Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Published: November 10, 2015 doi: 10.3791/53208
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 1,2,3
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

Abstract

Beyinde, vasküler sistemin en seçici bir bariyer oluşur, beyin ve kan arasındaki moleküller ve bağışıklık hücrelerinin değişimini düzenleyen kan-beyin bariyeri (BBB). Dahası, büyük nöronal metabolik talep kan akışının bir an-an düzenlenmesini gerektirir. Özellikle, bu düzenlemelerin anormallikler çoğu beyin patolojileri etyolojik özellikleridir; beyin tümörleri, hem de örneğin, multipl skleroz, menenjit ve sepsisi uyaran beyin bozuklukları gibi enflamatuar durumlar: glioblastom, inme, ödem, epilepsi, dejeneratif hastalıklar (Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ex) da dahil olmak üzere. Böylece, serebrovasküler fizyolojisini modüle sinyal olaylarını anlamak önemli bir sorundur. Serebrovasküler sistemini oluşturan çeşitli hücre tiplerinin hücresel ve moleküler özellikleri içine çok içgörü taze ayrışmış beyin dokusundan sıralama primer kültür veya hücreden elde edilebilir. Bununla birlikte,Böyle hücre polarite, morfolojisi ve hücreler arası ilişkiler gibi özellikler bu tür hazırlıklar muhafaza edilmez. Biz burada açıklamak protokol yapısal bütünlüğünü korurken, beyin damar parçaları arındırmak için tasarlanmıştır. Biz izole damarlar sürekli bazal lamina ile çevrilidir sıkı kavşaklar tarafından mühürlenmiş endotel hücreleri ibaret olduğunu göstermektedir. Perisitler, yumuşak kas hücrelerinin yanısıra perivasküler astrosit endfeet membranlar endotel tabakasının bağlı kalır. Son olarak, biz arıtılmış beyin damarları üzerinde immün deneyler gerçekleştirmek için nasıl açıklar.

Introduction

Merkezi sinir sistemi (MSS) Uygun işlevi son derece düzenlenir dışı ortam gerektirir ve metabolik talepler diğer organlara 1 ile karşılaştırıldığında çok büyük. CNS ayrıca genel olarak periferal organlara zararsız fakat buna, nörotoksik kimyasal geniş bir yelpazede, son derece duyarlıdır. Doğru çalışmasını sağlamak için, MSS 'damar çoğu endotel bariyer oluşturur; Moleküllerin ve iyonların akışını yanı sıra kan ve beyin arasındaki bağışıklık hücrelerinin geçişini kontrol eden kan-beyin bariyeri (KBB), böylece engellemekle tedavileri, böylece doğru homeostasisi 2 koruyarak, aynı zamanda tedavi edici ilaçların girişini sınırlayan nörolojik bozukluklar 3. Hücresel düzeyde, BBB ağırlıklı endotel hücreleri, akış taşıyıcıların polarize ifade ve çok düşük transsitoz oranı 4 arasında kapsamlı sıkı kavşaklar tarafından sürdürülür. Özellikleri ve BBB fonksiyonları çoğunlukla KD tarafından uyarılmaktadırighboring hücreler 4. Özellikle, perisitler BBB 5,6 uyarma ve muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Büyük damarları çevreleyen düz kas hücreleri gibi kasılma hücreleri olmak, perisitler da kan akışını 7 düzenler. Son olarak, astrositler, beynin başlıca glial hücreler, endfeet etrafında adlı büyük süreçlerini göndermek beynin damarsal 8 en BBB bütünlüğü ve bağışıklık sessizliğini 9, nöronlar 10 metabolitlerinin transferini modüle ve nöronal aktivitenin arasındaki sıkı bağlantı neden ve kan akışı 11,12.

