Abstract
No cérebro, a maior parte do sistema vascular consiste de uma barreira selectiva, a barreira sangue-cérebro (BBB) que regula a permuta de moléculas e células do sistema imunológico entre o cérebro e o sangue. Além disso, a enorme demanda metabólica neuronal requer um regulamento momento-a-momento de fluxo sanguíneo. Notavelmente, anormalidades destes regulamentos são características etiológicos da maioria das patologias cerebrais; incluindo o glioblastoma, acidente vascular cerebral, edema, epilepsia, doenças degenerativas (ex: doença de Parkinson, doença de Alzheimer), tumores cerebrais, bem como das condições inflamatórias tais como esclerose múltipla, meningite e disfunções cerebrais induzidas por sepsia. Assim, a compreensão dos eventos de sinalização que modulam a fisiologia vascular cerebral é um grande desafio. Muito conhecimento sobre as propriedades moleculares e celulares de vários tipos de células que compõem o sistema vascular cerebral pode ser adquirida a partir da cultura primária ou separação de células a partir de tecido cerebral dissociado recentemente. Contudo,Propriedades tais como polaridade celular, a morfologia e as relações intercelulares não são mantidos em tais preparações. O protocolo que se descrevem aqui é concebido para purificar fragmentos dos vasos do cérebro, ao mesmo tempo manter a integridade estrutural. Mostra-se que os vasos isolados são constituídos por células endoteliais seladas por junções apertadas, que são rodeadas por uma lâmina basal contínua. Pericitos, células musculares lisas, bem como as membranas de astrócitos endfeet perivasculares permanecem ligados à camada endotelial. Finalmente, nós descrevemos como a realização de experimentos de positividade em vasos cerebrais purificados.
Introduction
O funcionamento adequado do sistema nervoso central (SNC) requer um ambiente extracelular altamente regulada, e as demandas metabólicas são enormes em comparação com outros órgãos 1. O SNC também é extremamente sensível a uma vasta gama de produtos químicos, geralmente inofensivo para órgãos periféricos, mas a ela, neurotóxica. Para assegurar um funcionamento correcto, a maior parte do "vasculatura SNC forma uma barreira endotelial; a barreira sangue-cérebro (BBB), que controla o fluxo de moléculas e iões, bem como a passagem de células do sistema imunológico entre o sangue e o cérebro, mantendo assim a homeostase devida 2, mas também limitar a entrada de drogas terapêuticas, os tratamentos que impedem assim de distúrbios neurológicos 3. Ao nível celular, a certificação é sustentada principalmente por extensos junções apertadas entre as células endoteliais, expressão polarizada de transportadores de efluxo e uma taxa muito baixa transcitose 4. Propriedades e as funções da certificação são principalmente induzida por NEcélulas ighboring 4. Em particular, pericitos desempenhar um papel importante na indução e manutenção da certificação 5,6. Sendo células contrácteis, pericitos também regular o fluxo sanguíneo como fazem os 7 células de músculo liso circundantes grandes vasos. Finalmente, astrócitos, as principais células gliais do cérebro, enviar grandes processos chamados endfeet em torno da maioria da vasculatura cerebral 8 e modula a certificação integridade e quiescência imune 9, a transferência de metabolitos para neurónios de 10, e induzir o acoplamento apertado entre a actividade neuronal e o fluxo de sangue 11,12.
