Abstract
Endoplasmanätet (ER) innehåller den högsta nivån av intracellulärt kalcium, med koncentrationer ungefär 5000 gånger högre än cytoplasma nivåer. Strikt kontroll över ER kalcium är viktigt för proteinveckning, modifiering och människohandel. Störningar till ER kalcium kan resultera i aktivering av den ovikta proteinsvar, en tre-punkts ER stressrespons mekanism, och bidra till patogenes i en mängd olika sjukdomar. Förmågan att övervaka ER kalcium förändringar under sjukdoms uppkomsten och utvecklingen är principiellt viktigt, men utmanande i praktiken. För närvarande tillgängliga metoder för att övervaka ER kalcium, såsom kalciumberoende fluorescerande färgämnen och proteiner, har gett insikt i ER kalcium dynamik i celler, men dessa verktyg är inte väl lämpade för in vivo-studier. Vårt laboratorium har visat att en ändring till karboxiterminalen av Gaussia luciferas ger utsöndring av reportern som svar påER kalcium utarmning. Metoderna för användning av en luciferas baserad, utsöndrade ER kalcium övervakningsprotein (SERCaMP) för in vitro och in vivo applikationer beskrivs häri. Denna video belyser lever injektioner, farmakologisk manipulation av Gluc-SERCaMP, insamling och bearbetning av blod, och analysparametrar för längsgående övervakning av ER kalcium.
Introduction
Endoplasmanätet (ER) fungerar i många cellulära kapacitet, inklusive proteinveckning, proteinutsöndring, lipidhomeostas och intracellulära signal 1. Centralt för normal ER funktion är att upprätthålla luminala kalciumkoncentrationer vid ~ 5000 gånger högre än de som finns i cytoplasman 2-4. Denna energikrävande process regleras av Sarco / endoplasmatiska retiklet kalcium ATPas (SERCA), en pump som rör sig kalciumjoner in i ER. Utflödet av kalcium från ER förmedlas främst av ryanodin (Ryr) och inositoltrifosfat (IP3R) receptorer. Eftersom många ER processer är beroende av kalcium, kan störa affären leda till ER stress och slutligen celldöd.
ER kalcium dysreglering har observerats vid sjukdomar inklusive kardiomyopati, diabetes, Alzheimers och Parkinsons 5. På grund av den progressiva karaktären av dessa sjukdomar, har det varit en utmaning att beskriva orsak-verkan relation mellan patogenes och förändringar i ER kalcium butiken. Ett antal tekniker har gjort det möjligt för betydande framsteg i vår förståelse av ER kalcium dynamik, inklusive färger och genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs). Låg affinitet kalcium färgämnen, som ökar i fluorescens när de är bundna till Ca2 +, kan laddas in i celler för att undersöka subcellulära fack med höga koncentrationer av kalcium 6. GECIs, såsom D1ER och stopparen tillåter att kontrollera kalcium fluktuationer med mer exakt kontroll av subcellulär lokalisering 7-9. Nyligen, en annan klass av GECIs kallade kalciummätningsorganell-infångade proteinindikatorer (CEPIA) har beskrivits 10. En tredje strategi som kombinerar genetik och liten molekyl kemi är riktade-esteras färgämne lastning (TED), som utnyttjar en genetiskt kodad karboxylesteras (riktad mot ER) med en esterbaserad kalcium färgämne 11.
Medan AFORementioned tillvägagångssätt har inneboende styrkor och svagheter, de kan ge värdefull insikt i ER kalcium dynamik genom akuta mätningar av fluorescens. De är emellertid inte optimal för de longitudinella studierna ofta som krävs för att undersöka sjukdomsprogression. Med målet att ta fram en metod för att övervaka kalcium dynamik över långa tidsperioder, vi identifierat och tagit fram en proteinmodifiering för att skapa de utsöndrade ER kalcium övervaknings proteiner (SERCaMPs) 12.
SERCaMP kringgår flera begränsningar som är förknippade med andra metoder, genom att tillhandahålla en minimalt invasiv metod för att upprepade gånger avfråga ER kalcium butiken. Vi har tidigare visat att den karboxiterminala peptiden ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-asparaginsyra-leucin) är tillräcklig för att befrämja kvarhållande i ER; dock under förhållanden som orsakar minskningar i ER kalcium, är inte längre kunna behålla ER localizatio peptidsekvensenn och proteinet utsöndras 13. Grunden för SERCaMP teknik är bihang ASARTDL till karboxiterminalen av ett utsöndrat protein (t.ex. Gaussia luciferas, eller gluk) så att utsöndring utlöses av ER kalcium utarmning, vilket skapar en robust reporter av ER kalcium dysreglering 12. Expressionen av Gluc-SERCaMP via transgena metoder möjliggör biologiska vätskor inklusive cellodlingsmedium och plasma som skall analyseras med avseende på förändringar i Gluc aktivitet som en indikator av ER kalciumhomeostas. Metoden har ansökningar om longitudinell studie av progressiva förändringar i ER kalcium butiken både in vitro och in vivo. Följande protokoll är skriven som en allmän översikt för att använda Gluc-baserade SERCaMP att studera ER kalciumhomeostas, men protokollet kan tjäna som vägledning för alternativa reporter SERCaMPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro-analys: Upptäcka SERCaMP Kommuniké från en stabil SH-SY5Y cellinje
- Plate SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) i vävnadskultur behandlade plattor med 150.000 celler per cm2 yta. För plattor med 96 brunnar, till exempel utsäde 50000 celler per brunn (Figur 1A). Väx SH-SY5Y-celler i DMEM (hög glukos, GlutaMAX, pyruvat) + 10% bovint tillväxthormon serum + 1x penicillin / streptomycin.
