Abstract
脳内、血管系の大部分は、選択的障壁から成り、脳と血液との間の分子および免疫細胞の交換を調節する血液脳関門（BBB）。また、巨大なニューロンの代謝要求は、血流のその時々の規制が必要です。注目すべきは、これらの規制の異常が最も脳の病理の病原特徴です。 、脳腫瘍、ならびに、多発性硬化症、髄膜炎、および敗血症によって誘発される脳機能障害のような炎症状態：神経膠芽腫、脳梗塞、浮腫、てんかん、変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病例）を含みます。このように、脳血管生理機能を調節するシグナル伝達事象を理解することは大きな課題です。脳血管系を構成する種々の細胞型の細胞および分子の性質に非常に洞察を新たに分離した脳組織から選別初代培養または細胞から得ることができます。しかし、このような細胞極性、形態や細胞間の関係のような特性は、このような製剤中で維持されていません。ここで説明するプロトコルは、構造的完全性を維持しながら、脳血管断片を精製するために設計されています。我々は、単離された血管が連続基底膜で囲まれているタイトジャンクションで封止された内皮細胞から構成されていることを示しています。周皮細胞、平滑筋細胞ならびに血管周囲のアストロサイトのエンドフィートの膜は、内皮層に付着したままです。最後に、精製された脳血管に免疫染色実験を実行する方法について説明します。
Introduction
中枢神経系（CNS）の適切な機能は、高度に調節された細胞外環境を必要とし、その代謝要求は、他の臓器1に比べて巨大です。 CNSはまた、一般的に末梢器官に無害それに、神経毒性の化学物質の広い範囲、に非常に敏感です。正しい機能を保証するために、CNS「血管系のほとんどは、内皮障壁を形成します。分子およびイオンの流れ、並びに、血液と脳の間の免疫細胞の通過を制御する血液脳関門（BBB）は、このようにして治療を妨げ、それによって適切な2ホメオスタシスを維持するだけでなく、治療薬の侵入を制限します神経疾患の3。細胞レベルでは、BBBは、主に内皮細胞、排出トランスポーターの偏発現と非常に低いトランスサイトーシス率4との間に大規模なタイトジャンクションによって維持されます。 BBBの性質や機能は、主にNEによって誘導されますighboring細胞4。具体的には、周皮細胞は、BBB 5,6を誘導し、維持する上で重要な役割を果たしています。大血管の周囲の平滑筋細胞がそうであるように、収縮された細胞、周皮細胞は、血液の流れ7を制御します 。最後に、アストロサイト、脳の主要なグリア細胞、脳血管系8のほとんどの周りにエンドフィートという名前の大きなプロセスを送信し、BBBの完全性と免疫静止9を調節し 、ニューロン10の代謝物の転送、および神経活動の間に緊密な結合を誘導し、血流11,12。
脳血管系の分子や細胞の性質を研究する能力は、脳生理学や生理病理への貢献をより良く特徴付けることが重要です。この質問に取り組むためには、脳の脳血管系を隔離するための戦略は、無傷の脳血管フラグメントの調製を可能にする、開発されています。脳血管Purificationは当初、特にげっ歯類14で、他の種にウシ脳13を用いて説明し、改善し、適応させました。この最後の研究では、様々なサイズのフィルターの使用は、異なる直径の容器内で濃縮画分に脳血管を分離するために導入されました。興味深いことに、このような製剤には、内皮細胞は、それらの代謝特性15、トランスポーターの機能16と、偏光17を保ちました。ここでは、具体的に、このプロトコルを記述し、さらに単離血管が自分の中でその場構造のほとんどを維持することを示しています。内皮細胞は、タイトジャンクションによってリンクされ、連続的な基底膜に囲まれたままです。周皮細胞および平滑筋細胞、内皮層、ならびに血管周囲の星状細胞膜に付着したままです。しかし、アストロサイト、ミクログリア細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトが排除されます。