Serebrovasküler sistemin moleküler ve hücresel özelliklerini incelemek için yeteneği beyin fizyolojisi ve fizyopatolojisi olan katkısını daha iyi karakterize etmek çok önemlidir. Bu soruyu çözmek için, beynin serebrovasküler sistemini izole etmek için stratejiler bozulmamış beyin damar parçalarının hazırlanması için izin veren, geliştirilmiştir. Serebral damar purification başlangıçta özellikle kemirgenler 14, diğer türlere sığır beyinleri 13 kullanılarak tarif ve geliştirilmiş ve uyarlanmıştır. Bu son çalışmada, değişen büyüklükte filtrelerin kullanılması farklı çaplarda damar zenginleştirilmiş kesirler beyin damarları ayırmak için kullanılmaya başlandı. İlginçtir ki, bu terkiplerde, endotelyal hücreler metabolik özellikleri 15, taşıyıcı işlevi 16 ve polarizasyon 17 tutulur. Burada, ayrıntılı olarak protokol açıklar ve ayrıca izole damarlar in situ yapılarda geçen ay, en çok muhafaza ettiğini göstermektedir. Endotel hücreleri sıkı kavşaklar ile bağlantılı ve sürekli bazal lamina ile çevrilidir kalır. Perisitler ve yumuşak kas hücrelerinin endotel tabaka, hem de perivasküler astrosit membranlara bağlı kalır. Ancak, astrositler, mikroglial hücreler, nöronlar ve oligodendrosit ortadan kalkar. Son olarak, biz izole beyin damarları üzerinde immün gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Şimdiye kadar serebrovasküler sistemine ilişkin moleküler ve hücresel çalışmalar çoğu tarafından ayrışmış saflaştınldı, beyin damarı hücrelerinde üzerinde gerçekleştirilmiştir hücre sıralama hücre spesifik raportör fare soyu veya immüno-bazlı prosedürler 18,19 kullanılmıştır. Bu teknikler neredeyse saf serebrovasküler hücre popülasyonlarının izolasyonu için izin verse, izole hücreler tamamen sırayla, büyük ölçüde moleküler ve hücresel özelliklerini etkiler onların yerinde morfolojisi ve etkileşimleri, kaybedersiniz. Protokol, spesifik antikorlar veya transjenik fare lekeleri gerek kalmadan, tüm serebrovasküler fragmanlarının izolasyonu sağlayan, burada açıklanan, moleküler özellikleri üzerinde yansımaları azaltılması ve böylece, muhafaza edilir izole serebral damar genel yapı olarak iyi bir alternatif sunmaktadır. Son zamanlarda tarif edildiği gibi izole edilmiş 20,21 damarları daha sonra BBB gen aktivitesi, protein sentezi ve düzenleme incelemek için kullanılabilecek 22,23 oranla mevcut protokol, ucuz gerçekleştirmek kolay ve herhangi bir laboratuvara hızla uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Çözüm ve Malzeme

  1. Izolasyon kabı çözümleri hazırlayın: B1, HBSS 150 ml HEPES 1 M, 1.5 ml ekleyin; B2, 20 B1 ml dekstran 3,6 g ekleyin; B3, B1, 100 ml BSA 1 g ekleyin.
  2. Üst vidalama kısmı kapalı altını keserek filtre yuvasını değiştirin.
  3. Immüno-çözümleri hazırlayın: sabitleme çözeltisi, PBS pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit; Permeabilization / bloke etme çözeltisi,% 5 keçi serumu sulandırarak PBS pH 7.4 içinde% 0.25 Triton X100 ile.
    Not: Sabitleme kullanılan birincil antikor tipine bağlıdır.

2. Diseksiyon

Not: gemiler hücre kültürü amacıyla kullanılır sürece Steril koşullar gerekli değildir.