- Passage celler upp till 15 gånger (Figur 1B). Högre passagenummer har inte testats.
- Återgå celler till fuktad inkubator vid 37 ° C med 5,5% CO2 och inkubera över natten.
- Innan experimentell behandling (s), samla en baslinjeprovet för varje brunn genom att överföra 5 il kultursupernatant till en ogenomskinlig muromgärdade 96 brunnar. Innan insamling, knacka försiktigt plattan på alla sidor och snurra för att undvika lutning effekter. Täta ogenomskinliga plattan med ett lim sealing ark och förvara vid 4 ° C förrän vid enzymatisk analys.
Obs: utsöndrat Gluc-SERCaMP är mycket stabil i cellodlingsmedium. Vi rapporterade tidigare cirka 5-10% av Gluc aktiviteten förlorades efter 72 h inkubation vid 37 ° C (inkuberades på SH-SY5Y-celler) 12. - Behandla celler som önskas för att undersöka ER kalcium utarmning (t.ex. miljö, farmakologisk, genetiska manipulationer). Undvik lång exponering för omgivningen (utanför det kontrollerade inkubator) som pH-förändringar kommer snabbt inträffar vid atmosfärs CO2. Lägg HEPES till odlingsmediet vid 20 mM, för stabilisering av pH 14, om långvariga manipulationer krävs. Undvik exponering för ljus när du använder HEPES i odlingsmedium 15.
- Positiv kontroll: Behandla celler med 100 nM tapsigargin (Tg) eller 50 iM cyclopiazonic syra (CPA) för 4-6 timmar för experiment i SH-SY5Y-celler. Maximal respons i andra cellinjer kan kräva längre inkubationer eller olika koncen-trationer av föreningar.
- Negativ kontroll: Collect odlingsmedium från föräldra SH-SY5Y celler. I vår erfarenhet, är bakgrunden luminiscens för denna analys är mindre än 0,05% av den basala sekretionen från stabila SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP celler.
- Samla in och lagra 5 ul prover av konditionerade media vid önskade tidpunkter, som det beskrivs i steg 1,2.
- Bedöm enzymatisk aktivitet i mediet som beskrivs i avsnitt 5.
- Undersök intracellulär gluk med immunoblot eller luminescens-analys.
- För immunoblot: lyserar celler i modifierad RIPA-buffert innehållande 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoxikolat, 1 mM EDTA, 1% NP40, och proteashämmare. Separat på SDS-polyakrylamidgel och överföring till 0,20 um PVDF-membran. Inkubera membran med gluk-antikropp (1: 2000 spädning) över natten vid 4 ° C. Utför sekundär antikropp inkubation och membran tvättar per användardefinierade protokoll för detektion reagens val.
- Förluminiscens analys (Figur 2): Utför följande steg på is:
- Ta bort alla mediet från brunnarna i vävnadsodlingsplattan och skölj med 200 pl kall PBS.
- Lägg 75 ul lysbuffert innehållande 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 och proteashämmare till varje brunn.
- Vrid plattan på en skakapparat (120 rpm) vid 4 ° C under 20 minuter.
- Pipett försiktigt lysatet upp och ner med hjälp av en flerkanalspipett, undvika luftbubblor. Överför 5 il lysat till en ogenomskinlig platta och bedöma luminiscens som beskrivs i avsnitt 5.
2. In vitro-analys: Övergående transfektion av immortaliserade celler med SERCaMP
Obs: Vi har observerat att övergående transfektion förfaranden kan inducera cellulär stress och trubbig efterföljande Gluc-SERCaMP svar. Följande tillvägagångssätt har utvecklats för att minimera transfektion eff jekt i SH-SY5Y celler. Optimering av denna procedur (inklusive val av transfektionsreagens) för alternativa cellinjer kan krävas. När det är möjligt, rekommenderas att använda stabila cellinjer eller virala omvandlings metoder som anges i avsnitt 1 respektive 3.
- Plate SH-SY5Y celler i en 100 mm skål på 4 x 10 6 celler. Denna rätt kommer att vara tillräckligt för att åter frö cirka 300 brunnar (96 brunnar format) efter transfektion förfarandet.
- Transfektera celler med Xfect reagens med hjälp av 20 mikrogram av plasmid-DNA (som kodar Gluc-SERCaMP) och 6 il Xfect reagens. Skala DNA och Xfect reagens följaktligen för större eller mindre odlingskärl.
- Återgå celler att inkubator under 48 timmar.
- Trypsinize celler och reseed till 96 brunnar vid 60.000 celler per brunn. Följ efterföljande stegen i avsnitt 1.
3. In vitro-analys: Viral Vector-medierad Redovisning av Gluc-SERCaMP
tält "> Obs! Adeno-associerad viral (AAV) vektor förpackning 16 och rening 12 och lentivirus produktion 13 har tidigare rapporterats.- Titer gluk-SERCaMP AAV med användning av följande primrar och prober: framåtriktad primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; omvänd primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; sond (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 märkt), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 "för kvantitativ PCR.