A capacidade para estudar as propriedades moleculares e celulares do sistema vascular cerebral é crucial para caracterizar melhor a sua contribuição para a fisiologia do cérebro e fisiopatologia. Para fazer face a esta questão, as estratégias para isolar sistema vascular cerebral do cérebro têm sido desenvolvidos, que permitem a preparação de fragmentos de vasos cerebrais intactas. Cerebral navio purification foi inicialmente descrita usando cérebros de bovinos 13 e melhorado e adaptado para outras espécies, em particular roedores 14. Neste último estudo, a utilização de filtros de tamanho variável foi introduzido para separar vasos cerebrais em fracções enriquecidas em recipientes de diferentes diâmetros. Curiosamente, em tais preparações, as células endoteliais mantiveram suas propriedades metabólicas 15, funcionalidade transportador 16 e 17 de polarização. Aqui, descrevemos detalhadamente este protocolo e ainda demonstrar que os navios isolados reter a maior parte de seu em estruturas in situ. As células endoteliais permanecem ligados por junções apertadas e rodeado por uma lâmina basal contínua. Pericitos e células musculares lisas permanecem ligadas à camada endotelial, bem como as membranas de astrócitos perivasculares. No entanto, astrócitos, células microgliais, neurónios e os oligodendrócitos são eliminados. Finalmente, descreve-se um procedimento para executar imunocoloração em vasos cerebrais isoladas. Até agora a maioria dos estudos moleculares e celulares relacionadas com o sistema cerebrovascular foram realizados em células dos vasos cerebrais purificados dissociadas utilizando estirpes repórter do mouse específicos de células ou procedimentos baseados imunocoloração 18,19 classificando-célula. Embora estas técnicas permite o isolamento de populações de células vasculares cerebrais quase puros, células isoladas perder completamente a sua morfologia in situ e interacções, que por sua vez, afecta grandemente as suas propriedades moleculares e celulares. O protocolo aqui descrito, permitindo o isolamento de fragmentos cerebrovasculares inteiras sem a necessidade de anticorpos específicos ou manchas de ratinhos transgénicos, oferece uma boa alternativa, a estrutura global dos vasos cerebrais isoladas é conservada, assim, diminuir repercussões sobre as suas propriedades moleculares. Isolado navios poderiam, então, ser usado para estudar a atividade do gene, a síntese de proteínas e regulação no BBB, como recentemente descrita 20,21 22,23 o presente protocolo é barato, fácil de executar e rapidamente adaptável em qualquer laboratório.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Soluções e Materiais
- Preparar soluções de vasos isolamento: B1, adicionar 1,5 mL de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, adicionar 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, adicionar 1 g de BSA para 100 ml de B1.
- Modificar o suporte do filtro cortando o fundo fora da parte superior de enroscar.
- Preparar soluções de positividade: solução de fixação, paraformaldeído a 4% em PBS pH 7,4; Permeabilização / solução de bloqueio, soro de cabra diluído a 5% e Triton X100 a 0,25% em PBS pH 7,4.
Nota: Fixação depende do tipo de anticorpos primários usados.
2. Dissecção
Nota: As condições estéreis não são requeridos, a menos que os navios são usados para fins de cultura de células.
- Prepara-se uma proveta de 150 ml com 20 ml de B1. Manter em gelo e cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar.
- Profundamente anestesiar o mouse sob um capuz com uma pequena toalha de papel embebido em 1 ml de isoflurano pura que é adicionado into da gaiola. A anestesia é verificada pela ausência de reacção com uma pitada do dedo do pé. Matar o rato por deslocamento cervical.
NOTA: Estes passos são realizados em conformidade com os regulamentos nacionais e institucionais. - Opcional: realização de perfusão intracardíaca com 20 ml de PBS 1x para eliminar o teor de sangue 24.
- Seção da pele com um bisturi do pescoço até o nariz e puxe-o para longe. Remove todos os cabelos contaminantes com PBS 1x.
- Para abrir o crânio, insira primeiro tesoura anteriormente ao bulbo olfatório, e abrir a tesoura para romper o crânio em duas partes.
- Retire cuidadosamente o cérebro usando uma espátula cérebro. Dissecar o plexo coróide dos ventrículos laterais, pois iria contaminar a preparação do vaso sanguíneo 38.
NOTA: Opcional: A preparação final conterá parênquima e vasos meninges. Se não for desejado, meninges pode ser removida seguindo o procedimento descrito por 38. - Transfer o cérebro em o copo contendo solução B1 no gelo. Até 8 cérebros pode ser tratado em conjunto.
3. A homogeneização do tecido cerebral
- Usando dois bisturis, manualmente e vigorosamente bateu o cérebro na solução B1, posteriormente, obter pequenos pedaços de cerca de 2 mm.
- Homogeneizar a preparação com um homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 passagens a 400 rpm. Assegure-se que o tubo de vidro é mantido em gelo e que a parte superior do douncer está em solução quando se deslocam para baixo e para cima, de modo a evitar a formação de bolsas de ar. Se várias amostras são preparadas, lavar a douncer com água ionizada entre cada homogeneização.