  1. B1, 20 ml bir 150 ml'lik beher hazırlayın. Buz üzerinde tutun ve hava kirliliğini önlemek için parafilm ile kaplayın.
  2. Derinden int eklenir saf İsofluranın 1 ml batırılmış küçük bir kağıt havlu ile bir başlık altında fare uyutmakKafesi o. Anestezi bir ayak tutam tepki eksikliği tarafından doğrulanmadı. Servikal dislokasyon ile fareyi öldürmek.
    Not: Bu adımlar, ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilir.
  3. İsteğe bağlı: Kan içeriği 24 ortadan kaldırmak için, PBS 1x 20 ml intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
  4. Bölüm burun boyun bir neşter ile cilt ve uzak çekin. PBS 1x tüm kirletici tüyleri temizleyin.
  5. Kafatası açmak için, öncelikle koku ampul öne makas yerleştirin ve iki bölümden kafatası yırtılması için makas açın.
  6. Dikkatle beyin spatula ile beyin kaldırmak. Onlar kan damarı hazırlık 38 kontamine gibi lateral ventriküllerin koroid pleksus parçalara ayır.
    NOT: İsteğe bağlı: son hazırlık parankimal ve meninks damarları içerecektir. İstenen değilse, beyin zarları 38 tarafından tarif edilen prosedür takip soyulabilir olabilir.
  7. TrBuz üzerinde B1 çözeltisi içeren beher içine beyin ansfer. 8 adede kadar beyinleri bir araya tedavi edilebilir.

3. Beyin Dokusu Homojenizasyon

  1. İki neşter kullanarak elle ve şiddetle ardından yaklaşık 2 mm küçük parçalar elde B1 çözeltisi içinde beyin yendi.
  2. 400 rpm'de 20 vuruş gerçekleştiren, bir otomatize Dounce homojenleştirici ile hazırlık homojenize. Cam tüp buz ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, yukarı ve aşağı hareket olduğunda douncer üst kısmı çözelti içinde olduğu muhafaza emin olun. Birkaç örnekler hazırlanır, her homojenizasyon ile iyonize su ile douncer yıkayın.

4. Gemi saflaştırma

  1. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2000 g'da santrifüj bir 50 ml plastik tüp içine Homojenat aktarın ve devam edin. Hiçbir perfüzyon yapıldı eğer bir büyük beyaz bir arayüz (çoğunlukla miyelin) damar pellet (kırmızı üstünde oluşturacak).
  2. Süpernatantı atın. Damar pelet ve beyaz arayüz birlikte takılı kalacaktır. Buz soğukluğunda B2 çözeltisi 20 ml ilave edilir ve 1 dakika boyunca elle ve kuvvetlice tüp sallayın.
  3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4400 g'de ikinci bir santrifüj işleminden geçin. Miyelin artık süpernatan yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacak.
  4. Dikkatle tüpü tutarak ve yavaşça süpernatant duvarları boyunca geçmesine izin çevirerek tüp duvarlarından miyelin tabakası ayırın. Süpernatant ile miyelini atın. Damarları ihtiva eden topak tüpün altındaki bağlı kalır.
  5. 5 ml'lik plastik pipet etrafına sarılmış bir emici kağıt ile tüpün iç duvarını kurulayın ve kalan tüm sıvılar kaldırmak, damar pelet dokunmaktan kaçının. Kalan sıvıyı boşaltmak için emici kağıt üzerinde tüp ters tutun.
  6. Düşük bağlayıcı uçları, hesabı ve hesap ile pipetleme aşağı buz soğukluğunda B3 çözeltisi 1 ml pelet Askıdabuz tüpü ng sonra B3 çözeltisi başka bir 5 ml ekleyin. Gemiler mümkün olduğu kadar disperse edilir ve agregatları oluşturmaz emin olun.

5. Filtrasyon

  1. Buz soğukluğunda B3 çözeltisi 30 ml buz üzerinde bir beher hazırlayın. Hava kirlenmesini önlemek için parafilm ile kaplayın.
  2. Bir Becker şişenin üstüne bir tadil edilmiş filtre tutucusu üzerinde 20 mikron gözenekli bir filtre yerleştirin ve buz soğukluğunda B3 çözeltisi 10 ml uygulayarak denge.
  3. Filtre üzerinde damar hazırlanmasını dökün ve buz soğukluğunda B3 çözeltisi 40 ml damarları yıkayın.
  4. Temiz forseps kullanarak filtreyi kurtarma ve hemen B3 solüsyon içeren beher içinde bırakın. Hafifçe sallayarak filtreden gemileri ayırın.
  5. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 2000 g'de 50 ml plastik tüp ve santrifüj kabı içeriği dökün.
  6. Not: Alternatif olarak, aşama 4,6 beyin gemilerinin süspansiyon 100 mikron mesh filtre üzerine filtre edilebilir.Akış daha sonra, yukarıdaki gibi bir 20 um-gözenekli filtre üzerinde filtre edilmektedir mikrodamarlar (özellikle kılcal damarlar), içerir ise, bu durumda, daha büyük bir gemi, tercihen filtre üzerinde tutulur.
  7. Buz soğukluğunda B3 çözeltisi 1 ml mikrodamarlar pelet yeniden süspanse edin ve 1.5 ml Eppendorf tüp içine pipetleme aktarın. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 2000 g'de santrifüjleyin.