- Förbered standardkurvan genom linjärisering en plasmid innehållande gluk och rening av DNA med en spin-kolonn (t.ex. Machery-Nagel NucleoSpin Gel och PCR sanering). Kvantifiera DNA genom separation på en agarosgel tillsammans med en mass stege. Bered 1:10 utspädningar av DNA från 100 pg / ml till 10 fg / ml i PBS. Beräkna kopior / ml av Gluc-plasmid-DNA vid vardera av de koncentrationer baserad på molekylvikten av plasmiden.
- Späd AAV lagren i PBS (lämplig utspädning kommer att vara beroende avparametrar för virus förberedelser och bestämmas empiriskt).
- Kör PCR-reaktionen i en realtids-PCR-systemet med användning av följande betingelser: 95 ° C x 5 min, 94 ° C X 20 sek, och 60 ° C x 1 min för 41 cykler. Beräkna kopior / ml med hjälp av standardkurvan.
- Titer lentivirus med en p24-Lenti-X snabb titer sats. Tina lentivirala alikvoter på is och späd p24 kontrollproteinet i SH-SY5Y-medium.
- Späd lentivirus så att det kommer att falla på standardkurvan (t.ex. 1: 20 tusen eller ett: 100 tusen). Utspädningsfaktorn som krävs varierar beroende på de lentivirala beredning parametrar och måste bestämmas empiriskt. Följ tillverkarens instruktioner för alla efterföljande steg.
- Plate celler till plattor med 96 brunnar. För SH-SY5Y-celler, kan plätering förfaranden som beskrivs i avsnitt 1 följas. För råtta primära kortikala neuroner, bör cellerna isoleras och såddes på lämpligt sätt belagda plattor enar tidigare beskrivits 16. Behåll råtta primära kortikala neuroner i Neurobasal medium kompletterat med 1x B27 och 500 iM L-glutamin. Utför halv medelutbyte varannan dag.
- Omvandla cellerna med virus. Målet för viral transduktion är att uppnå låg nivå uttryck, som Gaussia luciferas ger robust signal.
- AAV transduktion SH-SY5Y celler: omvandla dagen efter plätering. Späd AAV till 6,0 x 10 7 vg / ul i AAV spädningsbuffert (PBS + 0,5 mM MgCl2). Tillsätt 5 pl av utspätt AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI av ungefär 6000) per brunn i 96-brunnsplatta (figur 3A). Använd 10% blekmedel för att inaktivera virusvektor avfall.
- AAV-transduktion av råtta primära kortikala neuroner: transducera 6-8 dagar efter plätering. Späd AAV till 4,0 x 10 6 VG / ul i AAV-spädningsbuffert. Tillsätt 5 pl utspätt AAV (2,0 x 10 7 vg, MOI av cirka 350) per brunn96 brunnars platta (figur 3B). Den optimala MOI bör bestämmas empiriskt för andra celltyper. Använd 10% blekmedel för att inaktivera virusvektor avfall.
- Lentivirala transduktion av SH-SY5Y celler: omvandla dagen efter plätering. Späd lentivirus till 20 ug / ul p24 (koncentration bestämdes med användning av titrering sats) i Hanks balanserade saltlösning. Lägg 5 pl utspätt virus per brunn (100 pg av p24, vilket motsvarar 1.250.000 Lentiviral partiklar, eller ~ 1250 IFU) i en 96 brunnar innehållande 100 ul volym. Skala följaktligen för större format. Använd 10% blekmedel för att inaktivera virus avfall.
- Samla en förbehandlings urval av medelstora och börja experimentella behandlingar 48 h (SH-SY5Y) eller 5-7 dagar (råtta primära kortikala neuroner) efter transduktion.
4. In vivo SERCaMP analys
Obs! Innan genomföra eventuella djurförsök vara säker på att få rätt godkännande genom din institution. Alltöverlevnad operationer ska utföras under sterila förhållanden med tillräcklig bedövning. Alla förfaranden som beskrivs nedan har godkänts och är i enlighet med NIH ACUC riktlinjer.
- Autoklav kirurgiska instrument före start av operationen (121 ° C, 30 min sterilisering, 20 min torktid). Rengör alla instrument i en ultraljud omedelbart efter alla förfaranden och före autoklavering. Bibehålla sterila betingelser under överlevnad kirurgi. För operationer som kräver flera djur, torka kirurgiska instrument med 70% alkohol, ultrasonicate och pärla sterilisera mellan råttor. Se Materiallista för nödvändiga instrument.
- Förbered råtta för operation. Här använder vi Sprague-Dawley (180-200 g).
- Söva råttor med användning av gas som isofluran under 3 min (4-5% Isofluran levereras vid 1000 cm ^ / min) följt av intraperitoneala injektioner av xylazin (8 mg / kg) och ketamin (80 mg / kg). Applicera oftalmologiska salva för att skydda hornhinnor från att torka ut. BEgin kirurgi när råttan är djupt sövd vilket framgår av bristen på tillbakadragande reflex efter svans eller fot nypa.
- Raka regionen buken strax under revbenen (låg bröstkorg region) till mitten av bukhålan. Skrubba operationsområdet tre gånger, omväxlande 70% alkohol och Betadine scrub. Placera råttan i ryggläge på sterila operationsområdet med sterila operationsdukar.
- Späd AAV-Gluc-SERCaMP till 7,6 x 10 9 vg / ml (slutkoncentration). Blanda väl genom att vända röret.
Obs: Utbud av viral koncentration kan variera (Figur 4).- Pipett 105 ul utspätt AAV i en steril skål. Använd en 30-gauge nål för att samla upp viruset i en spruta.
