iets onder de ribben (lage thoracale regio) naar het midden van de buikstreek. Schrob de chirurgische gebied drie keer, afwisselend 70% alcohol en Betadine scrub. Plaats rat in rugligging op steriele chirurgische gebied met steriele chirurgische gordijnen.
- Verdunnen AAV-gluc-SERCaMP tot 7,6 x 10 9 VG / ml (uiteindelijke concentratie). Meng goed door omkeren van de buis.
Opmerking: Bereik van virale concentratie (figuur 4) variëren.- Pipet 105 ul verdund AAV in een steriele schaal. Gebruik een 30-gauge naald om het virus te verzamelen in een spuit.
- Voer operatie aan de lever AAV-Gluc-SERCaMP bloot te leggen en te injecteren.
- Voorafgaand aan het maken van een incisie in de buik, toepassing 0,25% bupivacaïne het incisiegebied. Met behulp van een scalpel, maken een horizontale snede onder ribbenkast (approximately 2-3 cm). Blunt ontleden om bindweefsel te scheiden van onderhuid.
- Snijd buikspier, waardoor de juiste mediale kwab van de lever.
Let op: extra lobben kan geïnjecteerd worden op basis van het einde applicatie. - Plaats dier onder chirurgische microscoop en aan te passen aan rechts mediale kwab van de lever te krijgen in het gezichtsveld. Injecteer virus in parenchym van de mediale kwab; 3 aparte sites, ongeveer 33 ul per site.
Opmerking: Laat de naald in weefsel voor 5-10 seconden na de injectie om de levering van de gehele injectie volume zorgen. - Hechten de buikspier en de huid los en voeg Neosporin met wattenstaafje. Plaats rat in een herstel kamer tot bewustzijn herwonnen en rat is in staat om rechtop te houden. Heeft rat (s) niet onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Huis enkelvoudig totdat de incisie is genezen en hechtingen verwijderd (7-14 dagen).
- Begin staart bloedafname 4-7 dagen na de injectie. Bereid bloedafnamebuisjes etikettering en pre-wegen. Voeg 50 ul heparine (1000 U / ml) aan elke buis.
- Plaats rat in isofluraananesthesie kamer gedurende 3 min (4-5% isofluraan afgegeven met 1000 cc / min). Verwijder rat uit kamer en plaats in neuskegel (2-3% Isoflurane afgeleverd bij 500 cc / min). Bloedafname kan beginnen zodra de rat is diep verdoofd, zoals aangetoond door het ontbreken van de terugtrekking reflex volgende staart pinch.
- Met steriele schaar knippen staartpunt (1-2 mm) en druppelsgewijs verzamelen bloed in voorgevulde heparine buis. Bloed af tot volume van meer dan 2 bereikt: 1 bloed heparine verhouding (> 100 gl bloed / 50 ul heparine). Bloedafname volumes kunnen worden aangepast op basis van experimenteel ontwerp. Gebruik een natte katoenen applicator bloedstelpende poeder van toepassing op de staart om het bloeden te stoppen.
- WINKEL bloed buizen bij 4 ° C indien verzamelen daaropvolgende monsters. Veeg schaar met ethanol pad en kralen steriliseren tussen collecties.
- Weeg collectie buizen en aan te passen met heparine tot 2 te verkrijgen: 1 ratio (bloed: heparine). Deze stap zal de hoeveelheid heparine te normaliseren in elk monster (Tabel 1).
- Centrifugebuizen bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Breng de bovenstaande (plasma) naar een nieuwe buis en bewaar bij -80 ° C op het moment van luciferasetest (hoofdstuk 5).
Opmerking: Opslag van monsters bij 4 ° C tot 72 uur vóór enzymatische test heeft minimal effect op luminescentie (figuur 5A). Maximaal 3 vries-ontdooi cycli van plasmamonsters hebben geen effect op luminescentie (Figuur 5B).
- Thapsigargine administratie (positieve controle):
- Bereid thapsigargin door verdunning in ethanol tot een eindconcentratie van 2,5 mg / ml. Injecteren thapsigargine bij 1 mg / kg ip in de onderbuik.
Opmerking: Thapsigargin verhoogt trombine-geïnduceerde bloedplaatjes stolling 17 en kan bloedafname te maken uit de staart moeilijker.
