Abstract
В головном мозге, большинство из сосудистой системы состоит из селективного барьера гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует обмен молекул и клеток иммунной системы между головным мозгом и кровью. Кроме того, огромный спрос нейронов метаболический требует регулирования момента к моменту кровотока. Примечательно, нарушения этих регулировок этиологические признаки большинства патологий головного мозга; в том числе глиобластомы, инсульт, отек, эпилепсия, дегенеративных заболеваний (например: болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера), опухоли головного мозга, а также воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, менингит и сепсис-индуцированной дисфункции мозга. Таким образом, понимание сигнализации события модуляции цереброваскулярные физиологии является серьезной проблемой. Большая понимание клеточных и молекулярных свойств различных типов клеток, которые составляют систему цереброваскулярные могут быть получены от первичной культуры или сортировки клеток из свежего диссоциированного мозговой ткани. Однако,свойства, такие как клеточной полярности, морфологии и межклеточных отношений не поддерживается в таких препаратах. Протокол, который мы здесь описывать предназначен для очистки фрагментов мозга сосудов, сохраняя структурную целостность. Покажем, что изолированные сосуды состоят из эндотелиальных клеток, герметично плотных контактов, которые окружены непрерывной базальной пластинки. Перициты, гладкомышечные клетки, а также периваскулярные астроцитов endfeet мембраны остаются прикрепленными к эндотелиальный слой. Наконец, мы опишем, как выполнять Иммуноокрашивание эксперименты на очищенных сосудов головного мозга.
Introduction
Правильная работа центральной нервной системы (ЦНС) требует высокой регулируемой внеклеточной среде, и его метаболических потребностей огромны по сравнению с другими органами 1. ЦНС также очень чувствительны к широкому спектру химических веществ, как правило, безвредным для периферических органов, но к ней, нейротоксическое. Для обеспечения правильного функционирования, большинство из "сосудистой ЦНС образует барьер эндотелиальных; гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует поток молекул и ионов, а также прохождение иммунных клеток между кровью и мозгом, тем самым поддерживая надлежащую гомеостаз 2, но также ограничивает проникновение лекарственных препаратов, тем самым, препятствуя лечения неврологических расстройств. 3 На клеточном уровне, то ВВВ в основном поддерживается обширными плотных контактов между эндотелиальными клетками, поляризованного экспрессии оттока транспортеров и с очень низкой скоростью трансцитоза 4. Свойства и функции ГЭБ, в основном индуцируется пеighboring клетки 4. В частности, перицитов играют важную роль в стимулирования и поддержания ГЭБ 5,6. Будучи сократительных клеток, перициты также регулировать кровоток 7, как это делают клетки гладких мышц, окружающие крупные сосуды. Наконец, астроциты, основные глиальные клетки головного мозга, передавать большие процессы с именем endfeet вокруг большей части головного мозга сосудистой 8 и модулировать целостность ВВВ и иммунной состояние покоя 9, передачу метаболитов к нейронам 10, и индуцируют жесткую связь между нейронной активности и кровоток 11,12.