4. Purificação Vessel
- Transferir o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 ml e proceder à centrifugação a 2000 g durante 10 min a 4 ° C. Um grande interface de branco (na maior parte da mielina) irá formar na parte superior do vaso de pelete (vermelho, se não de perfusão foi realizada).
- Desprezar o sobrenadante. O sedimento navio e da interface branca irá permanecer solidários juntos. Adicionar 20 ml de solução B2 gelada e agitar o tubo manualmente e vigorosamente durante 1 min.
- Proceda à segunda centrifugação a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. A mielina irá agora formar uma camada branca densa na superfície do sobrenadante.
- Retirar cuidadosamente a camada de mielina de as paredes do tubo, segurando o tubo e rodando-a lentamente para permitir que o sobrenadante a passar ao longo das paredes. Descartar o sobrenadante com mielina. O sedimento contendo os vasos permanece presa na parte inferior do tubo.
- Seque a parede interior do tubo com um papel absorvente enrolada em torno de uma pipeta de plástico de 5 ml e remover todos os fluidos residuais, evitar tocar o sedimento navio. Manter o tubo de cabeça para baixo sobre um papel absorvente para drenar o líquido remanescente.
- Suspender o sedimento em 1 ml de solução B3 gelada por pipetagem cima e para baixo com dicas de baixa ligação, keeping o tubo em gelo, em seguida, adicionar mais 5 ml de solução B3. Certifique-se de que os navios são dispersas, tanto quanto possível e não formam agregados.
5. Filtration
- Prepara-se uma proveta em gelo com 30 ml de solução B3 gelada. Cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar.
- Colocar um filtro de malha 20 uM sobre um suporte de filtro modificado na parte superior de um frasco de Becker e equilibrar através da aplicação de 10 ml de solução B3 gelada.
- Verter a preparação navio no filtro e lavar os vasos com 40 ml de solução B3 gelada.
- Recuperar o filtro usando uma pinça limpa e mergulhe-o imediatamente no copo contendo a solução B3. Retire os navios do filtro sacudindo-o suavemente.
- Verter o conteúdo do copo num tubo de plástico de 50 ml e centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.
- Nota: Como alternativa, a suspensão dos vasos cerebrais 'a partir do passo 4.6 pode ser filtrado sobre um filtro de malha 100 micrometros de.Neste caso, navios maiores são preferencialmente retidos no filtro enquanto o fluxo através contém principalmente microvasos (capilares), que são, em seguida, filtrada através de um filtro de 20 fim mesh como acima.
- Ressuspender o sedimento de microvasos em 1 ml de solução B3 gelada e transferi-lo, pipetando-o para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.
6. Fixação, permeabilização e bloqueio
- Vasos de transferência por pipetagem em tubos de PCR de 0,2 ml contendo PBS usando um 1,0 ml baixa ponta de ligação. Tenha cuidado para não tocar os vasos, pois podem aderir à parte exterior da ponta. Executar todas as etapas a seguir em um microscópio binocular.
- Para cada um dos seguintes mudanças de meio, deixar os tubos em gelo até os vasos ter atingido o fundo, e pipetar a maior parte dos líquidos usando longos e coisa gel de carregamento de pontas de pipeta.
- Remover a maior parte do PBS e adicionar 200 ul de solução fixadora.Suspender os vasos agitando suavemente e incuba-se durante 20 min à TA.
- Pipeta a solução fixadora e substituí-la por 200 mL de 1x PBS (primeira lavagem), incubar durante 5 min a RT e repita esta etapa 3 vezes. Cada vez, verificar que os navios tenham correctamente depositada no fundo dos tubos e pipeta fora 1x PBS, garantindo os vasos não são tocados.
- Após a última lavagem, substitua por PBS 1x / solução de permeabilização de bloqueio e incubar 1 hora à TA, ressuspensão dos vasos, agitando suavemente ao longo do tempo.
7. Immunostaining
- Substitua o / bloqueio solução de permeabilização com a mistura de anticorpos primários (ver referências dos anticorpos usados aqui e diluições na tabela modelo de Materiais) diluído na / solução de bloqueio permeabilização, e incubar a 4 ° CO / N.