- Bereid thapsigargin door verdunning in ethanol tot een eindconcentratie van 2,5 mg / ml. Injecteren thapsigargine bij 1 mg / kg ip in de onderbuik.
- Gaussia luciferasetest:
- Ontdooi de plasma monsters op het ijs.
Opmerking: voor longitudinale studies, ontdooien en uitvoeren luminescentie assay voor tijdpunt monsters worden op dezelfde dag (met enkel preparaat substraat). - Overdracht 10 ul van plasma om een ondoorzichtige ommuurde plaat en meet enzymatische activiteit, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Run 3-4 technische replica van elk plasmamonster.
- Ontdooi de plasma monsters op het ijs.
- Euthanasieen
Opmerking: Het voordeel van SERCaMP technologie is de mogelijkheid beeldscherm ER calcium langsrichting. Afhankelijk van de experimentele parameters en eindpunt analyseert, dieren moeten worden gedood door de maatregelen die geschikt zijn voor endpoint analyses en in overeenstemming met de institutionele richtlijnen ACUC.
5. Luminescentie Assay
- Bereid coelenterazine (CTZ) voorraadoplossingen door verdunning van de verbinding in aangezuurde methanol (30 pi 10 N HCl tot 3 ml methanol) tot 20 mM. Bereid eenmalig gebruik aliquots en bewaar bij -80 ° C.
- De werkoplossing substraat op de dag van de assay.
- Voor in vitro assays verdund coelenterazine tot 8 uM in PBS, bijv voeg 10 ul van 20 mM CTZ bouillon aan 25 ml PBS (Figuur 6A, B).
- Voor in vivo testen, verdund coelenterazine tot 100 uM in PBS, 500 mM ascorbinezuur, 5 mM NaCl.
- Incubeer bereid CTZ minstens 30 minbij kamertemperatuur voor aanvang van de test.
Opmerking: Deze stap is vaak opgenomen in Gaussia luciferasetests want er zijn meldingen van een snelle ondergrond verval tijdens de eerste 30 minuten na de voorbereiding. We hebben dit effect niet in ons systeem (figuur 6C) waargenomen; Maar we vaak bevatten de incubatiestap aangezien we geen negatieve gevolgen voor de test gevonden. - Gebruik een plaatlezer die in staat is toezicht bioluminescentie en voorzien van een substraat injector. Prime de lijnen met substraat.
Opmerking: De eerste substraat door de leidingen kunnen gevoelig zijn voor degradatie. Kunstmatig lage waarden voor de vroege monsters te voorkomen, injecteren 20-30 lege putten (het laden van een lege plaat op de lezer) voor het meten van de experimentele monsters. - Injecteer 100 ul substraat in goed, schudden gemiddelde snelheid voor 5 seconden, en meet lichtemissie. Voor de Biotek Synergy II plaatlezer, integreren lichtemissie meer dan 0,5 sec (in vitro monsters) en 5 sec (invivo monsters) voor de lees stap. Optimaliseren plaataflezer parameters voor de ideale test prestaties.