Возможность изучать молекулярные и клеточные свойства цереброваскулярной системы имеет решающее значение для характеристики лучше свой вклад в физиологии мозга и патофизиологии. Для решения этого вопроса, стратегии изолировать цереброваскулярные системы мозга были разработаны, которые позволяют для подготовки неповрежденных фрагментов мозга сосудов. Церебральный судно рurification изначально описывается с помощью крупного рогатого мозги 13 и улучшены и адаптированы к другим видам, в частности грызунов 14. В этом последнем исследовании, была введена использование фильтров разных размеров, чтобы отделить сосуды головного мозга, чтобы фракции, обогащенные в сосудах разного диаметра. Интересно, что в таких препаратах, эндотелиальные клетки сохранили свои метаболические свойства 15, функциональность транспортер 16 и поляризационные 17. Здесь мы подробно этот протокол и далее показывают, что изолированные сосуды сохраняют большинство своих наблюдений в точке структур. Эндотелиальные клетки остаются связаны плотных контактов и окружен непрерывной базальной мембраны. Перициты и гладкомышечные клетки остаются прикрепленными к эндотелиальный слой, а также периваскулярными астроцитов мембран. Тем не менее, астроциты, клетки микроглии, нейроны и олигодендроциты устранены. Наконец, мы описываем процедуру выполнять иммуноокрашивания на изолированных сосудов головного мозга. До сих пор большинство из молекулярных и клеточных исследований, касающихся цереброваскулярные системы не были выполнены на очищенных клеток головного мозга судов диссоциированных по мобильному сортировки с использованием конкретных штаммов репортер клеток мыши или процедуры Иммуноокрашивание основе 18,19. Хотя эти методы позволяют для выделения почти чистых популяций клеток цереброваскулярных, изолированные клетки полностью теряют на месте морфологию и взаимодействий, которые, в свою очередь, в значительной степени влияет на их молекулярные и клеточные свойства. Протокол, описанный здесь позволяет для выделения целых цереброваскулярных фрагментов без необходимости специфических антител или трансгенных мышей пятен, предлагает хорошую альтернативу в качестве общей структуры изолированных сосудов головного мозга сохраняется, таким образом, уменьшая воздействие на их молекулярных свойств. Изолированные сосуды затем могут быть использованы для изучения активности генов, синтез белка и регулирования в BBB качестве недавно описал 20,21 22,23 Настоящий Протокол является недорогой, легко выполнять и быстро адаптируется к любому лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Решения и материалы
- Готовят растворы выделение сосудов: В1, добавить 1,5 мл 1М HEPES 150 мл HBSS; В2, добавить 3,6 г декстрана 20 мл B1; В3, добавляют 1 г БСА на 100 мл B1.
- Измените держатель фильтра путем разрезания дна от верхней части завинчивания.
- Подготовка Иммуноокрашивание решения: Фиксация решения, 4% параформальдегида в PBS рН 7,4; Пермеабилизирующего / блокирующий раствор, развести козьей сыворотки до 5%, а Тритон X100 до 0,25% в PBS рН 7,4.
Примечание: Фиксация зависит от типа используемого первичными антителами.
2. Препарирование
Примечание: стерильных условиях не требуется, если сосуды не используются для целей клеточной культуры.
- Приготовьте стакан емкостью 150 мл с 20 мл B1. Держите на льду и накрыть парафильмом, чтобы избежать загрязнения воздуха.
- Глубоко анестезию мыши под капотом с небольшим бумажным полотенцем, смоченным в 1 мл чистого Isoflurane, добавляемая IntО клетку. Анестезия проверяется отсутствие реакции на носок щепотку. Убейте мышь путем смещения шейных позвонков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги осуществляются в соответствии с национальными и институциональных норм. - Дополнительно: Выполнение внутрисердечной перфузии 20 мл PBS 1X, чтобы исключить содержание в крови 24.
- Раздел кожа со скальпелем от шеи к носу и вытащить его. Удалить все загрязняющие волосы с PBS 1x.
- Чтобы открыть череп, сначала вставить ножницы вперед к обонятельной луковицы и открыть ножницы для разрушения черепа на две части.
- Осторожно снимите мозга с помощью шпателя мозга. Рассеките из сосудистое сплетение из боковых желудочков, как они будут загрязнять подготовку кровеносного сосуда 38.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: заключительная подготовка будет содержать паренхимы и мозговых оболочек сосудов. Если не требуется, мозговых оболочек может быть снята в соответствии с процедурой, описанной на 38. - Трansfer мозг в химический стакан, содержащий раствор B1 на льду. До 8 мозги можно лечить вместе.
3. Мозговая ткань Гомогенизация
- Использование двух скальпели, вручную и энергично бить мозг в B1 решения впоследствии получения небольшие кусочки приблизительно 2 мм.
- Однородный препарат с автоматизированной Dounce гомогенизатор, выполняя 20 ударов в 400 оборотов в минуту. Убедитесь, что стеклянная трубка поддерживается на льду и что верхняя часть douncer находится в растворе при перемещении вверх и вниз, таким образом, чтобы предотвратить образование воздушных карманов. Если несколько образцов готовятся, помыть douncer с ионизированной водой между каждым гомогенизации.
4. Очистка судно
- Передача гомогената в 50 мл пластиковую пробирку и перейти к центрифугированием при 2000 г в течение 10 мин при 4 ° С. Большой белый интерфейс (в основном миелина) образуют на верхней части осадка судна (красный, если не проводили перфузию).