6. Sabitleme, Permeabilization ve Engelleme

  1. 1.0 ml düşük bağlanma ucunu kullanarak PBS içeren 0.2 ml PCR tüpleri içine pipetleme Transferi gemiler. Onlar ucu dış kısmına bağlı olabilir damarları dokunmadan dikkatli olun. Binoküler mikroskop altında aşağıdaki adımları uygulayın.
  2. Aşağıdaki orta değişikliklerin her biri için, gemiler dibe ulaşana kadar buz üzerinde tüpler bırakın ve uzun ve bir şey jel yükleme pipet ipuçlarını kullanarak sıvıların çoğu pipetle.
  3. PBS en çıkarın ve tespit edici çözeltisi 200 ul ilave edin.Sallanarak damarları askıya alma ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
  4. Sabitleştirici çözüm pipet ve 1x PBS (ilk yıkama) 200 ul ile değiştirin, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ve bu adımı 3 kez tekrarlayın. Her zaman, gemiler doğru gemiler dokunulmaz değil sağlanması, 1x PBS üzerinden boru ve pipet dibine battı doğrulayın.
  5. Son yıkamadan sonra, zaman zaman hafifçe sallayarak damarları resuspending, permeabilizasyon / bloke çözümü ile 1x PBS yerine ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.

7. immün

  1. Permeabilizasyon / engelleme çözümü seyreltilmiş primer antikorlar (Malzeme şablon tablo burada ve seyreltiler kullanılan antikorların referanslara bakın) karışımı ile permeabilization / engelleme çözümü değiştirin ve 4 ° CO / N inkübe.
  2. Oda sıcaklığında PBS içinde 3 yıkamadan sonra, 2 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor karışımı ile gemiler inkübeoda sıcaklığında karıştırıldı.
  3. Not: Mikroskop altında tüyleri veya tozları kontamine mümkün gelen gemiler ayırt etmek için: (2000 1) veya DAPI: biz şiddetle Hoechst (2000 1) nükleer boyama yapmanızı tavsiye ederiz.
  4. PBS içinde 3 yıkamadan sonra, PBS'de 50 ul damarları tekrar süspansiyon.