Opmerking: Gaussia luciferase tentoonstellingen flash kinetiek met snelle signaal verval (in vergelijking met kinetiek waargenomen met andere luciferasen gloed). De flitser kinetiek van gluc wordt beïnvloed door serum in celkweek medium (Figuur 7A), met de nadruk op het belang van controle voor middelgrote samenstelling over monsters. Door het snelle verval van luminescentie na toevoeging van substraat (flash kinetiek), de tijd tussen injecteren en lees stappen moeten uniform voor alle monsters. De plaat lezer moet worden ingesteld op substraat injecteren om een goed, wacht een vaste tijd (bijvoorbeeld gebruiken we een 5 sec schudden stap), en lees dat ook. Het toevoegen van substraat om een hele plaat vóór de lezing moeilijk na tenzij substraat aan alle putjes gelijktijdig kunnen worden toegevoegd. Als een injector niet beschikbaar is, kan het probleem gedeeltelijk worden omzeild door incubatie van de plaat gedurende 10 minuten tussen substraat additie en meting (Figuur 7B) (dus de steile deel van het verval curve vermijden). - Herhaal de injectie, wachttijd, en lees stappen voor elke put op de plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gluc-SERCaMP methode maakt het mogelijk voor de beoordeling van de ER calciumhomeostase door bemonstering extracellulaire vloeistoffen. Verschillende controles kunnen in proefopzet interpretatie van de resultaten te verbeteren. Ten eerste kan het gebruik van een constitutief uitgescheiden reporter (bijvoorbeeld gluc zonder het C-eindstandige ASARTDL of "Gluc-No tag") worden toegepast om het effect van experimentele behandelingen op de secretieroute (globale cellulaire secretie) en transgenexpressie beoordelen. Bijvoorbeeld, zou een verhoging van de extracellulaire niveaus van zowel gluc-SERCaMP en Gluc-nr tag worden beschouwd als een dubbelzinnige resultaten. Als alternatief kan een toename gluc-SERCaMP secretie met een hiermee gepaard gaande gluc-nr Tag respons ondersteunt een ER calcium event (Figuur 8). De afscheiding van gluc-SERCaMP reactie op ER calciumdepletie kan verder beoordeeld door het meten van intracellulaire Gluc, maar dit is beperkt tot één tijdstip als lysis vereist. Int racellular gluc-SERCaMP afnemen in reactie op ER calciumdepletie, aangezien het geleidelijk wordt afgescheiden, en het extracellulaire: intracellulaire verhouding (berekend voor elk afzonderlijk putje) zal toenemen (Figuur 2B). Het extracellulaire: intracellulaire verhouding is nuttig om te controleren voor veranderingen in transgenexpressie.
Farmacologische modulatoren van de calcium ER winkel kan worden gebruikt om de bijdrage van ER calcium SERCaMP release in nieuwe paradigma bevestigen. Dantroleen een RyR antagonist is bekend ER calcium, die moet verminderen of remmen de afgifte van SERCaMP reactie op Tg (figuur 8B) te stabiliseren. Aanbevolen wordt, indien mogelijk, om extra verbindingen die ER calcium flux (bijvoorbeeld Xestospongin C, 4-chloor-m-cresol) bij nieuwe experimentele paradigma dienst SERCaMP beïnvloeden testen. Deze studies zijn vaak tegen in vivo, maar kan haalbaar overeenkomstige weefselkweek modellen.
"> Voor in vitro studies met gluc-gebaseerde SERCaMP, wordt aanbevolen om responsen op afzonderlijke platen opzichte van de controle (s) te berekenen. Kan de" behandeling geïnduceerde "respons via tijdsverloop wordt duidelijk door veranderingen in relatieve respons versus controle ( voor tussen-plate vergelijkingen). Het is niet wenselijk voor ruwe getallen vergelijken meerdere platen wegens verval van substraat, dat kan leiden tot veranderingen in de onbewerkte waarden tussen tijdstippen (figuur 6C). Het maken van relatieve vergelijkingen binnen een plaat minimaliseert dit effect (figuur 6D). Een voorbeeld van data-analyse van een in vitro Tg-geïnduceerde SERCaMP afgifte experiment is weergegeven in figuur 9.Voor in vivo studies met Gluc-SERCaMP, gegevens moeten worden onafhankelijk voor elk dier onderzocht met elk dier wordt als zijn eigen 'voorbehandeling' controle. Dit is nodig om rekening te houden met de variabiliteit in transgene delIvery en expressie tussen dieren (Figuur 4A).
De omvang van SERCaMP antwoorden worden beïnvloed door diverse factoren, waarvan vele zijn aan basislijn gezondheid van de cellen en kan direct worden bestuurd door de onderzoeker. Voor maximale SERCaMP reactievermogen, is het noodzakelijk om omstandigheden die basale ER calciumhomeostase gunst te optimaliseren. Dit omvat zaaien cellen bij een optimale dichtheid en het gebruik van een lage virale titers. Verschillende cellen en weefsel types kunnen hebben aanvullende eisen, die empirisch moeten worden bepaald.