- Operera för att exponera levern och injicera AAV-Gluc-SERCaMP.
- Innan du gör ett snitt i buken, gäller 0,25% bupivakain till snittet området. Med hjälp av en skalpell, gör ett horisontellt snitt under bröstkorgen (apfär 2-3 cm). Blunt dissekera att separera bindväv från hypodermis.
- Klipp magmuskel, exponera rätt mediala LOB lever.
Obs: Ytterligare lober kan injiceras baserat på slutanvändning. - Placera djuret under operationsmikroskop och justera för att få rätt mediala LOB lever i synfältet. Injicera viruset i parenkym av den mediala lob; 3 separata platser, cirka 33 pl per plats.
Obs: Lämna nålen i vävnaden under 5-10 sekunder efter injektion för att säkerställa leverans av hela injektionsvolym. - Sutur buken muskler och hud separat och lägga Neosporin använder bomull tippas applikatorn. Placera råttan i en återvinningskammaren tills medvetandet återfås och råtta kan bibehålla upprätt position. Lämna inte råtta (s) utan uppsikt tills den har återfått tillräckligt medvetandet att upprätthålla sternala VILA. Hus ensamma tills snittet har läkt och suturer har tagits bort (7-14 dagar).
- Börja svansblodinsamling 4-7 dagar efter injektion. Förbered blodprovsrör märkning och pre-vägning. Lägg 50 il heparin (1000 U / ml) till varje rör.
- Placera råttan i isoflurananestesi kammare för 3 min (4-5% Isofluran levereras vid 1000 cm ^ / min). Avlägsna råtta från kammare och placera i noskonen (2-3% Isofluran levereras vid 500 cm ^ / min). Bloduppsamlingen kan börja när råttan är djupt sövd vilket framgår av bristen på tillbakadragande reflex efter svans pinch.
- Använda steril sax klippa svansspets (1-2 mm) och samla blod droppvis i förfylld heparin rör. Samla blod tills volymen nått större än 2: 1 blod till heparin förhållande (> 100 ^ blod / 50 ^ heparin). Blodprovsvolymer kan justeras baserat på experimentell design. Använd en våt bomull applikator att tillämpa ADSTRINGERANDE pulver till svansen för att stoppa blödning.
- Förvara blod rören vid 4 ° C om uppsamling efterföljande prover. Torka sax med etanol pad och pärla sterilisera mellan samlingar.
- Väg uppsamlingsrör och justera med heparin för erhållande av 2: 1-förhållande (blod: heparin). Detta steg kommer att normalisera mängden heparin i varje prov (tabell 1).
- Centrifugera rören vid 2000 xg under 5 min vid 4 ° C. Överför supernatanten (plasma) till ett nytt rör och förvara vid -80 ° C fram till tidpunkten för luciferasanalysen (avsnitt 5).
Obs: Lagring av prover vid 4 ° C upp till 72 h före enzymatisk analys har minimal effekt på luminescens (figur 5A). Upp till 3 frys-tö cykler av plasmaprover har ingen effekt på luminiscens (figur 5B).
- Tapsigargin administration (positiv kontroll):
- Bered tapsigargin genom spädning i etanol till en slutlig koncentration av 2,5 mg / ml. Injicera tapsigargin vid 1 mg / kg ip in i den nedre delen av buken.
Obs: tapsigargin ökar trombininducerad blodplätts koagulering 17 och kan göra blodinsamling från svansen svårare.
- Bered tapsigargin genom spädning i etanol till en slutlig koncentration av 2,5 mg / ml. Injicera tapsigargin vid 1 mg / kg ip in i den nedre delen av buken.
- Gaussia luciferasanalys:
- Tina plasmaprover på is.
Obs: För longitudinella studier, tina och utföra luminiscens analys för alla tidpunkt prov på samma dag (med enkel framställning av substrat). - Transfer 10 il plasma till en ogenomskinlig muromgärdad platta och mäta enzymatisk aktivitet som beskrivs i avsnitt 5. Kör 3-4 tekniska replikat av varje plasmaprov.
- Tina plasmaprover på is.
- Euthanasien
Obs: Fördelen med SERCaMP teknik är möjligheten att i längdled monitor ER kalcium. Beroende på experimentella parametrar och endpoint analyser, djur ska avlivas av åtgärder som är lämpliga för endpoint analyser och i enlighet med institutionens riktlinjer ACUC.
5. Luminescens-analys
- Förbered coelenterazin (CTZ) stamlösningar genom att späda föreningen i surgjord metanol (30 pl 10 N HCl till 3 ml metanol) till 20 mM. Förbered engångsbruk alikvoter och förvara vid -80 ° C.
- Förbered verksamt substrat på analysdagen.
- För in vitro-analyser, späd coelenterazin till 8 iM i PBS, t.ex. tillsätt 10 pl av 20 mM CTZ lager till 25 ml PBS (Figur 6A, B).
- För in vivo-analyser, späd coelenterazin till 100 pM i PBS, 500 mM askorbinsyra, 5 mM NaCI.
- Inkubera beredda CTZ minst 30 minvid rumstemperatur innan analysen påbörjas.
Obs! Det här steget ofta ingår i Gaussia luciferasanalyser eftersom det finns rapporter om snabb substrat förfall under första 30 minuter efter beredning. Vi har inte observerat denna effekt i vårt system (figur 6C); Men tar vi ofta inkubationssteget som vi har hittat någon negativ inverkan på analysen. - Använd en plattläsare som är i stånd att övervaka bioluminescens och utrustade med ett substrat injektor. Prime raderna med substrat.