最後に、我々は、単離された脳血管に免疫染色を行うための手順を説明します。 これまで脳血管系に関わる分子および細胞研究のほとんどは、細胞選別細胞特異的レポーターマウス系統または免疫染色に基づく手順18,19を使用して精製した解離脳血管細胞上で行われています。これらの技術は、ほぼ純粋な脳血管細胞集団の単離のために可能にするが、単離された細胞は、完全に順番に、非常にそれらの分子や細胞の特性に影響を与える彼らのその場での形態との相互作用を、失います。分離された脳血管の全体的な構造は、それらの分子特性に影響を小さく、したがって、保存されているとして、ここで説明されたプロトコルは、特異的な抗体またはトランスジェニックマウスの汚れの必要のない全脳血管の断片を単離を可能にする、優れた代替手段を提供しています。最近20,21に記載のように単離された容器は、その後BBBにおける遺伝子活性、タンパク質合成および調節を研究するために使用されるかもしれません22,23と比較して、本発明のプロトコルは、安価で実行が容易で、任意の研究室に急速に適応可能です。
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Protocol
1.ソリューションと材料
- 分離容器の溶液を調製する：B1、HBSSの150ミリリットルにHEPES 1M、1.5mlのを追加します。 B2、B1の20ミリリットルにデキストラン3.6gのを追加します。 B3は、B1の100mlに、BSAの1グラムを追加します。
- 上部のネジ止め部分から下部を切断してフィルターホルダーを変更します。
- 免疫染色ソリューション準備：固定液、pH7.4のPBS中4％パラホルムアルデヒドを、透過処理は、/ブロッキング溶液、5％にヤギ血清を希釈し、pH7.4のPBS中の0.25％のトリトンX100。
注意：固定は、用いた一次抗体の種類によって異なります。
2.解剖
注意：容器は、細胞培養のために使用されていない限り、滅菌条件は、必要とされません。
- B1の20mlで150ミリリットルのビーカーを用意します。氷上に保ち、空気汚染を避けるために、パラフィルムでカバーしています。
- 深くint型を追加された純粋なイソフルランの1ミリリットルに浸した小さな紙タオルでボンネットの下にマウスを麻酔ケージO。麻酔は、つま先のピンチに反応の欠如によって確認されました。頸椎脱臼によりマウスを殺します。
注：これらの手順は、国家や機関の規制に準拠して達成されます。 - オプション：血液コンテンツ 24 を除去するために 、PBS 1×20mlで心臓内灌流を行います。
- 第鼻に首からメスで皮膚と離れてそれを引っ張ります。 PBS 1Xを持つすべての汚染毛を削除します。
- 頭蓋骨を開くには、最初の嗅球に前方にはさみを入れ、2つの部分で頭蓋骨を破壊するはさみを開きます。
- 慎重に脳へらを使って脳を削除してください。彼らは血管の準備38を汚染するよう側脳室から脈絡叢を解剖。
注：オプション：最終製剤は実質および髄膜血管を含んでいます。望まれていない場合、髄膜38によって記載された手順に従って剥離することができます。 - Trの氷上B1溶液を含有するビーカーに脳をansfer。最大8脳を一緒に処理することができます。
3.脳組織の均質化
- その後、約2mmの小片を取得B1溶液中で脳を破っ手動で、激しく、2メスを使用しました。
- 400 rpmで20ストロークを行う、自動化さダウンスホモジナイザーで準備を均質化。エアポケットの形成を防止するように、ガラス管を氷中に維持されると、上下移動時にdouncerの上部が溶液中にあることを確認します。いくつかのサンプルが用意されている場合は、それぞれの均質化の間にイオン水でdouncerを洗います。
4.船の精製
- 50ミリリットルのプラスチックチューブにホモジネートを移し、4℃で10分間2000グラムで遠心分離に進みます。何の灌流を行わなかった場合は大きな白いインタフェース（主にミエリン）を容器ペレット（赤の上に形成することになります）。