Figuur 1:. Stabiele SH-SY5Y cellijn zaaien dichtheid en de doorgang aantal overwegingen (A) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellen werden gezaaid bij verschillende dichtheden en gedurende 40 uur. Uitgescheiden gluc-SERCaMP gemeten 4 uur na behandeling met 300 nM Tg or mediumcontrole (gemiddelde ± SD, n = 6). Thapsigargine-geïnduceerde toename in gluc-SERCaMP secretie is geïndiceerd voor elke cel dichtheid. (B) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellen bij passage nummer 2 en 15 werden onderzocht op-thapsigargine geïnduceerde secretie. Cellen werden behandeld met 100 nM Tg gedurende 2 uur of 4 uur, en afgescheiden GLUC activiteit genormaliseerd naar vehikel behandelde controles (gemiddelde ± SD, n = 4, geen significant effect passage-factor, 2-way ANOVA). Gestippelde lijn geeft y = 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Enzymatische assay voor het meten van intracellulair gluc-SERCaMP (A) Intracellulaire en (B) GLUC extracellulaire enzymatische activiteit werd beoordeeld in primaire rat corsche neuronen (getransduceerd met AAV-gluc-SERCaMP). Zes dagen na transductie werden de cellen behandeld met 60 nM thapsigargin 4 uur. Als gluc-ASARTDL accumuleert in het medium, worden overeenkomstige afname van de intracellulaire niveaus waargenomen. (C) Een verhouding van extracellulair: intracellulaire GLUC activiteit kan worden berekend voor elke put.
Figuur 3:. AAV-Gluc-ASARTDL titer versus-thapsigargin geïnduceerde respons voor SH-SY5Y cellen en rat primaire corticale neuronen (A) SH-SY5Y cellen werden gezaaid in 96 putjesplaten bij 5 x 10 4 cellen per putje en toegestaan te hechten 's nachts. Cellen werden getransduceerd op de aangegeven multipliciteit van infectie (MOI) gedurende 48 uur en vervolgens behandeld met 300 nM Tg of voertuig. Luminescentie werd gemeten in het medium na 8 uur (gemiddelde ± SEM, n = 3). * P <0,05, multiple t-toetsen (Holm-Sidak correctie). (B) primaire Rat corticale neuronen werden getransduceerd op DIV8 met AAV-Gluc-ASARTDL op de aangegeven MOI (berekend met behulp van 60.000 cellen per putje aanpassing op het moment van transductie). Vijf dagen na transductie werden de cellen behandeld met 100 nM Tg of het voertuig en luminescentie in het medium werd na 8 uur (gemiddelde ± SEM, n = 6). * P <0,05, multiple t-testen (Holm-Sidak correctie).
Figuur 4:. Thapsigargin geïnduceerde Gluc-SERCaMP introductie in bloed na intrahepatische injecties overbereik van virale titers (A) Ruw luminescentie waarden van ratten (n = 8) intrahepatisch geïnjecteerd met verschillende AAV-Gluc-ASARTDL titers. Thapsigargin (1 mg / kg) injectie (ip) toegediend op dag 12. Bloed werd op aangegeven tijdstippen verzameld en opgeslagen bij -80 & #176; C op het moment van test. (B) De genormaliseerde luminescentie waarden van paneel A, waaruit blijkt thapsigargin-geïnduceerde SERCaMP respons bij ratten (n = 8) tot expressie verschillende hoeveelheden AAV-Gluc-ASARTDL.
Figuur 5:. Hantering en opslag van gluc-SERCaMP plasmamonsters (in vivo) (A) Plasma werd uit ratten intrahepatisch expressie gluc-SERCaMP (n = 10), in porties verdeeld en bewaard bij -80 ° C tot tijd van testen. Buizen werden verwijderd uit -80 ° C en opgeslagen bij 4 ° C gedurende aangegeven tijden vóór luminescentiemeting (gemiddelde ± SD). (B) Effect van meerdere vries / dooi van plasma monsters op gluc enzymatische activiteit. Plasma monsters van ratten intrahepatisch expressie AAV-gluc-SERCaMP (n = 10) werden onderworpen aan het aangegeven aantalvan vries-dooi cycli en geanalyseerd op luminescentie (gemiddelde ± SD).