8. Montaj ve Gözlem

  1. Bir silikonlu cam kapiller ile bir ipucu hazırlayın: Bir neşter kullanılarak bir P200 pipet kesip içindeki kılcal ayarlayın. Kılcal yaklaşık hacmi 40 ul olduğunu.
  2. Silikonize cam kılcal kullanarak bir bardak slayt damarları aktarın ve dikkatle emici bir kağıt parçası ile sıvı çıkarın.
  3. Gemiler üzerine montaj orta tek bir damla uygulayın ve açılan kayma kenarında yaymak için izin 45º bir lamel tutun. Lamel kapalı gidelim ve orta yavaş yavaş yayılmaya izin verir. Kuru O / N oda sıcaklığında ışıktan korunarak olsun. Kaplar, bir fluoresc altında görülebilirent konfokal mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, biz. Beyin damarlarında 14 mekanik izolasyonu sağlayan bir protokol açıklar 1 Bu tekniğin temel adımları özetlemektedir Şekil. Beyin damarlarının mimarisidir karmaşıktır ve çeşitli hücre tipleri içerir yani, endotelyal hücreler sıkı bırleşme ile kapatılır, perisit, yumuşak kas hücreleri ve astrosit ayak işlemlerinin 9 ile çevrilidir. Bu nedenle, beyin damar izole edildikten sonra, bizim protokolü ikinci bölümünde tarif edildiği gibi imüno-boyama ile saflaştırılmış damarlarının yapısını karakterize etmek için amaçlanmıştır. Agrin, endotel bazal katmanın bir parçası sürekli ve homojen olarak endotel yüzeyi (Şekil 2A) olarak etiketlenmiştir. Zona occludens-1 (ZO-1), endotelyal sıkı kavşaklar bileşenlerinden biri endotelyal sıkı kavşaklar (Şekil 2B) korundu düşündüren, hiçbir belirgin devamsızlık ile boyanmış edildi. Perisit endotel kapsamı, etiketDaha önce 25 (Şekil 2C) için açıklanan yöntemle NG2 tarafından ifa, neredeyse sürekli ortaya çıktı. Son olarak, yumuşak kas aktin markalama büyük saflaştırılmış damarları (Şekil 2D) yüzeylerinde yoğun bir yumuşak kas hücresi tabakası varlığını ortaya çıkarmıştır. Bu sonuçlar, in situ, beyin damar yapısının genel izole damar parçaları muhafaza edildiğini göstermiştir.

Astrositler neredeyse tamamen serebrovasküler sistem 8 gömleklenmesi, damarlarının yüzeyi büyük işlemleri ya da 'endfeet' göndermek için gösterilmiştir. Gemiler ile onların sıkı etkileşim ve bakımını ve çeşitli serebrovasküler fonksiyonları düzenleyen rolleri, nörovasküler biriminin 9 önemli bir parçası olarak belirlenmiş. Biz daha izole beyin damarlarının astrosit damar kapsama analiz. Normal olarak tüm astrosit GFAP, bu ara madde astrositik filamanın immüno (Şekil 3A), wasadece kısmen mevcut endotel yüzeyinde (Şekil 3B-C) bazı kısa liflerin gösteren saflaştırılmış damarları s. Bunun aksine, Konneksin 43, yüksek perivasküler astroglial membranlar 26 zenginleştirilmiş bir boşluk bağlantı proteini, yüksek oranda saf büyük gemiler (Şekil 3D) ve kılcal (Şekil 3E) yüzeyinde tespit edilmiştir. Benzer şekilde, Aquaporin-4 (AQP4) bir immüno, su kanalı ailesinin bir üyesi olan büyük ölçüde izole edilmiş bir damarları (Şekil 3F-G) duvarlarını özetleyen damarları 27, 26 karşı karşıya astrosit membran seviye açığa çıkar. Astrocytes gemileri ile birlikte saflaştırılmış değildi rağmen, perivasküler endfeet membranlar, beyin damar izolasyonu mekanik işlem sırasında takılı kaldı.

Son olarak, diğer nöral hücre tipleri tarafından eden preparasyonlar bulaşma olasılığını incelenmiştir. Nöronal ara fılamanların immüno (NFM) (Hornun, 1999) g ve arkadaşları, birkaç nöronal terminallerin muhtemel bir ko-saflaştırma (Şekil 4A-B) gösteren kaplara bağlanmış az kalan liflerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Olig2 (Şekil 4E-F) ile etiketlenmiş Iba1 (Şekil 4C-D) ve oligodendrosit, etiketli Mikroglia, izole damarlarda tespit edilmemiştir. Böylece nöronlar, mikroglia ve oligodendrositler beyin damarlarında ile birlikte saflaştırılmış değildi.