Obs: Den initiala substratet genom ledningarna kan vara benägna för nedbrytning. För att undvika artificiellt låga värden för tidiga prover, injicera 20-30 tomma brunnar (laddar en tom tallrik på läsaren) före mätning experimentella prover. - Injicera 100 pl substrat till brunn, skaka medelhastighet under 5 sekunder, och mäta ljusemissionen. För Biotek Synergy II plattläsare, integrera ljusemissionen under 0,5 sek (in vitro-prov) och 5 sek (ivivo prover) för läsning steget. Optimera plattläsarparametrar för perfekt analysens prestanda.
Obs: Gaussia luciferas uppvisar flash kinetik med snabb signal förfall (jämfört med glöd kinetik observerades med andra luciferaser). Blixten kinetik Gluc påverkas av serum i cellodlingsmedium (Figur 7A), betonar vikten av att kontrollera för medel sammansättning över prover. På grund av den snabba sönderfallet av luminiscens efter tillsats av substrat (flash kinetik), tiden mellan injicera och läsa steg måste vara lika för alla prover. Plattan Läsaren bör ställas för att injicera substrat till en brunn, vänta en fast tid (t.ex. vi använder en 5 sekunder skaka steg), och läsa så bra. Lägga substrat till en hel platta innan behandlingen utgör en stor utmaning om substrat kan läggas till alla brunnar samtidigt. Om en injektor inte är tillgänglig, kan problemet delvis kringgås genom inkubering av plattan under 10 minuter mellan substrat ytterlition och mätning (därmed undvika den branta delen av avklingningskurvan) (Figur 7B). - Upprepa injektionen, väntetid och läs steg för varje brunn på plattan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Gluc-SERCaMP metod möjliggör en bedömning av ER kalciumhomeostasen genom provtagning extracellulära vätskor. Flera kontroller kan inkluderas i den experimentella utformningen för att öka tolkningen av resultaten. För det första kan använda en konstitutivt utsöndrat reporter (t.ex. Gluc utan C-terminal ASARTDL eller "gluk-No Tag") användas för att utvärdera effekterna av experimentella behandlingar på den sekretoriska vägen (global cellulär sekretion) och transgenexpression. Till exempel skulle en ökning av de extracellulära nivåer av både Gluc-SERCaMP och Gluc-nr Tagg betraktas en tvetydig resultat. Alternativt stöder en ökning av Gluc-SERCaMP sekre en motsvarande brist på Gluc-No Tag svar en beroende händelse ER kalcium (Figur 8). Utsöndringen av Gluc-SERCaMP som svar till ER kalcium utarmning kan bedömas vidare genom att mäta intracellulär Gluc, även om detta är begränsat till en enda tidpunkt som lys krävs. Int racellular Gluc-SERCaMP kommer att minska till följd av ER kalcium utarmning, eftersom det successivt utsöndras, och extracellulära: intracellulär förhållande (beräknas för varje enskild brunn) kommer att öka (figur 2B). Den extracellulära: intracellulär förhållandet är bra att kontrollera för förändringar i transgenuttryck.
Farmakologisk modulatorer av ER kalcium butiken kan utnyttjas för att bekräfta det bidrag av ER kalcium till SERCaMP frisättning i nya paradigm. Dantrolen, en Ryr-antagonist, är känd för att stabilisera ER kalcium, vilket bör minska eller hämma frisättningen av SERCaMP som svar på Tg (Figur 8B). Det rekommenderas, när det är möjligt, för att testa ytterligare föreningar som påverkar ER kalciumflöde (t.ex. Xestospongin C, 4-klor-m-kresol) i nya experimentella paradigm utnyttjar SERCaMP. Dessa studier är ofta utmanande in vivo, men kan vara möjlig i motsvarande vävnadsodlingsmodeller.
"> För in vitro-studier med Gluc-baserade SERCaMP, rekommenderas att beräkna svar på individuella plattor i förhållande till kontrollen (s). Kan den" behandlings inducerad "respons bedömas över tidsförloppet genom att spåra förändringar i relativ respons mot kontroll ( för mellan-plattan jämförelser). Det är inte tillrådligt att jämföra råa siffror över flera plattor på grund av sönderfallet av substrat, vilket kan leda till förändringar i rå värden mellan tidpunkter (figur 6C). Göra relativa jämförelser inom en platta minimerar denna effekt (Figur 6D). Ett exempel på dataanalys för en in vitro-Tg-inducerad SERCaMP frisättningsexperiment presenteras i fig 9.För in vivo studier med Gluc-SERCaMP bör uppgifter bedömas individuellt för varje djur, med varje djur tjänar som sin egen "förbehandling" kontroll. Detta är nödvändigt för att ta hänsyn till variationer i transgen delIvery och uttryck mellan djur (Figur 4A).
Storleken av SERCaMP svar kommer att påverkas av ett flertal faktorer, varav många är relaterade till baslinjen hälsa av cellerna och kan styras direkt av undersökaren. För maximal SERCaMP mottaglighet, är det absolut nödvändigt att optimera betingelser som gynnar basala ER kalciumhomeostas. Detta inkluderar sådd celler vid optimal täthet och användning av låga virala titrar. Olika cell- och vävnadstyper kan ha ytterligare krav, som bör bestämmas empiriskt.