- Após 3 lavagens em PBS, à TA, incubar os vasos com a mistura de anticorpos secundários diluído em PBS durante 2 hà TA.
- Nota: recomendamos a realização de coloração nuclear com Hoechst (1: 2.000) ou DAPI (1: 2.000), a fim de distinguir os navios de possíveis contaminantes cabelos ou poeiras sob o microscópio.
- Após 3 lavagens em PBS, ressuspender os vasos em 50 ul de PBS.
8. Montagem e Observação
- Prepare uma ponta com um capilar de vidro siliconizada: cortar uma ponta de pipeta P200 utilizando um bisturi e ajustar o capilar no interior. O volume aproximado do tubo capilar é de 40 ul.
- Transferir os recipientes para uma lâmina de vidro usando o capilar de vidro siliconizada e cuidadosamente remover o líquido com um pedaço de papel absorvente.
- Aplicar uma única gota de meio de montagem para os navios e mantenha uma lamela a 45º permitindo que a gota espalhar-se ao longo da borda do deslizamento. Vamos sair da lamela e permitir meio para espalhar lentamente. Deixá-lo seco O / N à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Os navios podem ser observados sob uma fluoresmicroscópio confocal ent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui, descrevemos um protocolo permitindo o isolamento mecânica dos vasos cerebrais 14. Figura 1 resume as principais etapas desta técnica. A arquitetura dos vasos cerebrais é complexa e inclui vários tipos de células, isto é, células endoteliais seladas por junções apertadas e pericitos, rodeados por células de músculo liso, e os processos de astrócitos do pé 9. Assim, após o isolamento dos vasos cerebrais, que teve como objetivo caracterizar a estrutura dos vasos purificados por imunocoloração como descrito na segunda parte do nosso protocolo. Agrina, uma componente da lâmina basal endotelial foi continuamente e homogeneamente rotulados a superfície endotelial (Figura 2A). Zona occludens-1 (ZO-1), um dos componentes de junções apertadas endoteliais foi imunocoradas com nenhuma descontinuidade aparente, sugerindo que junções apertadas endoteliais foram conservados (Figura 2B). A cobertura pericyte endotelial, etiquetaed por NG2, apareceu quase contínua 25, como descrito anteriormente (Figura 2C). Finalmente, rotulagem actina de músculo liso, revelou a presença de uma camada de células de músculo liso denso nas superfícies dos grandes vasos purificados (Figura 2D). Estes resultados mostraram que a estrutura global do recipiente de cérebro in situ foi conservado nos fragmentos isolados dos vasos.
Os astrócitos têm sido mostrados para enviar grandes processos, ou 'endfeet' para a superfície dos vasos, embainhar quase inteiramente o sistema cerebrovascular 8. Sua interação com os vasos apertado e seu papel na manutenção e regular várias funções vasculares cerebrais, designado-los como uma parte crucial da unidade neurovascular 9. Foram analisados ainda mais a cobertura vascular astrócitos de vasos cerebrais isoladas. Imunomarcação do filamento intermediário astrocítica GFAP, normalmente presente em toda a astrócitos (Figura 3A), WAé apenas parcialmente presente nos navios purificados mostrando algumas fibras curtas na superfície endotelial (Figura 3B-C). Em contraste, conexina 43, uma proteína de junção de hiato altamente enriquecida em membranas astrogliais perivasculares 26, foi altamente detectado na superfície dos grandes vasos purificada (Figura 3D) e capilares (Figura 3E). Da mesma forma, imunomarcação de Aquaporin-4 (AQP4), um membro da família canal de água expressa muito ao nível das membranas astrócitos que enfrentam os vasos 27, 26, delineando as paredes dos vasos isolados (Figura 3F-G). Embora os astrócitos não foram co-purificada com vasos, suas membranas endfeet perivasculares permaneceu ligado durante o processo mecânico de isolamento navio cérebro.
Finalmente, examinámos a possível contaminação dos nossos preparados por outros tipos de células neurais. Imunomarcação de filamentos intermediários neuronais (NFM) (HornunG et ai, 1999) revelou a presença de algumas fibras que permanecem ligadas aos navios, indicando um possível a co-purificação de alguns terminais neuronais (Figura 4A-B). A microglia, marcado por Iba1 (Figura 4C-D) e oligodendrócitos, marcado por Olig2 (Figura 4E-F) não foram detectados em vasos isolados. Assim, os neurônios, microglia e oligodendrócitos não foram co-purificada com os vasos cerebrais.