Birlikte, bu sonuçları açıklanan protokol perivasküler astrositik membranlar bağlı kalır bunun üzerine yapısal korunmuş beyin damar parçaları, saflaştırılması izin verdiğini göstermektedir.

figür 1
Beyin Damar Arıtma Protokolün Şekil 1. Özet Şeması. Başlıca adımlar sunulmaktadır. Bu kroki fi bağlı elde edilebilir üç olası damar kesirler gösterir kullanılan ltreleri (20 ya da 100 mikron gözenekli). S1: mikrodamarlar ve büyük gemiler, S2: Büyük gemiler ve S3:. Mikrodamarlar bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. İzole Gemiler Yerinde yapısındaki çoğu saklayın. Immunosteyn izole fare beyin damarlarının Konfokal görüntü projeksiyonları. (A) Agrin (kırmızı) için imüno Bazal lamina. (B) Endotel hücre sıkı kavşaklar zonula occludens (ZO-1 için imüno ) (kırmızı). (C) perisitler NG2 (kırmızı). (D) düz kas aktin (SMA) için imüno düz kas hücreleri (kırmızı) için imüno. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı.pg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Astrosit Endfeet Membranes Saf Damarlar bağlı kalır. Konfokal görüntü projeksiyonlar. (A) endotel PECAM (beyaz) için immunohistokimyasal bir kortikal gemi gösteren bir beyin bölümünde, astrositik GFAP (kırmızı) ve Konneksin 43 (Cx43) (yeşil görüntü ). Isolectin b4 (beyaz etiketli izole bir kılcal yüzeyinde (B, C) ​​GFAP immüno (yeşil)) (B) veya düz kas aktini (SMA) (kırmızı) (C) işaretli büyük geminin. (C) Isolectin b4 (beyaz) (D) ile işaretlenmiş izole bir kılcal yüzeyinde 20 (D, E) Cx43 immüno (yeşil) izni ile bir Re-print olduğunu ya da düz kas aktini (SMA) için etiketlenmiş büyük geminin (kırmızı) (F, G) Isolectin b4 (beyaz) (F) etiketli izole bir kılcal yüzeyinde Aquaporin 4 (AQP4) immüno (yeşil) ya da düz kas aktin (SMA) için etiketlenmiş büyük geminin (kırmızı) (G). Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:.. Nöronlar, Mikroglia ve Oligodentrositler Beyin Gemileri ile arıtılmış CO olan Konfokal görüntü projeksiyonları (A, B) nörofilaman (NFM) 20 mikron kalınlığında hipokampal dilim (kırmızı) (A) ve saflaştırılmış beyin damarlarında üzerinde immün ( B). (C, B), bir 20 um-kalınlıkta kortikal dilim Mikroglial Iba1 immün (red) (C) ve saflaştırılmış beyin damarlarında (D). (E, F), 20 mikron kalınlığında kortikal dilim (kırmızı üzerine Oligodendrosit olig2 immün) (E) ve saflaştırılmış beyin damarları (K). Çekirdekler Hoechst tarafından boyanır (beyaz ), Isolectine b4 (Ib4) (yeşil) ile endotel. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kan-beyin bariyeri CNS içinde ve dışında fizyolojik maddelerin geçişini düzenleyen ve kandaki mevcut potansiyel zararlı maddelere karşı korur. Bu nörodejeneratif hastalıkların 2 ve beyin tümörleri 28 de dahil olmak üzere, pek çok merkezi sinir sistemi patolojileri yer almaktadır. BBB son derece düşük geçirgenlik ayrıca nöral hücreleri ve beyin araştırmaları 3 çok aktif bir alandır için tersinir hiçbir zararlı sonuçları olan BBB açmak niyetinde yöntemlerinin geliştirilmesini hedefleyen terapötik ajanların geçişini engellemektedir. Birçok çaba kemirgen beyin damarlarını izole etmek için değerli modelleri ve BBB, hücresel, moleküler ve farmakolojik araştırmalar izin teknikleri ve özellikle, protokoller geliştirmek için yapılmıştır. İlk girişimler sadece beyin parankim hücreleri 13 kirlenmesine neden atmak için değişken gözenek boyutlu kafesleri kullanarak mekanik olarak ayrışmış beyin dokusundan mikrodamarlar toplanan, 29, 30, 31. Yoğunluk gradyanı santrifüjü, daha sonra sütun 32, 33, 15, naylon kafes ya da cam boncuklar üzerinde beyin damarlarında filtrasyona bağlı tanıtıldı. Bu prosedürlerde, naylon örgü süzülerek karşılık cam boncuk, yüksek hızlı santrifüjleme aynı zamanda gen ekspresyonu 15, 32 etki makaslama gerilimi indükler, ancak verimi artırmak ve düşük hızda santrifüjleme, mikrodamar saflık karşı yüksek olduğu ortaya çıktı. Enzimatik sindirim ek bir adım da mikrovasküler saflığını 35 artırmak için yapışık nöronlar ve astrositler ayırma amacıyla ayrılma aşaması 34 aşağıdaki bazı protokollerde tanıtıldı. Ancak, aşırı öncesi sindirim da microcapillary bütünlüğünü 36, 37 bozabilir. Daha yakın zamanda, immüno-lazer yakalama mikrodiseksiyon (immüno-LCM) kapların ya da vesse belirgin hücre popülasyonlarının erişim sağlamak için gösterilmişBu teknik ile elde edilen materyalin miktarı 23 çok sınırlı olsa da ls, BBB gen ekspresyonunda değişiklikler incelemek.