Figur 1:. Stabil SH-SY5Y-cellinjen såddtäthet och passagenummer överväganden (A) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP celler såddes vid olika densiteter och inkuberades under 40 timmar. Utsöndrat Gluc-SERCaMP mättes 4 timmar efter behandling med 300 nM Tg or vehikelkontroll (medelvärde ± standardavvikelse, n = 6). Tapsigargin-inducerad ökning av Gluc-SERCaMP sekre är indicerat för varje celltätheten. (B) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP celler vid passage nummer 2 och 15 undersöktes för tapsigargin-inducerad sekretion. Cellerna behandlades med 100 nM Tg under 2 timmar eller 4 timmar, och utsöndras gluk aktivitet normaliserades till vehikelbehandlade kontroller (medelvärde ± SD, n = 4, ingen signifikant effekt av passage-faktor, 2-vägs ANOVA). Streckad linje anger y = 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Enzymatisk analys för mätning av intracellulär gluk-SERCaMP (A) Intracellulär och (B) extracellulär Gluc enzymatisk aktivitet fastställdes i råttprimär cortiska neuron (transducerade med AAV-Gluc-SERCaMP). Sex dagar efter transduktion, behandlades celler med 60 nM tapsigargin för fyra timmar. Som Gluc-ASARTDL ackumuleras i mediet, är motsvarande minskning av intracellulära nivåer observerades. (C) Ett förhållande av extracellulärt: intracellulär gluk aktivitet kan beräknas för varje enskild brunn.
Figur 3:. AAV-Gluc-ASARTDL titern kontra tapsigargin-inducerad respons för SH-SY5Y-celler och råtta primära kortikala neuroner (A) SH-SY5Y-celler såddes i 96-brunnsplattor vid 5 x 10 4 celler per brunn och fick vidhäfta över natten. Celler transducerades vid den indikerade infektionsmultiplicitet (MOI), inkuberades under 48 h och behandlades sedan med 300 nM Tg eller vehikel. Luminescens mättes i mediet efter 8 h (medelvärde ± SEM, n = 3). * P <0,05, multiple t-test (Holm-Sidak korrigering). (B) råtta primära kortikala neuroner transducerades på DIV8 med AAV-Gluc-ASARTDL vid den angivna MOI (beräknas med hjälp av 60.000 celler per brunn tillnärmning vid transduktion). Fem dagar efter transduktion, behandlades celler med 100 nM Tg eller kontrollvehikel och luminiscens i mediet mättes efter 8 timmar (medelvärde ± SEM, n = 6). * P <0,05, flera t-test (Holm-Sidak korrigering).
Figur 4:. Tapsigargin-inducerad Gluc-SERCaMP övergång till blod efter intrahepatiska injektioner över utbud av virustitrar (A) Raw luminiscens värden från råttor (n = 8) i levern injiceras med olika AAV-Gluc-ASARTDL titer. Tapsigargin (1 mg / kg) injektion (ip) administrerades på dag 12. Blod uppsamlades vid angivna tidpunkter och lagrades vid -80 & #176; C tills tiden för analys. (B) Normaliserade luminiscens värden från panel A, visar tapsigargin-inducerad SERCaMP respons hos råttor (n = 8) som uttrycker olika mängder av AAV-Gluc-ASARTDL.
Figur 5:. Hantering och lagring av Gluc-SERCaMP plasmaprover (in vivo) (A) Plasma uppsamlades från råttor i levern uttrycker gluk-SERCaMP (n = 10), alikvoterades och lagrades vid -80 ° C fram till tidpunkten för analyser. Rören avlägsnades från -80 ° C och lagrades vid 4 ° C under angivna tiderna innan luminiscensmätning (medelvärde ± SD). (B) Effekt av flera frys / tinar av plasmaprover på Gluc enzymatisk aktivitet. Plasmaprover uppsamlades från råttor i levern uttrycker AAV-gluk-SERCaMP (n = 10) utsattes för det angivna antaletfrysnings-upptiningscykler och analyserades för luminescens (medelvärde ± SD).
Figur 6:. Förberedelser coelenterazin substrat för Gluc-SERCaMP analyser (A) Odlingsmedium uppsamlades från SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellinjer behandlade med 300 nM Tg (eller vehikelkontroll) för 5 timmar. Gluk-aktivitet i mediet bestämdes genom att injicera PBS + olika koncentrationer av coelenterazin (medelvärde ± standardavvikelse, n = 6). (B) Luminescence värden från panel A normaliserades att fordonet behandlad kontroll vid varje substratkoncentration för att bedöma tapsigargin-inducerad effekt. (C) Substrat sönderfall under flera timmar. Luminiscens från en känd mängd av rekombinant gluk (0,1 ng eller 0,02 ng) mättes under flera timmar efter framställning av substrat (medelvärde ± standardavvikelse, n = 4). (D) Medan rå luminiscens för rekombinantaGluk minskade med tiden på grund av att substrat förfall ades faldig skillnad i proverna (bestämt genom luminiscens) bibehållas.
Bild 7:. Överväganden för Gluc-SERCaMP analyser i samband med kinetik Gluc / CTZ reaktion (A) odlingsmedium ändrar förfall Gluc / CTZ-signalen. 5 | il av supernatanten innehållande Gluc-SERCaMP blandades med varierande förhållanden mellan PBS och odlingsmediet. 100 pl substrat (15 pM CTZ i PBS + 500 mM askorbinsyra) tillsattes till 50 | il prov som späddes såsom anges i tabellen. Ljusemission övervakades under 15 minuter. (B) 5 pl av mediet uppsamlades från SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL celler och 100 | il substrat (8 pM CTZ i PBS + 5 mM NaCl) tillsattes. Luminescens mättes omedelbart efter tillsats av substratet (t = 0) och varje 30 s under loppet av 15 minuter (± standardavvikelse, n = 12). Data plottas som procent signalen relativt den föregående 30 sek intervall för att bedöma graden av förruttnelse. Den infällda bilden visar rå luminiscens data.