Juntos, estes resultados indicam que o protocolo descrito permite a purificação de fragmentos de vasos cerebrais estruturalmente conservados, sobre a qual as membranas astrocíticos perivasculares permanecem ligados.
Figura 1. Esquema Resumo da Purificação Protocolo Veículo cérebro. Os passos principais são apresentados. Este desenho indica as três fracções de vasos possíveis que podem ser obtidos, dependendo da fi lters utilizados (20 ou 100 um de malha). S1: microvasos e grandes vasos, S2: grandes vasos e S3:. Microvasos Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Isolado Vessels Reter a maioria de suas In Situ Estrutura. Projeções de imagem confocal de vasos cerebrais isolado rato imunomarcadas. (A) Lâmina basal imunomarcadas para Agrin (vermelho). (B) de células endoteliais junções apertadas imunomarcadas para zonula occludens (ZO-1 ) (vermelho). (C) Pericitos imunomarcadas para NG2 (vermelho). (D) As células musculares lisas imunomarcadas para a actina do músculo liso (SMA) (vermelho). Os núcleos são corados com Hoechst (azul).pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. astrócitos Endfeet Membranas permanecer solidários com os navios purificados. Projeções de imagem confocal. (A) Imagem de uma seção do cérebro que mostra um navio cortical histoquímica para endotelial PECAM (branco), GFAP astrocitária (vermelho) e conexina 43 (Cx43) (verde ). (B, C) imunomarcação GFAP (verde) na superfície de um capilar isolado marcado por isolectin B4 (branco) (B) ou de um grande navio rotulado para actina do músculo liso (SMA) (vermelho) (C). (C) é uma re-impressão com a permissão de 20 (D, E) Cx43 imunomarcação (verde) na superfície de um capilar isolado marcado por isolectin B4 (branco) (D) ou de um grande navio marcado para a actina do músculo liso (SMA) (vermelho)
Figura 4:.. Neurônios, Microglia e oligodendrócitos são Not co-purificada com vasos cerebrais projeções de imagem confocal (A, B) neurofilamento (NFM) imunocoloração em uma fatia de 20 mm de espessura do hipocampo (vermelho) (A) e vasos cerebrais purificados ( B). (C, B) microglia Iba1 immunostaining em uma fatia cortical 20 um de espessura (red) (C) e os vasos cerebrais purificados (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 immunostaining em uma fatia cortical 20 mm de espessura (vermelho) (E) e os vasos cerebrais purificados (F). Os núcleos são corados pela Hoechst (branco ), o endotélio por Isolectine B4 (IB4) (verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A barreira sangue-cérebro regula a passagem de substâncias fisiológicas dentro e fora do sistema nervoso central e o protege contra substâncias potencialmente nocivas presentes no sangue. Ele está envolvido em várias patologias do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas 2 e tumores cerebrais 28. A baixíssima permeabilidade da certificação também dificulta a passagem de agentes terapêuticos que visam células neurais e ao desenvolvimento de métodos que pretendem abrir reversível a certificação sem conseqüências deletérias para o cérebro é um campo de pesquisa muito ativa 3. Foram feitos muitos esforços para desenvolver modelos valiosos e técnicas que permitam investigações celulares, moleculares e farmacológicas do BBB, e em particular, protocolos para o isolamento de vasos do cérebro de roedores. As primeiras tentativas simplesmente microvasos a partir do tecido cerebral dissociado mecanicamente usando malhas de tamanho de poros de variáveis para descartar contaminar células do parênquima cerebral coletadas 13, 29, 30, 31. Gradiente de densidade de centrifugação mais tarde foi introduzida associada a filtração dos vasos cerebrais em malhas de nylon ou em grânulos de vidro colunas 32, 33, 15. Nestes procedimentos, contas de vidro contra filtração malha de nylon apareceu para melhorar o rendimento e de alta contra centrifugação a baixa velocidade, microvasos pureza, apesar de centrifugação de alta velocidade induz também a tensão de cisalhamento que afeta a expressão do gene 15, 32. Um passo adicional de digestão enzimática também foi introduzida em alguns protocolos a seguir ao passo de dissociação 34 com o objectivo de separar os neurónios e os astrócitos aderentes para aumentar a pureza de microvasos 35. No entanto, uma pré-digestão excessiva também pode interromper integridade microcapilar 36, 37. Mais recentemente, microdissecação imuno-captura laser (imuno-LCM) foi mostrado para permitir a recuperação de navios ou mesmo de populações de células distintas na vesseLS, para examinar as alterações na expressão de genes a certificação, embora a quantidade de material obtido por esta técnica é muito limitada 23.
