Abstract
在大脑中，大部分的血管系统包括一个选择性屏障，血 - 脑屏障（BBB），调节脑和血液之间的分子和免疫细胞的交换。此外，庞大的神经细胞代谢的需求，需要一个时刻到时刻调节血流量。值得注意的是，这些规定的异常是最脑部病变的病因特点;包括成胶质细胞瘤，中风，水肿，癫痫症，退化性疾病（例如：帕金森氏病，阿尔茨海默氏病），脑肿瘤，以及炎症性疾病，如多发性硬化症，脑膜炎和脓毒症诱导的脑机能障碍。因此，了解的信号传导事件调制脑生理学是一个重大的挑战。多洞察构成该脑血管系统中的各种细胞类型的细胞和分子性质可以从原代培养物或细胞从新鲜分离的脑组织排序来获得。然而，如细胞极性，形态和细胞间的关系属性不保持在这样的准备。我们在这里描述的协议被设计成净化脑血管片段，同时保持结构的完整性。我们表明，隔离容器包括由是由一个连续的基底层包围紧密连接密封内皮细胞。周细胞，平滑肌细胞以及血管周围星形胶质细胞endfeet膜保持连接到内皮细胞层。最后，我们将介绍如何在纯化脑血管进行免疫染色实验。
Introduction
中枢神经系统（CNS）的正常功能需要一个高度调节细胞外的环境中，以及相对于其他器官1其代谢需求是巨大的。中枢神经系统也是范围广泛的化学品，通常无害的外周器官，但它，神经毒性非常敏感。为确保正常运行，大部分的中枢神经系统“血管形成的血管内皮屏障;血-脑屏障（BBB），其控制分子和离子的流动，以及血液和大脑之间的免疫细胞的通路，从而保持适当的稳态2，也限制了治疗性药物的条目，从而妨碍治疗神经系统疾患3。在细胞水平，血脑屏障主要持续由内皮细胞，流出转运偏振光表达和非常低的胞转率4之间广泛紧密连接。性能及血脑屏障的功能大多是诱发NEighboring细胞4。具体地，周细胞发挥 诱导和维持所述BBB 5,6中起重要作用。作为收缩细胞，周也调节血流量7做周围大血管的平滑肌细胞。最后，星形胶质细胞，脑的主要神经胶质细胞，发送名为endfeet围绕大型进程最大脑脉管8和调制血脑屏障完整性和免疫静止9，代谢物转移到神经元10，和诱导神经元活性之间的紧耦合和血流11,12。
研究脑血管系统的细胞和分子性质的能力是非常重要的特点更好其脑生理学和病理生理学的贡献。为了解决这个问题，已经发展战略，以隔离大脑的脑血管系统，该系统允许完整的脑血管片段的准备。脑血管purification被使用牛脑中13最初描述和改进，并适用于其它物种，特别是啮齿动物14。在这最后的研究中，使用不同大小的过滤器被引入到分离脑血管中，以级分富含不同直径的容器。有趣的是，在这些制剂，内皮细胞保持它们的代谢特性15，转运功能16和17的极化。在这里，我们详细描述了这个协议，并进一步证明了隔离容器保留大部分的原位结构。内皮细胞保持通过紧密连接相连，通过一个连续的基底层包围。周细胞和平滑肌细胞保持附着在内皮细胞层，以及血管周围星形胶质细胞膜。然而，星形胶质细胞，小神经胶质细胞，神经元和少突胶质细胞被消除。最后，我们描述了一个过程来执行免疫染色对离体脑血管。 直至现在大多数关于脑血管系统的分子和细胞研究已经由解离纯化脑血管细胞进行细胞分选使用细胞特异性报道的小鼠品系或免疫染色基于程序18,19。尽管这些技术允许几乎纯脑血管的细胞群的分离，分离的细胞完全丧失其原位形态学和相互作用，这反过来又极大地影响它们的分子和细胞的特性。在这里描述的协议，从而允许整个脑血管片段无需特异性抗体或转基因小鼠的污渍的隔离，提供了一个很好的选择，作为分离的脑血管的总体结构是保守的，因此，减少它们的分子性能影响。隔离容器然后可以用于研究基因的活性，蛋白质合成和调节在所述BBB作为最近描述20,21 22,23，本协议是廉价的，易于实施，并在任何实验室迅速适应。