Undersöktes Farmakologisk bekräftelse av ER kalcium utarmning (A) Effekt av 100 nM tapsigargin på gluk utsöndring för gluk-ASARTDL och Gluc-nr Tag kontroll (medelvärde ± standardavvikelse, n = 6): Figur 8.. (B) Stabiliserande ER kalcium med dantrolen (Ryr antagonist) hämmar Tg-inducerad SERCaMP release. Celler som förbehandlats med de angivna koncentrationerna av dantrolen för 30 min eller 16 h före tillsats av 100 nM tapsigargin. Gluk-aktivitet i mediet mättes efter 4 h (medelvärde ± standardavvikelse, n = 6).
99fig9.jpg "/>
Bild 9:. Mock representativa resultat för gluk-SERCaMP analys Notera fordonet behandlade värden kan minska mellan plattorna, på grund av substrat uppdelning (beroende på tidsintervallet mellan att läsa individuella plattor). För att ta hänsyn till denna effekt, är behandlingen specifik effekt beräknas separat för varje platta och detta förhållande jämförs över plattor.
| Datum | Råtta | Tube massa (mg) | Heparin volym (ml) | Heparin densitet (g / ml) | heparin massa (mg) | Massa av röret + heparin (mg) | Totala massan efter blodinsamling (mg) | Massa av uppsamlat blod (mg) | Densitet blod (g / ml) | Beräknad blodvolym (UL) | Volym av heparin krävs för 2: 1-förhållande | ml som ytterligare heparin för att lägga innan spinn |
| 01.01.15 | SD Man | 1135,9 | 50 | 1,117 | 55,83 | 1191,73 | 1317,70 | 125,97 | 1,05 | 119,97 | 59,98 | 9,98 |
Tabell 1:. Blood uppsamlingsbord Exempel på bloduppsamlings logg för SERCaMP studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll belyser in vitro och in vivo-användbarheten av Gluc-SERCaMP att övervaka utarmning av ER kalcium. Även om proteinmodifiering för att generera SERCaMP tycks generalisera till andra reporter proteiner 12, valde vi Gaussia luciferas för sin robusta (200-1000 gånger högre) mareld jämfört med andra luciferaser 18. Vi visar detekterbara tapsigargin-inducerad Gluc-SERCaMP frisättning över en 100-faldigt dosintervall av Gluc-SERCaMP viruset levereras till primär råtta kortikala neuroner, SH-SY5Y-celler och råttlever (fig 3 och 4). Vi beskrev tidigare generering av en stabilt transfekterad cellinje som uttrycker gluk-ASARTDL och visade att så få som 20 celler i en population av 5 x 10 4 omärkta celler kan rapportera ett tapsigargin inducerat svar 12. Här visar vi att den stabila cellinjen konsekvent kan rapportera Tg-inducerad respons ut till 15 passager, den mest analyzed, vilket tyder på att kontinuerlig uttryck av reportern över tiden inte påverkar dess förmåga att släppas som svar på ER kalcium utarmning (Figur 1). Våra data indikerar att Gluc-SERCaMP främst hålls inom ER i en cell tills en tid av ER kalcium utarmning när det utsöndras. Under "normala" förhållanden, det är en låg basal sekret som gör inrättandet av baslinjen ER kalciumhomeostasen 12. Efter ER kalcium utarmning av tapsigargin, nivåer av intracellulära och extracellulära luminiscens förändring i motsatta riktningar. Detta kan uttryckas som ett förhållande för att indikera en förändring i steady state fördelning av sensorn (fig 2). Viktigt, som SERCaMP frisättning moduleras av KDEL receptor expression 12, kan storleken på frigör variera beroende på celltyp. Vi ser framför oss att ersätta "ASARTDL" med omväxlande KDEL liknande karboxiterminala sekvenser kan krävas för att uppnå maximal SERCaMP respons i en specifik cell eller vävnadstyp.
För in vitro-analyser, kommer nivåerna av extracellulärt Gluc-SERCaMP ackumuleras över tiden på grund av stabiliteten hos den utsöndrade reporter; vi rapporterade en ungefärlig 5-10% minskning i aktivitet efter 72 timmar 12. Som sådan kan utbyta medium före initiering av en farmakologisk eller genetisk utmaning till ER kalciumhomeostas vara nödvändigt att minska bakgrundssignalen på grund av sensor ackumulering. Däremot är halveringstiden av Gluc-SERCAMP in vivo 3,5-4,7 min 12 indikeringssignal i plasma representerar en senaste utgåvan av reportern i cirkulerande blodet. När blod är ex vivo och bearbetas till plasma är emellertid Gluc-SERCaMP mycket stabil (Figur 5).