Figuur 6:. Voorbereiden coelenterazine substraat voor gluc-SERCaMP assays (A) cultuur medium werd verzameld uit SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellijnen behandeld met 300 nm Tg (of het voertuig) voor 5 uur. Gluc activiteit in het medium werd bepaald door injectie van PBS + verschillende concentraties coelenterazine (gemiddelde ± SD, n = 6). (B) Luminescence waarden van paneel A werden genormaliseerd drager behandelde controle aan elke substraatconcentratie de thapsigargin-geïnduceerde effect te beoordelen. (C) Substrate verval gedurende meerdere uren. Luminescentie van een bekende hoeveelheid recombinant gluc (0,1 ng of 0,02 ng) werd gedurende enkele uren na bereiding substraat (gemiddelde ± SD, n = 4). (D) Terwijl de ruwe luminescentie voor de recombinanteGluc gedaald tijd als gevolg van verval substraat, het voudig verschil in de monsters (zoals bepaald met luminescentie) werd gehandhaafd.
Figuur 7:. Overwegingen voor gluc-SERCaMP assays betrekking tot kinetiek van GLUC / CTZ reactie (A) Kweekmedium wijzigt het verval van GLUC / CTZ signaal. 5 pl supernatant die gluc-SERCaMP werd gemengd met verschillende verhoudingen van PBS en kweekmedium. 100 pi substraat (15 pM CTZ in PBS + 500 mM ascorbinezuur) werd toegevoegd aan 50 pl monster dat werd verdund zoals aangegeven in de tabel. Lichtemissie werd gevolgd gedurende 15 min. (B) 5 pi medium werd verzameld van SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL cellen en 100 pi substraat (8 uM CTZ in PBS + 5 mM NaCl) werd toegevoegd. Luminescentie werd gemeten onmiddellijk na het toevoegen van substraat (T = 0) en om de 30 sec boven de loop van 15 min (± SD, n = 12). Gegevens worden uitgezet als het percentage signaal ten opzichte van de vorige 30 sec interval om de vervalsnelheid beoordelen. De inzet toont de ruwe data luminescentie.
Figuur 8:. Farmacologische bevestiging van ER calciumdepletie (A) Effect van 100 nM thapsigargin op GLUC uitscheiding werd onderzocht gluc-ASARTDL en Gluc-nr Tag control (gemiddelde ± SD, n = 6). (B) stabiliseren ER calcium met dantroleen (RyR antagonist) remt Tg-geïnduceerde SERCaMP release. De cellen werden voorbehandeld met de aangegeven concentraties van dantroleen gedurende 30 minuten of 16 uur voor toevoeging van 100 nM thapsigargine. Gluc activiteit in het medium werd gemeten na 4 uur (gemiddeld ± SD, n = 6).
99fig9.jpg "/>
Figuur 9:. Mock representatieve resultaten voor de gluc-SERCaMP test Opmerking het voertuig behandeld waarden kan dalen tussen de platen, als gevolg van afbraak (afhankelijk van de tijd tussen het lezen van afzonderlijke platen) substraat. Ter compensatie van dit effect, wordt de behandeling specifiek effect afzonderlijk berekend voor elke plaat en deze verhouding vergeleken tussen platen.
| Datum | Rat | Buis massa (mg) | Heparine volume (ml) | Heparine dichtheid (g / ml) | heparine massa (mg) | Massa van de buis + heparine (mg) | Totale massa na de bloedafname (mg) | Massa van de verzamelde bloed (mg) | Dichtheid bloed (g / ml) | Berekende bloedvolume (UL) | Hoeveelheid heparine nodig voor 2: 1-verhouding | ml extra heparine aan toevoegen voordat draaien |
| 01.01.15 | SD Man | 1135,9 | 50 | 1,117 | 55.83 | 1191,73 | 1317,70 | 125,97 | 1.05 | 119,97 | 59,98 | 9.98 |
Tabel 1:. Bloedafname tafel Voorbeeld van bloedafname log voor SERCaMP studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wijst op de in vitro en in vivo bruikbaarheid van gluc-SERCaMP uitputting van ER calcium te controleren. Hoewel het eiwit wijziging SERCaMP genereren lijkt te generaliseren naar andere reporter eiwitten 12, kozen we Gaussia luciferase voor zijn robuuste (200-1000 keer groter) bioluminescentie in vergelijking met andere luciferasen 18. We tonen detecteerbare thapsigargin geïnduceerde Gluc-SERCaMP afgifte over een 100-voudige dosisbereik van gluc-virus SERCaMP afgeleverd primaire rat corticale neuronen, SH-SY5Y cellen en rattenlever (figuren 3 en 4). We eerder beschreven het genereren van een stabiel getransfecteerde cellijn die gluc-ASARTDL en toonde dat zo weinig als 20 cellen in een populatie van 5 x 10 4 ongelabelde cellen een thapsigargin geïnduceerde respons 12 kan melden. Hier laten we zien dat de stabiele