- 上清を捨てます。容器ペレットと白のインターフェイスが一緒に付着したままになります。氷冷B2溶液20mlを加え、1分間手で激しくチューブを振ります。
- 4℃で15分間4400グラムで2回目の遠心分離に進みます。ミエリンは、現在上清の表面に高密度の白色層を形成します。
- 慎重にチューブを保持し、ゆっくり上清を壁に沿って通過させるためにそれを回転させることにより、チューブ壁からミエリン層を切り離します。上清とミエリンを捨てます。血管を含むペレットは、チューブの底に付着したままです。
- 5ミリリットルのプラスチックピペットに巻き付け吸収紙でチューブの内壁をブロットおよびすべての残留流体を除去、血管ペレットを触れないように注意してください。残りの液体を排出するために吸収紙の上にチューブ逆さまにしてください。
- 低結合ヒントをピペッティングにより氷冷B3溶液1mlでペレットを中断し、keepiチューブを氷上にngのは、B3液の別の5ミリリットルを追加します。船を極力分散され、凝集体を形成しないことを確認します。
5.ろ過
- 氷冷B3液30mlで氷の上でビーカーを準備します。空気汚染を避けるためにパラフィルムでカバー。
- ベッカーフラスコの上に修正されたフィルターホルダーに20ミクロンメッシュフィルターを配置し、氷冷B3溶液10mlを適用することにより平衡化。
- フィルター上の容器の準備を注ぎ、氷冷B3液40mlで血管をすすぎます。
- きれいなピンセットを使用してフィルタを回復し、すぐB3液の入ったビーカーの中に浸します。軽く振ることによってフィルターから血管を外します。
- 4℃で5分間、2,000×gで50 mlのプラスチックチューブと遠心分離機でビーカーの内容を注ぎます。
- 注：または、ステップ4.6からの脳船舶の懸濁液を100ミクロンメッシュフィルターに濾過することができます。フロースルーは、次いで、上記のように20μmのメッシュのフィルターで濾過された微小血管（主として毛細血管）を含むが、この場合には、より大きな血管が優先フィルター上に保持されます。
- 氷冷B3溶液1mlに微小血管のペレットを再懸濁し、1.5mlのエッペンドルフチューブにそれをピペッティングすることにより、それを転送します。 4℃で5分間2000グラムで遠心。
6.固定、透過処理およびブロッキング
- 1.0ミリリットル低い結合チップを用いて、PBSを含む0.2ミリリットルのPCRチューブにピペット操作による転送船。彼らは先端の外側の部分に付着し得るような血管を触れないように注意してください。双眼顕微鏡下で、次のすべての手順を実行します。
- 以下の培地の変更ごとに、血管が底に到達するまで氷上にチューブを残して、長い事ゲルローディングピペットチップを使用して液体のほとんどをピペット。
- PBSの大部分を除去し、固定溶液の200μlを添加します。軽く振ることによって血管を一時停止し、室温で20分間インキュベートします。
- 固定溶液をピペット1×PBS（第一洗浄）を200μlと交換し、室温で5分間インキュベートし、この手順を3回繰り返します。たびに、血管が正常血管が触れていない保証し、1×PBSアウトチューブ、ピペットの底に沈んでいることを確認してください。
- 最後の洗浄後、随時穏やかに振とうすることにより、血管を再懸濁、透過処理/ブロッキング溶液によって1×PBSを交換し、室温で1時間インキュベートします。
7.免疫染色
- 透過化/ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体（材料テンプレートテーブルでここと希釈液を用いた抗体の参考文献を参照）が混在する透過処理/ブロッキング溶液を交換し、4°CO / Nでインキュベートします。
- 室温でPBS中で3回洗浄した後、2時間PBS中に希釈した二次抗体の混合物で血管をインキュベートRTで。
- 注意：顕微鏡下で毛や埃の混入可能性から血管を区別するために：（2000 1）またはDAPI：私たちは強くヘキスト（2000 1）で核染色を行うお勧めします。
- PBS中で3回洗浄した後、PBSを50μlの血管を再懸濁します。
8.取り付けと観測