- Удалите супернатант. Осадок судно и белый интерфейс остаются прикрепленными вместе. Добавьте 20 мл ледяной решения В2 и встряхнуть пробирку вручную и энергично в течение 1 мин.
- Перейти ко второму центрифугированием при 4400 г в течение 15 мин при 4 ° С. Миелиновая теперь образуют плотный белый слой на поверхности надосадочной жидкости.
- Осторожно снимите миелина слой от стенок трубки, удерживая трубку и медленно вращая его, чтобы супернатант пройти вдоль стен. Отменить миелин с надосадочной жидкостью. Осадок, содержащий сосуды остается прикрепленной в нижней части трубки.
- Пятно внутри стенки трубы с впитывающей бумагой, обернутой вокруг 5 мл пластиковую пипетку и удалить все остатки жидкости, не касаясь осадок судна. Держите трубку в перевернутом положении на фильтровальную бумагу, чтобы слить оставшуюся жидкость.
- Приостановить осадок в 1 мл ледяной решения B3 с помощью пипетки вверх и вниз с низким связывания советы, keepiнг трубку на льду, а затем добавить еще 5 мл раствора В3. Убедитесь, что сосуды распределены как можно больше и не образуют агрегаты.
5. Фильтрация
- Приготовьте стакан на льду 30 мл охлажденного льдом раствора В3. Накрыть парафильмом, чтобы избежать загрязнения воздуха.
- Поместите мкм сетчатый фильтр на модифицированном держателе фильтра 20 на верхней части колбы Becker и уравновешивают путем применения 10 мл охлажденного льдом раствора В3.
- Налейте подготовку сосуда на фильтре и промыть сосуды с 40 мл охлажденного на льду раствора В3.
- Восстановление фильтр с помощью щипцов чистые и немедленно погрузить его в стакан, содержащий раствор B3. Снять сосуды из фильтра путем встряхивания мягко.
- Налейте содержание стакан в 50 мл пластиковую пробирку и центрифугируют при 2000 г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Примечание: В качестве альтернативы, подвеска сосудов головного мозга ", начиная с шага 4.6 можно фильтровать на мкм сетчатый фильтр 100.В этом случае более крупные суда преимущественно удерживается на фильтре, а проточный содержит микрососудов (в основном капилляров), которые затем фильтровали на фильтре 20 мкм меш, как описано выше.
- Ресуспендируют гранул микрососудов в 1 мл охлажденного льдом раствора В3 и передать его с помощью пипетки его в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Центрифуга при 2000 г в течение 5 мин при 4 ° С.
6. Фиксация, пермеабилизирующего и блокировка
- Передача судов по пипетки в 0,2 мл ПЦР пробирки, содержащие PBS, используя 1,0 мл низкой связывания наконечник. Будьте осторожны, не касаясь суда, поскольку они могут придерживаться внешней части наконечника. Выполните все следующие шаги под бинокулярным микроскопом.
- Для каждого из следующих средних изменений, оставить пробирки на лед, пока сосуды не достигли дна, и пипетки из большинства жидкостей с помощью длинных и вещь гель-погрузочные советы пипетки.
- Удалить большую часть PBS и добавляют 200 мкл раствора фиксирующего.Приостановка сосуды при встряхивании мягко и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Внесите из фиксатора решение и заменить его с 200 мкл 1x PBS (первой стирки), инкубировать 5 мин при комнатной температуре и повторите этот шаг 3 раза. Каждый раз, убедитесь, что судно правильно опустились на дно пробирки и пипетки вне 1x PBS, обеспечивая сосуды не коснулся.
- После последней промывки, замены 1X PBS в пермеабилизации / блокирующего раствора и инкубируют 1 час при комнатной температуре, ресуспендирования сосуды при встряхивании осторожно, время от времени.
7. Иммуноокрашивание
- Замените пермеабилизирующего / блокирующий раствор с соединением первичных антител (см ссылки антител, используемых здесь и разведения в материалах шаблона таблицы) разбавленных в пермеабилизации / блокировки решения, и инкубировать при температуре 4 ° CO / N.