cellijn consequent kan melden Tg-geïnduceerde respons out tot 15 passages, de meest Analyzed, wat aangeeft dat voortdurende expressie van het verloop van tijd het vermogen geen invloed heeft worden vrijgegeven in reactie op ER calciumdepletie (figuur 1). Onze gegevens geven aan dat gluc-SERCaMP voornamelijk plaats in het ER van een cel tot een tijd van ER calciumdepletie wanneer het wordt uitgescheiden. Onder "normale" omstandigheden, er is een lage basale secretie dat de oprichting van de baseline ER calciumhomeostase 12 toelaat. Na ER calciumdepletie door thapsigargin, niveaus van intracellulaire en extracellulaire luminescentie verandering in tegengestelde richtingen. Dit kan worden uitgedrukt als een verhouding tot een verschuiving in steady state verdeling van de sensor (figuur 2) te geven. Belangrijk is, zoals SERCaMP afgifte wordt gemoduleerd door KDEL receptor expressie 12, de omvang van de vrijgave variabel celtype. We zien dat het vervangen van 'ASARTDL' met afwisselend KDEL-achtige carboxyterminale sequenties kunnen worden verplicht om maxi bereikenmal SERCaMP respons in een specifieke cel of weefsel type.
Voor in vitro assays zullen niveaus van extracellulair gluc-SERCaMP tijd accumuleren als gevolg van de stabiliteit van het uitgescheiden reporter; we meldde een geschatte 5-10% afname van de activiteit na 72 uur 12. Als zodanig, voorafgaand aan het initiëren uitwisselen medium een farmacologische of genetische uitdaging ER calcium homeostase kan nodig zijn achtergrondsignaal te verlagen vanwege sensor accumulatie. In tegenstelling, de halfwaardetijd van Gluc-SERCAMP in vivo 3,5-4,7 min 12 aangeeft signaal in plasma is een recente versie van de reporter in het circulerende bloed. Zodra bloed ex vivo en verwerkt om plasma echter gluc-SERCaMP is zeer stabiel (figuur 5).
Bij de beschreven werkwijzen wordt medium of plasma overgebracht naar ondoorzichtige platen met 96 putjes voor enzymatische assays. Twee belangrijke factoren om te overwegen bij het gebruik gluc-gebaseerde reporters zijn van het enzym flash kinetiek en afbraak van de coelenterazine substraat. Plaatlezers uitgerust met injectoren zijn het best geschikt voor het uitvoeren gluc enzymatische assays om de tijd tussen substraattoevoeging en luminescentie meting aanpassen. De chemische eigenschappen van coelenterazine maken het gevoelig voor verval, die zich verzet tegen het vergelijken van ruwe luminescentie gemeten op verschillende tijdstippen na de voorbereiding van de ondergrond. Voudige verschillen tussen monsters worden echter behouden (Figuur 6), waarbij het relatieve verschil tussen controle en experimentele monsters worden gevolgd tijdens de duur van experimenten (Figuur 9).
De mogelijkheid om ER calcium fluctuaties te controleren in vivo voordelig bij het onderzoek van progressieve ziekte. Terwijl andere methoden, zoals fluorescerende kleurstoffen cytoplasmische, geschikt voor acuut in vitro studies, een SERCaMP reporter eerste longitudinale ER calcium toezicht staan. Our protocol beschrijft directe lever injecties van AAV-Gluc-SERCaMP. We hebben stabiele niveaus van gluc-SERCaMP in omloop onbetwiste dieren waargenomen gedurende 56 dagen na injectie (laatste tijdstip getest dusver) en voorspellen meer experimenten mogelijk 12. AAV-vectoren zijn klein, van ongeveer 20 nm in diameter, en stelt minimale eisen biosafety 19. Om de omzetting van AAV enkelstrengs genoom aan dubbelstrengs DNA te omzeilen, werd AAV-SERCaMP verpakt als een AAV serotype-1 dubbelstrengs vector 20. AAV serotype-1 is aangetoond effectief te transduceren rattenlevers 19,21; De waarschuwing van onze injectietechniek is het potentieel voor virus naar andere weefsels in het lichaam. Hoewel de vector werd rechtstreeks geïnjecteerd in de lever, kan onze methodologie zoals die bron van SERCaMP release onderscheiden, en daarom is het mogelijk dat andere dan de leverweefsels kan bijdragen aan de Gluc-SERCaMP signaal. Toekomstige genetische manipulaties zal meningsuiting beperken tot soorten weefsel richten. Bijvoorbeeld weefsel-specifieke Cre driver lijnen gekruist met een Cre-afhankelijke Gluc-SERCaMP zal zorgen voor weefsel-specifieke monitoring van ER calcium via plasma bemonstering.