- シリコン処理ガラスキャピラリーで先端を準備します。メスを用いてP200のピペットチップをカットし、内部の毛細血管を調整します。キャピラリーのおおよその量は40μLです。
- シリコン処理ガラスキャピラリーを用いてガラススライドに船を移し、慎重に吸収紙の切れ端で液体を除去します。
- 船の上に封入剤の一滴を適用し、ドロップがスリップの縁に沿って拡散することを可能にする45°でカバーガラスを保持します。カバースリップをオフに行ってみようと媒体がゆっくりと広がりを可能にします。それ乾燥したO / N室温で光から保護してみましょう。容器はfluoresc下で観察することができENT共焦点顕微鏡。
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Representative Results
ここでは、脳血管14の機械的な分離を可能にするプロトコルを記述している。 図1は、この技術の主な手順をまとめたものです。脳血管の構造は複雑であり、いくつかの細胞型を含む、すなわち、内皮細胞のタイトジャンクションによって密封され、周皮細胞、平滑筋細胞、および星状細胞の足突起9によって囲ま。このように、脳血管の単離後、私たちはプロトコルの第2の部分で説明したように免疫染色することにより精製した血管の構造を特徴づけることを目的としました。アグリン、内皮基底膜の成分が連続的かつ均一に内皮表面（ 図2A）で標識しました。ソナはoccludens-1（ZO-1）を、内皮タイトジャンクションの構成要素の一つは、内皮タイトジャンクションが（ 図2B）保存されていたことを示唆し、明らかな不連続で免疫染色しました。周皮細胞の内皮報道、ラベル以前25（ 図2C）に記載されているようNG2により編、ほぼ連続登場。最後に、平滑筋アクチン標識が大きい精製血管（ 図2D）の表面に高密度の平滑筋細胞層の存在が明らかになりました。これらの結果は 、in situ脳血管構造の全体的な容器は、単離された断片に保存されたことを示しました。
アストロサイトは、ほぼ完全に脳血管系8を外装、容器の表面に大きなプロセス、または'エンドフィート」を送信することが示されています。血管や神経血管ユニット9の重要な部分として、それらを指定された、様々な脳機能を維持し、調節におけるその役割と、そのタイトな相互作用。我々はさらに、単離された脳血管のアストロサイトの血管のカバレッジを分析しました。通常、全体のアストロサイト（ 図3A）に存在する星状細胞の中間フィラメントGFAP、ワシントン州の免疫標識部分的にしか存在内皮表面でいくつかの短繊維（ 図3B-C）を示す精製された船舶のよ。対照的に、コネキシン43は、高度に血管周囲のアストログリア膜26に富むギャップ結合タンパク質は、高度に精製された大血管（ 図3D）および毛細血管（ 図3E）の表面で検出されました。同様に、アクアポリン4（AQP4）の免疫標識は、水チャネルファミリーのメンバーは、非常に単離された血管（ 図3F-G）の壁の輪郭を描く、血管27、26に面した星状細胞膜のレベルで発現されます。アストロサイトは、血管と同時精製されなかったが、その血管周囲のエンドフィートの膜は、脳の血管の分離の機械的手順の間に付着したままでした。
最後に、我々は他の神経細胞の種類によって、当社の製剤の汚染の可能性を検討しました。神経細胞の中間径フィラメント（NFM）の免疫標識（Hornunグラムら 、1999）は、いくつかのニューロンの末端（ 図4A-B）の可能な同時精製を示す、容器に取り付けられたいくつかの残りの繊維の存在が明らかになりました。ミクログリア、IBA1（ 図4C-D）で標識し、Olig2（ 図4E-F）によって標識オリゴデンドロサイトは、分離された容器内で検出されませんでした。したがって、ニューロン、ミクログリアおよびオリゴデンドロサイトは、脳血管で同時精製しませんでした。
まとめると、これらの結果は、記載されているプロトコルは、血管周囲のアストロサイトの膜が付着したままその上に構造的に保存された脳血管フラグメントの精製を可能にすることを示しています。