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Protocol
1.解决方案和材料
- 准备隔离器的解决方案：B1，加1.5毫升HEPES为1M至150ml的HBSS; B2，加3.6克葡聚糖到20ml B1的; B3，加1克的BSA至100毫升B1的。
- 通过切割掉底的上旋拧部分修改过滤器保持器。
- 制备免疫染色方案：固定溶液，在pH 7.4的PBS的4％多聚甲醛;透/封闭溶液，稀释山羊血清至5％和Triton X100至0.25％的pH 7.4的PBS。
注意：固定取决于所用第一抗体的类型。
2.解剖
注意：无菌条件不是必需的，除非船舶用于细胞培养的目的。
- 准备150毫升的烧杯用20毫升B1的。置于冰上，并用封口膜覆盖，避免空气污染。
- 深深麻醉鼠标引擎盖下的小纸巾浸泡在1毫升纯异氟醚被加入Int澳笼。麻醉是由于缺乏反应到足尖捏验证。杀死小鼠颈椎脱位。
注意：这些步骤都完成符合国家和机构的规定。 - 可选：用20毫升的PBS 1X中进行心内灌注，消除血液中的含量24。
- 第皮肤从颈部到鼻子手术刀将其拉离。删除所有污染的毛发，用PBS 1X。
- 要打开颅骨，先插入剪刀前方的嗅球，并打开剪刀破裂的头骨两部分。
- 小心取出用脑铲大脑。解剖出脉络丛从 侧脑室，因为它们会污染血管制剂38。
注：可选：最后的准备工作将包括实质和脑膜血管。如果不希望的，脑膜可剥离以下由38描述的过程。 - TRansfer脑入含冰B1液的烧杯中。多达8个的大脑可以一起处理。
3.脑组织均质
- 使用两个解剖刀，在B1的溶液随后获得小块的约2mm手动大力击败大脑。
- 均质化制剂用automatized Dounce匀浆，执行20笔在400rpm。确保玻璃管被保持在冰中，该douncer的上部是在溶液中移动时上下，从而防止气穴的形成。如果几个样品制备，每间同质化离子水冲洗douncer。
4.血管净化
- 转移匀浆到50ml的塑料管，然后继续离心以2,000rpm离心10分钟，在4℃。一块巨大的白色接口（主要是髓鞘）将形成对血管颗粒（红色的顶部，如果未进行灌注）。
- 弃去上清液。该船颗粒和白色的接口将保持连接在一起。加入20毫升冰冷的B2解决方案，手动和大力摇晃管1分钟。
- 进入第二离心4400克15分钟，在4℃。髓鞘现在将形成致密的白色层在上清液的表面上。
- 仔细保持所述管和缓慢转动它，以允许上清液通过沿着壁分离从管壁髓鞘层。丢弃髓鞘与上清。保持附着在管的底部含有血管沉淀。
- 吸干管的内壁与吸收纸缠有5毫升的塑料吸管和除去所有的残余液体，避免触及容器沉淀。保持在一个吸收纸管倒置排出任何剩余的液体。
- 移液器向上和向下低结合的技巧，keepi暂停1毫升冰冷的B3解决方案的颗粒纳克管在冰上，再加入另外的5毫升B3的解决方案。确保船只分散尽可能并且不形成聚集体。
5.过滤
- 准备在冰上的烧杯用30ml冰冷却的溶液B3。用封口膜覆盖，避免空气污染。
- 放置在修改后的过滤器保持器20微米筛网过滤器上的贝克尔烧瓶的顶部并通过施加将10ml冰冷B3溶液平衡。
- 倒在过滤器上的船只准备和冲洗容器用40毫升冰冷的B3的解决方案。
- 用干净的镊子恢复的过滤器，并立即沉浸在包含B3溶液的烧杯中。通过轻轻晃动松脱，从过滤器的船只。
- 倒在50ml塑料管中并离心烧杯内容在2000克5分钟，在4℃。