- После 3 промывок PBS в при комнатной температуре, инкубировать сосуды с соединением вторичных антител, разведенного в PBS в течение 2 часовпри комнатной температуре.
- Примечание: мы настоятельно рекомендуем выполнять ядерное окрашивание с Hoechst (1: 2000) или DAPI (1: 2000) для того, чтобы отличить сосуды от загрязняющих возможно волоски или пыли под микроскопом.
- После 3 промывок PBS в, ресуспендируют сосуды в 50 мкл PBS.
8. Монтаж и наблюдение
- Подготовьте наконечник с силиконом стеклянного капилляра: вырезать наконечник пипетки P200 с помощью скальпеля и отрегулируйте капилляр внутри. Примерный объем капилляра 40 мкл.
- Передача судам стекле с помощью силицированного стеклянный капилляр и тщательно удалить жидкость с куском фильтровальной бумаги.
- Нанесите каплю на монтажной среды на судах и провести покровное на 45º, позволяя падение распространяться по краю скольжения. Пусть уходят покровное и позволит среднего распространяться медленно. Пусть это сухой O / N в РТ с защитой от света. Суда могут наблюдаться при fluorescЛОР конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы опишем протокол, позволяющий для механической изоляции сосудов головного мозга 14. Рисунок 1 суммирует основные этапы этого метода. Архитектура сосудов головного мозга является сложным и включает в себя несколько типов клеток, т.е., эндотелиальные клетки, запечатанные плотных контактов, в окружении перицитами, гладкомышечных клеток и астроцитов ноги процессов 9. Таким образом, после выделения сосудов головного мозга, мы стремились охарактеризовать структуру очищенных сосудов иммунным окрашиванием, как описано во второй части нашей протокола. Агрин, компонент эндотелиальной базальной пластинки непрерывно и однородно помечены на поверхности эндотелиальных (фиг.2А). Зона occludens-1 (ZO-1), один из компонентов эндотелиальных плотных контактов была иммунологически без видимой разрыва, предполагая, что эндотелиальные плотные соединения были сохранены (Фигура 2В). Охват перицитов эндотелия, этикеткаред NG2, появились почти непрерывным, как описано ранее 25 (рис 2С). Наконец, гладкая мышца маркировка актина показали наличие плотной гладкой слоя мышечных клеток на поверхности крупных очищенных судов (рис 2D). Эти результаты показали, что в целом на месте структуры мозга сосуда сохранялась в изолированных фрагментов сосудов.
Астроциты были показаны отправлять большие процессы, или '' endfeet к поверхности сосудов, обшивка почти полностью цереброваскулярные системы 8. Их тесное взаимодействие с судами и их роль в сохранении и регулирующих различные функции цереброваскулярных, обозначив их как важнейшей части сосудисто-нервного блока 9. Мы проанализировали дальше сосудистой покрытие астроцитов в изолированных сосудов головного мозга. Immunolabelling из астроцитов GFAP промежуточной нити, как правило, присутствует на всей астроцитов (3А), ваS только частично присутствует на очищенных сосудов, показывающих несколько коротких волокон на поверхности эндотелиальных (3В-C). В противоположность этому, коннексина 43, разрыв соединения белок сильно обогащены периваскулярными астроглиальные мембран 26, высоко обнаружен на поверхности очищенных крупных сосудов (рис 3D) и капилляров (рис 3e). Точно так же, immunolabelling из аквапорин-4 (AQP4), член семьи водного канала значительно выражена на уровне астроцитов мембран, стоящих перед судами 27, 26, с изложением стены изолированных сосудов (рис 3F-G). Несмотря на то, астроциты были не сотрудничать очищают сосуды, их периваскулярные endfeet мембраны при механическом порядке выделения мозга судна остались прилагается.
Наконец, мы рассмотрели возможные загрязнения наших препаратов другими нейронных типов клеток. Immunolabelling нейронных промежуточных филаментов (МСЧ) (Hornunг др, 1999) показал наличие нескольких оставшихся волокон, прикрепленных к сосудам, что указывает на возможное взаимодействие очистку нескольких нейронных терминалов (4А-В). Микроглия, помечены Iba1 (фиг.4С-D) и олигодендроциты, помеченного OLIG2 (рис 4E-F) не были обнаружены в изолированных сосудов. Таким образом, нейроны, микроглии и олигодендроциты не были совместно очищают сосуды головного мозга.