För de metoder som beskrivs, är mediet eller plasma överfördes till opaka 96-brunnsplattor innan enzymatiska analyser. Två viktiga faktorer att tänka på när du använder Gluc-baserade reporters är enzymets flash kinetik och nedbrytning av coelenterazine substratet. Plattläsare är utrustade med injektorer är bäst lämpade för att köra gluk enzymatiska analyser för att normalisera tiden mellan substrattillsats och luminiscens mätningar. De kemiska egenskaperna hos coelenterazin gör det benägna att förfalla, vilket utesluter att jämföra rå luminiscens värden som uppmätts vid olika tidpunkter efter substrat beredning. Vik skillnader mellan prover emellertid bibehålls (figur 6), vilket gör att den relativa skillnaden mellan kontroll- och experimentprover som skall spåras under varaktigheten av experiment (figur 9).
Förmågan att övervaka ER kalcium fluktuationer in vivo är fördelaktigt vid utredning progressiva sjukdomar. Medan andra metoder, såsom fluorescerande cytoplasma färgämnen är lämpliga för akut in vitro studier, är en SERCaMP reporter den första att medge längsgående ER kalcium övervakning. Our-protokollet beskriver direkta lever injektioner av AAV-Gluc-SERCaMP. Vi har upptäckt stabila nivåer av Gluc-SERCaMP i omlopp av obestridda djur för 56 dagar efter injektion (senaste tidpunkt testat hittills) och förutsäga längre experiment är möjliga 12. AAV-vektorer är små i storlek, som mäter cirka 20 nm i diameter, och ställer minimala biosäkerhet krav 19. För att kringgå omvandlingen av AAV enkelsträngat genomet till dubbelsträngat DNA, AAV-SERCaMP förpackat som en AAV-serotyp-1 dubbelsträngad vektor 20. AAV serotyp-1 har visat sig effektivt transducera råttlevrar 19,21; emellertid är förbehållet för vår injektionsteknik potentialen för viruset att resa till andra vävnader i hela kroppen. Även vektorn injiceras direkt in i levern, kan vår metod som presenteras inte urskilja källan SERCaMP release, och därför är det möjligt att andra än levervävnad kan bidra till Gluc-SERCaMP signal. Framtida genetiska manipulationer kommer att begränsa uttryck att rikta vävnadstyper. Till exempel, vävnadsspecifika Cre förare linjer korsas med en Cre-beroende Gluc-SERCaMP kommer att möjliggöra för vävnadsspecifika övervakning av ER kalcium via plasma provtagning.
Den beskrivna in vivo-teknik använder låga virustitrar på grund av den robusta karaktären hos reportern. Gluc-SERCaMP frisättning kan detekteras från en viral utbud av 7,6 x 10 7 vg till 7,6 x 10 9 vg (Figur 4). Detta område är 4-400 gånger lägre än vad som rapporterats i tidigare arbete som utnyttjar eldflugeluciferas baserade virala injektioner i levern 19. Vid högre koncentrationer, observerade vi en förlust av detekterbar uttryck över tid, vilket är möjligen på grund av ett immunsvar hos djuret till transgen 22. Högre titrar av virus bör undvikas när det är möjligt på grund av ökad risk för signalförlust. Lägre halter än de som presenterats har intesv testas. Detta protokoll beskriver injektioner av AAV-Gluc-SERCaMP i levern; liknande metoder är teoretiskt möjligt för andra vävnadstyper. Parametrar såsom viruskoncentration och serotyp måste optimeras för tillräcklig expression i andra vävnader.
På grund av den robusta karaktär reportern, kan små volymer av blod (100-150 il) samlas in från svans urklipp, vilket möjliggör upprepade kollektioner hela experiment. Detta var användbart för längd karakterisering av Gluc-SERCaMP frisättning som svar på tapsigargin, där vi observerade förhöjda nivåer efter tapsigargin administrering följt av en återgång till baslinjenivåer (Figur 4). Korrekt hantering av plasmaproverna följande bloduppsamling är också viktigt. Som sådan, har vi visat att SERCaMP är stabil i plasma lagrades vid 4 ° C upp till 72 h före enzymatisk analys (fig 5). Dessutom kan plasmaprover undergå minst tre frys / thaw cykler med minimal effekt på luminiscens (Figur 5). I praktiken lagrar vi alla prover vid -80 ° C, undvika onödiga frysupptiningscykler innan bedömningen enzymatisk analys och analysera alla prover för ett experiment samtidigt.
ER kalcium utarmning är inblandad i patogenesen av en mängd olika sjukdomar. Det är ofta tros vara en uppströms händelse som hindrar cellfunktioner och leder till aktivering av den ovikta proteinsvar (UPR). UPR är en adaptiv respons anställd av ER att återupprätta homeostatiska förhållanden 5. Kroniska tillstånd av ER påkänning överstiger kapaciteten hos UPR att återställa homeostas, vilket slutligen leder till celldöd. ER stress och ER kalcium dysreglering observeras vid sjukdomar som typ 1-diabetes, diabetisk nefropati, neurodegenerativa sjukdomar och hjärt dieases 5. Förhållandet mellan kalcium dysreglering och sjukdom patogenes är dock difficult att avgränsa. Den SERCaMP tekniken har potential att spåra denna process över livslängden hos ett djur, vilket ger en inblick i utvecklingen och sjukdomsprogression. Dessutom utvärdering av potentiella läkemedel syftar till att förebygga eller rätta ER kalcium dysreglering kan bedömas med hjälp av SERCaMP. Slutligen identifierar sjukdomar där Gluc-SERCaMP frisättning inträffar erbjuder möjligheten att konstruera och använda utsöndrade terapeutiska proteiner eller peptider som SERCaMPs som ett medel för sjukdom reglerad genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1 ml luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200 microliter filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200 g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200 g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