- 注意：可替换地，大脑血管'从步骤4.6的悬浮液可以过滤到一个100微米的网过滤器。在这种情况下，较大的血管优先保留在过滤器上，而流过的包含微血管（主要是毛细血管），其然后在20微米的网过滤器过滤如上。
- 悬浮微血管的沉淀在1ml冰冷却的溶液B3和吹打它至1.5 ml Eppendorf管中传送它。离心机在2000克5分钟，在4℃。
6.固定，透和阻塞
- 转船吹打成0.2毫升含有PBS使用1.0毫升低结合尖端PCR管。注意不要触及容器，因为它们可能会附着在笔尖的外部分。执行双目显微镜下的所有执行下列步骤。
- 对于以下每个介质改变，离开管在冰上直到船只已达到的底部，并吸取出来最采用长和东西凝胶加载枪头的液体。
- 除去大部分的PBS，并添加200微升固定液。暂停船只通过轻轻摇动孵育20分钟，在室温。
- 吸取出固定液，并将其用200μl的1×PBS（第一次洗涤）的替换，孵育5分钟，在室温，重复此步骤3次。每次，验证血管已正确沉到管和移液管出来的1×PBS的底部，确保船只未触及。
- 在最后一次洗涤后，更换1×PBS中由透/封闭溶液孵育1小时，在室温，通过轻轻摇动不时重悬血管。
7.免疫染色
- 更换透/阻断原发性抗体（在这里看到的和稀释液用在材料模板表的抗体的引用）稀释，在通透/封闭液的混合溶液中，孵育4°CO / N。
- 洗涤3次后在PBS中在RT下，孵育第二抗体的混合物在PBS中稀释2小时的船只在RT。
- 注：强烈建议进行核染色，用Hoechst（1：2000）：为了区分可能在显微镜下污染的毛或灰尘船（2000一）或DAPI。
- 洗涤3次后在PBS中，重悬船只于50μlPBS中。
8.安装和观测
- 准备一个尖端硅化玻璃毛细管：用手术刀切P200的枪头和内部调整的毛细血管。毛细管的近似体积为40微升。
- 使用硅化玻璃毛细管转移血管载玻片并小心地用一块吸收纸除去液体。
- 应用安装中的单滴到血管和保持一个盖玻片在45°使降沿滑的边缘扩散。让熄灭盖玻片，并允许媒体传播缓慢。待其干燥O / N在室温避光。船只可以在一个fluoresc观察耳鼻喉科共聚焦显微镜。
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Representative Results
在这里，我们描述了一种协议，允许为脑血管14的机械隔离。 图1概括了该技术的主要步骤。脑血管的结构是复杂的，并且包括几个细胞类型， 即，由紧密连接密封，并用周细胞，平滑肌细胞，和星形胶质细胞足突9包围内皮细胞。因此，下面的脑血管的隔离，我们的目的是通过如在我们的协议的第二部分中描述的免疫染色的纯化血管的结构表征。集聚蛋白，内皮基底膜的组分连续和均匀标记的在内皮表面（图2A）。透明occludens-1（ZO-1），内皮紧密连接的部件之一是免疫染色，没有明显的不连续，这表明内皮紧密连接被保存（图2B）。该周细胞内皮细胞覆盖，标签由NG2编，出现几乎连续如前所述25（图2C）。最后，平滑肌肌动蛋白标记显示致密平滑肌细胞层的存在下，在大的纯化的血管（图2D）的表面上。这些结果表明， 在原位脑血管结构的整体是保守在隔离罐片段。