脳血管精製プロトコルの図1.概要スキーム。主要なステップが示されています。このスケッチはFiのに応じて得ることができる3つの可能な血管分画を示し、使用lters（20または100ミクロンメッシュ）。 S1：微小血管および大血管、S2：大型船とS3：微小血管。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.単離された船舶は、 その場の構造では彼らの大部分を保持します。免疫染色単離したマウスの脳血管の共焦点画像投影。アグリン（赤）のための免疫標識（A）基底層。（B）は、内皮細胞のタイトジャンクションが閉鎖帯Occludens（ZO-1のための免疫標識） （赤）。 （C）周皮細胞は、NG2（赤）、（D）、平滑筋アクチン（SMA）免疫標識のための平滑筋細胞（赤色）のために免疫標識。核はヘキスト（青色）で染色します。PG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.アストロサイトエンドフィート膜は、精製された船舶に付着したままである。共焦点画像投影。内皮PECAM（白）について免疫皮質血管を示す脳切片の（A）画像 、アストロサイトGFAP（赤）とコネキシン43（Cx43の）（緑）。（B、C）のGFAP免疫標識（緑）イソレクチンB4（白）、（B）または平滑筋アクチン（SMA）（赤）（C）のために標識大型容器のラベルされた分離されたキャピラリーの表面で。 （C）はイソレクチンB4（白）（D）でラベルされた孤立したキャピラリーの表面の20（D、E）のCx43免疫標識（緑）からの許可を得て再プリントであります または平滑筋アクチン（SMA）（赤）のために標識大血管の
図4：ニューロン、ミクログリアおよびオリゴデンドロサイトは、脳血管との共精製されていない共焦点画像投影（A、B）ニューロフィラメント（NFM）、厚さ20μmの海馬スライス（赤）（A）および精製脳血管に免疫染色（。。厚さ20μmの皮質スライスのB）。（C、B）ミクログリアIBA1免疫染色（RED）（C）および精製脳血管（D）。（E、F）の厚さ20μmの皮質スライス（赤のオリゴデンドロサイトOlig2免疫染色）、（E）および精製脳血管（F）。核はヘキストで染色されている（白）、IsolectineのB4（IB4）（緑）によって内皮。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
血液脳関門は、CNSの中と外の生理学的物質の通過を調節し、血液中に存在する潜在的に有害な物質に対してそれを保護します。これは、神経変性疾患2と脳腫瘍28を含む、いくつかの中枢神経系の病態に関与しています。 BBBの極めて低い透過性はまた、神経細胞を標的治療薬の通過妨げと可逆的に脳のための有害な結果を伴うBBBを開くしようとする方法の開発は、研究3の非常に活発な分野です。多くの努力は、齧歯類脳から血管を分離するための貴重なモデルとBBBの、細胞の分子的および薬理学的研究を可能技術、特に、プロトコルを開発するために行われています。最初の試みは、単純に、脳実質細胞13を汚染廃棄する可変細孔サイズのメッシュを使用して機械的に分離脳組織からの微小血管を収集します、29、30、31。密度勾配遠心分離は、後の列32、33、15、ナイロンメッシュまたはガラスビーズで脳血管の濾過に関連し導入しました。これらの手順では、ナイロンメッシュ濾過対ガラスビーズは、高速遠心分離はまた、遺伝子発現の15、32に影響を与え 、剪断応力を誘発するが、歩留まりを向上させ、低速遠心分離、微小血管の純度に対する高いように思われました。酵素消化の追加のステップは、また、微小血管純度35を高めるために接着性ニューロンとアストロサイトの着脱を目的とした解離ステップ 34次のいくつかのプロトコルで導入されました。しかし、過度の事前消化はまた、マイクロキャピラリーの整合性36、37が妨げられることがあります。より最近では、免疫レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM免疫）は、血管のあるいはvesseにおける異なる細胞集団の回収を可能にするために示されていますこの手法により得られた材料の量は、23非常に限られているが、LS、BBBの遺伝子発現の変化を調べました。