Aqui, apresentamos um procedimento para um isolamento mecânico de vasos cerebrais inicialmente elaborado por Yousif et al 14. Ele oferece a possibilidade de obter vasos cerebrais puros, e separá-los de acordo com seu diâmetro. Este protocolo não pretende permitir a purificação de todo o compartimento vascular cerebral, e nós não comparar sua eficácia com os protocolos publicados anteriores. No entanto, a ausência de gradiente, colunas específicas e os passos de centrifugação de alta velocidade faz com que o procedimento geral muito fácil e barata. Importante, é altamente recomendável para remover o plexo coróide como descrito por 38 antes de homogeneização do cérebro, como a que vivemos-lo como uma possível fonte de contaminação. Outras recomendações importantes são: 1) o uso de "baixa ligação" mater plásticoial (em particular, pontas de pipeta) desde vasos aderir naturalmente para plásticos não tratados. Omitindo este ponto iria resultar na perda da maior parte dos vasos; 2) o equilíbrio cuidadoso de filtros de nylon antes da filtração (Passo 5.2); 3) A ressuspensão do sedimento em tampão de tanto quanto possível, antes da filtração para melhorar a pureza da amostra; 3) Se necessário, as células sanguíneas e proteínas presas nos vasos purificados pode ser lavado por perfusão intracardíaca com PBS antes da dissecção cérebro; 4) O rendimento dos vasos purificadas pode ser melhorada através da repetição da separação da mielina em dextrano duas ou três vezes (passo 4.2) 39,40. Para immunostaining, recomendamos: 1) para realizar uma rotulagem nuclear, a fim de distinguir os navios de contaminar pêlos e poeiras para a qual os anticorpos têm grande afinidade não específica; 2) evitar a recolha dos vasos por centrifugação antes de cada alteração do meio, uma vez que podem resultar na formação de uma bola de material indissolúvel.
A purificação dos vasos cerebrais intactas apresentar grandes vantagens de estudar as características moleculares do BBB. Embora os genes e vias específicas ou enriquecidos endoteliais e pericitos foram identificadas por estudos transcriptomic e proteomic sobre tipos de células individuais de 18,19, que é bem conhecido que as técnicas de dissociação e de separação de células a conduzir a perda da polaridade celular e morfologia bem como a interligação entre tipos de células, que impactam fortemente seus perfis moleculares. Neste contexto, mantendo todo o compartimento vascular intacto, tal como descrito aqui, com a excepção de astrócitos, pode representar uma grande vantagem. Além disso, em comparação com separação de células, purificação dos vasos cerebrais não requer o uso de estirpes de ratinho transgénico repórter específicos ou imunocoloração à base de procedimentos morosos. Outra vantagem com a utilização dos vasos do cérebro, é a possibilidade de adaptar o protocolo de purificação para outras espécies, como já explicado para murine14, Bovine13, bem como em seres humanos 41,42. Finalmente, um outro desenvolvimento da presente técnica seria a cultura in vitro de fragmentos de vasos cerebrais. Co-cultura de vasos purificados com neurónios e astrócitos primários de células microgliais pode ajudar a montar a unidade neurovascular de forma precisa do que os sistemas multicelulares 3-dimensionais complexos de cultura em que as células são primeiro isolados e purificados antes de serem reagrupados 43. Assim, a purificação dos vasos cerebrais intactas pode ser de grande ajuda para o desenvolvimento de qualquer tipo de ensaios in vitro para estudar o BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Labex MemoLife e pelo ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en placas)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