星形胶质细胞已被证明发送大工艺，或'endfeet'到容器的表面上，护套几乎完全的脑血管系统 8。它们与容器紧密相互作用和其在维护和调节各种脑血管功能的作用，指定它们作为神经血管单元 9的一个重要组成部分。我们进一步分析孤立脑血管的星形胶质细胞血管覆盖。通常在整个星形胶质细胞免疫标记GFAP，本的星形细胞中间丝（图3A），华唯一的部分出现在显示一些短纤维的内皮细胞表面（ 图3B-C）纯化的船只。与此相反，连接蛋白43，高度富集血管周围星形胶质膜26间隙连接蛋白，在纯化的大血管（图3D）和毛细管（ 图3E）的表面的高度进行检测。同样地，水通道蛋白4（AQP4）的免疫标记，水通道家族的一个成员大大表示在面对容器27，26星形胶质细胞膜的水平，概述隔离容器（ 图3F-G）的壁。虽然星形胶质细胞没有共同纯化血管，脑血管分离的机械过程中保持附有他们的血管周围endfeet膜。
最后，我们通过其他的神经细胞类型检查我们的准备可能的污染。神经元中间丝免疫标记（NFM）（Hornun克等人，1999）揭示了附着在容器仅存纤维存在，这表明一个可能的共纯化的一些神经元端子（图4A-B）。小胶质细胞，标记的Iba1（图4C-D）和少突胶质细胞，标记的OLIG2（图4E-F），在隔离容器没有检测到。因此，神经元，小胶质细胞和少突胶质细胞没有共同纯化，用脑血管。
总之，这些结果表明，所描述的协议允许在结构上保留脑血管片段，在其上的血管周围星形细胞的膜保持附着的纯化。
脑血管净化议定书图1.摘要计划的主要步骤介绍。这个草图表示可以得到三种可能的容器馏分取决于音响使用滤池（20或100微米目）。 S1：微血管和大血管，S2：大血管和S3：微血管请点击此处查看该图的放大版本。
图2.隔离容器保留大部分的原位结构。免疫组化染色孤立的小鼠脑血管的共聚焦图像投影。（A）基底层immunolabelled的集聚蛋白（红色）。（二）内皮细胞紧密连接immunolabelled的紧密连接（ZO-1 ） （红）。 （C）的周细胞immunolabelled为NG2（红色）。（D）的 immunolabelled对平滑肌肌动蛋白（SMA）的平滑肌细胞（红色）。细胞核用赫斯特（蓝色）。PG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3.星形胶质细胞Endfeet膜保持连接到纯化的船舶。共聚焦图像投影。（A）大脑部分呈现出皮质血管免疫染色内皮细胞粘附分子（白色），星形胶质纤维酸性蛋白（红色）和连接蛋白43（Cx43的）（绿色的图像）（B，C）的免疫标记GFAP（绿色）在分离的毛细管标记的凝集素B4（白色的表面）（B标示平滑肌肌动蛋白（SMA）（红色）（C）的一个大容器中的）或。 （C）是一个孤立的毛细管标记的凝集素B4（白）（D）的表面重新打印的权限从20（D，E）Cx43的免疫标记（绿色） 或标示平滑肌肌动蛋白（SMA）的大容器（红色）
图4：神经元，小胶质细胞和少突胶质细胞的不共法用脑血管共聚焦图像投影（A，B）神经丝（NFM）免疫组化在20微米厚的海马脑片（红）（A）和纯化脑血管（ B），（C，B）在20微米厚的皮质切片小胶质Iba1免疫染色（RED）（C）和纯化脑血管（D），（E，F）在20微米厚的皮质片（红少突胶质细胞OLIG2免疫）（E）和纯化脑血管（F）核是由赫斯特染色（白），血管内皮细胞由Isolectine B4（IB4）（绿色）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