ここでは、最初にYousif ら 14で詳述脳血管の機械的な分離のための手順を提示します。それは純粋な脳の血管を取得する可能性を提供し、それらの直径に応じてそれらを分離します。このプロトコルは、脳全体の血管コンパートメントの精製を可能にするためにふりをしない、と私たちは以前公開されたプロトコルで、その有効性を比較しませんでした。しかし、勾配、特定のカラム、高速遠心分離工程が存在しないことは、全体的な手順は非常に簡単で安価になります。脳の均質化の前に38で説明したように、我々は、汚染の可能性のあるソースとしてそれを経験として重要なことは、私たちは強く、脈絡叢を削除することをお勧めします。その他の重要な推奨事項は以下のとおりです。1）「低結合」プラスチック母校の使用船以来（特にピペットチップ内）IALは、未処理のプラスチックに自然に付着します。ほとんどの血管の損失をもたらすこの点を省略する。 2）ろ過前にナイロンフィルターを慎重に平衡（ステップ5.2）。 3）濾過の前にできるだけバッファ内のペレットの再懸濁サンプルの純度を向上させます。 3）必要に応じて、血液細胞および精製された船の中に閉じ込めタンパク質が脳の解剖の前にPBSで心臓内灌流によって洗い流すことができます。 4）精製した血管の収率は、デキストランで2回または3回（ステップ4.2）39,40をミエリンからの分離を繰り返すことにより改善されるかもしれません。免疫染色のために、私たちは強くお勧めします：1）抗体は偉大な非特異的な親和性を持っている毛や埃を汚染から血管を区別するために、核の標識を実行します。 2）それは、材料の切り離せないボールの形成をもたらし得るような各培地交換の前に遠心分離することにより、血管を収集避けるために。
無傷の脳血管の精製は、BBBの分子特性を研究するために大きな利点を提示します。特定または濃縮内皮細胞および周皮細胞遺伝子および経路は、個々の細胞型18,19のトランスクリプトームおよびプロテオミクス研究によって同定されているが、それは十分に解離し、細胞選別技術はとの間の相互接続だけでなく、細胞極性および形態の損失につながることが知られています強くそれらの分子プロファイルに影響を与える細胞型。この文脈では、ここで説明するようにアストロサイトを除いて、そのまま全体の血管区画を保ち、大きな利点を表している可能性があります。さらに、細胞選別に比べて、脳血管の精製は、特定のトランスジェニックレポーターマウス系統または長い免疫染色ベースの手順を使用する必要はありません。すでにmurine14について示されるように、脳血管の使用の別の利点は、他の種に精製プロトコールを適応させる可能性であります、人間41,42の他にもbovine13。最後に、本 技術のさらなる開発は、脳血管フラグメントのインビトロ培養であろう。初代星状細胞の神経細胞およびミクログリア細胞で精製血管の共培養は、細胞が最初に無傷の脳血管の43したがって、精製を再組み立てされる前に、単離精製された複雑な3次元多細胞培養システムより正確な方法で神経血管ユニットを再構築するのに役立つかもしれませんBBBを研究するためのin vitroアッセイのいずれかのタイプの開発のための大きな助けになるかもしれません。
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Acknowledgments
この作品は、Labex MemoLifeによっておよびARSEPによってサポートされていました（財団はラRECHERCHEシュル・ラ・硬化させるアンプラークàL'補佐官を注ぎます）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
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