Вместе эти результаты показывают, что описанные протокол позволяет производить очистку структурно сохраненных фрагментов мозг сосудов, на которых периваскулярные астроцитарные мембраны остаются прикрепленными.
Рисунок 1. Основная схема протокол очистки мозга судна. Основными шаги представлены. Этот эскиз показывает три возможных фракции сосудов, которые могут быть получены в зависимости от фи фильтры, используемые (20 или 100 мкм меш). S1: микрососудов и крупные сосуды, S2: крупные сосуды и S3:. Микрососудов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изолированные Суда сохранить большинство своих В Ситу структуры. Конфокальной прогнозы образ иммуноокрашиванию сосудов головного мозга изолированные мыши. (А) базальной мембраны immunolabelled для агрина (красный). (B) эндотелиальных клеток плотные соединения immunolabelled блокатора малой зоны (ZO-1 ) (красный). (C) Перициты immunolabelled для NG2 (красный). (D) гладкомышечных клетках immunolabelled актина гладких мышц (SMA) (красный). Ядра окрашиваются Hoechst (синий).ПГ "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. астроцитов Endfeet Мембраны остаются прикрепленными к очищенной судов. Конфокальной прогнозы изображения. (А) Изображение разделе мозга, показывая корковой судно иммуноокрашиванию эндотелия РЕСАМ (белый), астроцитов GFAP (красный) и коннексина 43 (Сх43) (зеленый ). (В, С) GFAP immunolabelling (зеленый) на поверхности изолированного капилляра помеченного Isolectin b4 (белый) (B) или большого судна с надписью для гладких мышц актина (SMA) (красный) (C). (С) является Повторная печать с разрешением от 20 (D, E) Сх43 immunolabelling (зеленый) на поверхности изолированного капилляра помеченного Isolectin b4 (белый) (D) или большого судна с надписью на актин гладких мышц (SMA) (красный)
Рисунок 4:.. Нейроны, Микроглия и Олигодендроциты нет совместного очищают сосудов головного мозга конфокальной прогнозы изображения (A, B) нейрофиламентов (МСЧ) иммуноокрашивания на 20 мкм толщиной гиппокампа ломтик (красный) (A) и очищенных сосудов головного мозга ( Б). (С, В) микроглии Iba1 иммунное окрашивание на 20 мкм толщиной коркового срез (гред) (С) и очищенные сосуды мозга (D). (Е, F) олигодендроцитов Olig2 иммуноокрашивание на 20 мкм толщиной кортикальной среза (красный) (Е) и очищенные сосуды мозга (F). Ядра окрашиваются Hoechst (белый ), эндотелий от Isolectine b4 (IB4) (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Барьер гематоэнцефалический регулирует прохождение физиологических веществ в и из ЦНС и защищает его от потенциально вредных веществ, присутствующих в крови. Он участвует в нескольких патологий ЦНС, в том числе нейродегенеративных заболеваний 2 и опухолей головного мозга 28. Крайне низкая проницаемость ГЭБ затрудняет также прохождение терапевтических агентов, направленных нервные клетки и развитие методов, намеревающихся открыть обратимо ГЭБ без каких-либо пагубные последствия для мозга является очень активным поле исследований 3. Много усилий было сделано для разработки ценные модели и методы, позволяющие клеточные, молекулярные и фармакологические исследования ГЭБ и, в частности, протоколы для выделения сосуды из мозга грызунов. Первые попытки просто собраны микрососудов из механически диссоциированы мозговой ткани, используя переменные пор размера сетки, чтобы отменить загрязнения мозг паренхимы клетки 13, 29, 30, 31. Центрифугирование в градиенте плотности впоследствии введены связаны с фильтрацией сосудов головного мозга на нейлоновых сеток или стеклянными шариками столбцов 32, 33, 15. В этих процедур, стеклянных шариков по сравнению с фильтрацией нейлон сетки оказались для повышения урожайности и высокого по сравнению с низкоскоростным центрифугированием, чистоты микрососудов, хотя высокоскоростной центрифугирование вызывает также напряжение сдвига, которая влияет на экспрессию гена 15, 32. Дополнительный этап ферментативного расщепления также была введена в некоторых протоколах после диссоциации этапе 34 с целью отсоединения прилипшие нейронов и астроцитов, чтобы увеличить чистоту микрососудов 35. Однако избыточное предварительно пищеварение может нарушить целостность и микрокапиллярной 36, 37. Совсем недавно, иммуно-лазера захвата микродиссекции (иммуно-LCM), как было показано, чтобы позволить извлечение сосудов или даже отдельных клеточных популяций VesseLs, чтобы исследовать изменения в экспрессии генов BBB, хотя количество материала, полученного с помощью этого метода очень ограничена 23.