血 - 脑屏障调节生理物质在中枢神经系统中的进出的通道和保护其不受存在于血液中潜在的有害物质。它参与几个CNS病症，包括神经退行性疾病2和脑肿瘤28。血脑屏障的渗透率极低的也阻碍了靶向神经细胞和方法意欲可逆打开血脑屏障无有害的后果对大脑的研究3一个非常活跃的研究领域的发展的治疗剂的通过。已作出许多努力来开发有价值模型和技术允许细胞，分子和药理学血脑屏障的调查，并且特别地，协议用于从啮齿动物的脑血管中分离。首先尝试简单地收集使用可变孔径大小的网格，从机械分离脑组织微血管丢弃污染脑实质细胞13，29，30，31。密度梯度离心以后被引入上尼龙网或在玻璃珠的列32，33，15相关的脑血管的过滤。在这些程序中，玻璃珠与尼龙网过滤似乎提高产量和高相对低速离心，微血管纯度，尽管高速离心还诱导剪切应力从 而影响基因表达的15，32。酶消化的额外步骤也被介绍在一些协议在与分离粘附的神经元和星形胶质细胞以增加微血管纯度35的目的的解离步骤34。然而，过大的预消化也可能会破坏微毛细管完整性36,37。最近，免疫激光捕获显微切割（免疫LCM）已经显示出，以使即使在vesse不同的细胞群的船只或检索LS，检查改变血脑屏障的基因表达，尽管材料通过这种技术获得的量是非常有限的23。
在这里，我们提出了一个程序，脑血管的机械隔离由优素福等 [14]初步阐述。它提供获得纯脑血管，并根据其直径将它们分开的可能性。该协议不会勉强让整个大脑血管腔隙的净化，而我们并没有其疗效与之前公布的方案进行比较。然而，由于没有梯度，特定列和高速离心步骤使整个过程非常容易和便宜。重要的是，我们强烈建议删除脉络丛的大脑同质化之前所描述的38，因为我们经历过的污染的可能来源。其他重要的建议是：1）利用“低结合”塑料脑膜IAL（特别是枪头），因为船只坚持自然，未经处理的塑料。忽略这一点会导致大部分船只的损失; 2）小心平衡之前过滤尼龙滤膜（步骤5.2）; 3）粒料在尽可能多的缓冲尽可能过滤前的再悬浮，以提高样品的纯度; 3）如果有必要，血细胞和截留在纯化的血管蛋白质可洗出通过心内灌注用PBS前脑解剖; 4）纯化容器的产率可能通过重复从髓鞘分离在葡聚糖两次或三次（步骤4.2）39,40得到改善。对于免疫染色，我们强烈建议：1），以污染毛发和灰尘为此抗体有很大的非特异性亲和区分容器进行核标签; 2）避免离心分离收集容器各媒体的变化，因为它可能会导致材料的不可分割的球才形成。
的完整的脑血管纯化呈现很大的优势，研究血脑屏障的分子特征。虽然具体的或富集的内皮细胞和周细胞基因和途径已确定个别细胞类型18,19转录和蛋白质组研究中，公知的是离解和细胞分选技术导致细胞极性和形态的损失以及之间的互连细胞类型，这强烈地影响其分子谱。在这种情况下，保持整个血管腔隙完好如这里所描述，除星形胶质细胞，可能代表一个很大的优势。此外，相对于细胞分选，脑血管的纯化不需要使用特定的转基因报告小鼠品系或冗长免疫染色为基础的程序。另一个优点是利用大脑血管的是适应纯化协议对其他物种如已经示出了murine14的可能性，bovine13以及在人类中41,42。最后，本技术的进一步发展将是体外培养的脑血管片段。纯化的血管与原代星形细胞神经元和小胶质细胞的共培养可能有助于重新组装神经血管单元在比复杂的三维的多细胞培养系统，其中细胞首先分离和纯化被重组43.因此纯化的完整的脑血管之前一个准确的方式可能是任何类型的体外测定来研究血脑屏障的发展有很大的帮助。
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Acknowledgments
这项工作是由Labex MemoLife并通过ARSEP支持（倒基金会欧莱雅助手点菜RECHERCHE河畔拉sclérose恩斑）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
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