De beschreven techniek maakt gebruik van in vivo lage virale titers vanwege het robuuste karakter van de reporter. Gluc-SERCaMP afgifte kunnen worden gedetecteerd uit een virale reeks van 7,6 x 10 7 vg tot 7,6 x 10 9 vg (figuur 4). Dit bereik is 4-400 keer lager dan gerapporteerd in eerder werk gebruik te maken van vuurvlieg-luciferase gebaseerde virale injecties van de lever 19. Bij hogere concentraties, zagen we een verlies van detecteerbare expressie in de tijd, die mogelijk door een immune respons van het dier op het transgen 22. Hogere titers van virus worden zoveel mogelijk vermeden vanwege verhoogde kans op signaalverlies. Lagere titers dan die gepresenteerd zijn nieten getest. Dit protocol beschrijft injecties van AAV-Gluc-SERCaMP in de lever; Soortgelijke benaderingen zijn in theorie haalbaar andere weefseltypes. Parameters zoals virale concentratie en serotype moeten worden geoptimaliseerd voor voldoende expressie in andere weefsels.
Vanwege de robuuste aard van de verslaggever, kunnen kleine hoeveelheden bloed (100-150 ul) worden verzameld uit de staart knipsels, waardoor herhaalde collecties in heel experimenten. Dit is nuttig voor longitudinale karakterisering van GLUC SERCaMP-afgifte in reactie op thapsigargin waar we waargenomen verhoogde niveaus thapsigargin na toediening gevolgd door een terugkeer naar de basislijn niveaus (figuur 4). Goede verloop van de plasmamonsters volgende bloedafname is ook belangrijk. Als zodanig, hebben we aangetoond dat SERCaMP stabiel in plasma bewaard bij 4 ° C tot 72 uur voorafgaande aan enzymatische assay (figuur 5). Bovendien kunnen plasmamonsters wordt ten minste drie vries / thaw rijwielen met minimaal effect op de luminescentie (figuur 5). In de praktijk bewaren we monsters bij -80 ° C, onnodig vries-dooi cycli voorafgaand aan de beoordeling enzymatische assay, en analyseren van alle monsters van een experiment op hetzelfde moment.
ER calciumdepletie is betrokken bij de pathogenese van uiteenlopende ziekten. Vaak wordt gedacht aan een stroomopwaartse gebeurtenis die celfuncties belemmert en leidt tot de activering van het ongevouwen eiwit respons (UPR) zijn. De UPR is een adaptieve respons dienst van de ER naar homeostatic omstandigheden 5 te herstellen. Chronische toestanden van ER spanning boven de capaciteit van de UPR homeostase te herstellen, wat uiteindelijk leidt tot celdood. ER stress en ER calcium disregulatie waargenomen bij ziekten zoals type 1 diabetes, diabetische nefropathie, neurodegeneratieve ziekten en cardiovasculaire dieases 5. De verhouding tussen calcium disregulatie en pathogenese is echter moeiult te bakenen. De SERCaMP heeft het potentieel om dit proces te volgen over de levensduur van een dier, waardoor inzicht in de ontwikkeling en progressie van de ziekte. Bovendien is de evaluatie van de potentiële therapeutische ontworpen om te voorkomen of te corrigeren ER calcium ontregeling kan worden beoordeeld door het gebruik van SERCaMP. Tenslotte identificeren van ziekten waarbij gluc-SERCaMP afgifte plaatsvindt biedt de mogelijkheid om ontwerpen en maken gebruik uitgescheiden therapeutische proteïnen of peptiden als SERCaMPs als middel ziekte gereguleerd gentherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1 ml luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200 microliter filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200 g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200 g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