Здесь мы представляем процедуру механической изоляции сосудов головного мозга изначально разработанной Юсиф др 14. Это дает возможность получить чистый сосуды головного мозга, и, чтобы отделить их в соответствии с их диаметром. Этот протокол не претендует, чтобы позволить очистку всей мозг сосудистой отсеке, и мы не сравнивать его эффективность с предыдущими опубликованных протоколов. Тем не менее, отсутствие градиента, определенных столбцов и высокоскоростных стадиях центрифугирования составляет в целом процедура очень легко и недорого. Важно отметить, что мы настоятельно рекомендуем удалить сосудистое сплетение, как описано на 38, прежде чем гомогенизации мозга, как мы испытали его в качестве возможного источника загрязнения. Другие важные рекомендации: 1) использование "низкой" связывания пластиковой оболочкиIAL (в частности наконечники пипеток), так как сосуды придерживаться естественно необработанных пластмасс. Опуская эту точку приведет к потере большинства судов; 2) тщательный равновесия нейлоновых фильтров перед фильтрацией (шаг 5.2); 3) ресуспендирования осадка в таком большом количестве, как это возможно буфер перед фильтрацией для повышения чистоты образца; 3) При необходимости, клетки крови и белки, захваченные в очищенных сосудов может быть вымываются внутрисердечной перфузии PBS до рассечения мозга; 4) Выход очищенного сосудов может быть улучшена путем повторения отделение от миелина в декстрана два или три раза (шаг 4,2) 39,40. Для иммуноокрашивания, мы настоятельно рекомендуем: 1) для выполнения ядерных маркировку для того, чтобы отличить сосуды от загрязнения волосы и пыли, для которых антитела большой неспецифической сродство; 2) чтобы избежать сбора сосуды центрифугированием перед каждым изменением среднего, как это может привести к образованию неразрывной шар материала.
Очистка неповрежденных сосудов головного мозга представляют большие преимущества для изучения молекулярных характеристик BBB. Хотя конкретные или обогащенные эндотелиальные и перицитов гены и пути были определены транскриптомных и протеомическим исследований по отдельным типам клеток 18,19, хорошо известно, что диссоциации и сортировка клеток методы привести к потере клеточной полярности и морфологии, а также взаимосвязи между типы клеток, которые сильно влияют на их молекулярные профили. В этом контексте, сохраняя всю сосудистую отсек нетронутыми, как описано здесь, за исключением астроцитов, может представлять собой большое преимущество. Кроме того, по сравнению с сортировки клеток, очистка сосудов головного мозга, не требует использования специальных штаммов трансгенного репортер мыши или длительных процедур иммуноокрашивания основе. Еще одно преимущество использования сосудов головного мозга является возможность адаптации протокола очистки для других видов, как уже было показано на murine14, Bovine13 а также в людях 41,42. Наконец, дальнейшее развитие данного метода будет культура в пробирке мозговых сосудов фрагментов. Совместное культивирование очищенных судов с первичных нейронах астроцитов и клеток микроглии может помочь собрать нервно-сосудистого устройство в точный способ, чем сложные 3-мерные многоклеточных систем культивирования, где клетки сначала выделить и очистить до того собраны таким образом, 43. очистку интактного сосудов головного мозга может быть большим подспорьем для развития любого вида анализов в пробирке для изучения ГЭБ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Labex MemoLife и по ARSEP (Фонд Pour l'помощник а-ля Recherche сюр-ла-уплотнять ан бляшек)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M.
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M.
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M.
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S.
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