Burada, ilk Yousif ve arkadaşları tarafından hazırlanan 14 beyin damarlarının mekanik bir izolasyonu için bir işlem sunuyoruz. Bu olasılığı saf beyin damarları elde etmek ve onların çapına göre onları ayırmak için sunuyor. Bu protokol, tüm beyin damar bölmesinin saflaştırma izin taklit etmez, ve biz daha önce yayınlanmış protokoller ile etkinliğini karşılaştırmak yoktu. Ancak, eğimli, belirli bir sütun ve yüksek hızlı santrifüj adımları olmaması genel prosedürü çok kolay ve ucuz hale getirir. Beynin homojenizasyon önce 38 tarafından açıklandığı gibi biz kontaminasyon olası bir kaynak olarak deneyimli Önemlisi, şiddetle, koroid pleksusu kaldırmak için tavsiye ediyoruz. Diğer önemli tavsiyeler şunlardır: 1) "düşük bağlanma" plastik mater kullanımıial gemiler tedavi edilmeyen plastik doğal (özellikle pipet ipuçları) bağlı beri. En gemilerin kaybına neden olur, bu noktayı atlayarak; 2) filtrasyon öncesinde naylon filtreleri (adım 5.2) dikkatli dengeleme; 3) filtrasyon öncesi mümkün olduğu kadar tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon pelet numunenin saflığı artırmak için; 3) Gerekirse, kan hücreleri ve saflaştırılmış damarların içinde sıkışıp proteinler beyin diseksiyonu önce PBS ile intrakardiyak perfüzyon tarafından yıkanabilir; 4) saf damarların verimi dekstran iki ya da üç kez (aşama 4,2) 39,40 miyelin ayrılması tekrar iyileştirilebilir olabilir. Immün için, biz şiddetle tavsiye: 1) antikorlar harika non-spesifik afinite sahip olduğunuz tüyleri ve toz kontamine damarları ayırt etmek için bir nükleer etiketleme gerçekleştirmek için; 2) bu malzemenin ayrılmaz bir topa oluşumu ile sonuçlanabilir her bir ortam değişikliğinde santrfugasyon yoluyla toplama tanklarını önlemek için.

Bozulmamış beyin damarlarının saflaştırılması BBB moleküler özelliklerini incelemek için büyük avantajlar sunuyoruz. Belirli bir veya zenginleştirilmiş endotel ve perisit genleri ve yollar tek tek hücre tiplerinde 18,19 üzerine Transkriptomik ve proteomik çalışmalar ile tespit edilmiş olmasına rağmen, iyi ayrılma ve hücre ayırma teknikleri arasında ara bağlantı hem de hücre polarite, morfoloji kaybına yol bilinmektedir güçlü moleküler profillerini etkileyen hücre tipleri. Astrositler hariç olmak üzere, burada tarif edildiği gibi sağlam tüm vasküler bölmesi tutma Bu bağlamda, büyük bir avantaj temsil edebilir. Ayrıca, hücre sıralama ile karşılaştırıldığında, beyin damarlarının saflaştırma spesifik transgenik raportör fare suşlarının ya da uzun imüno dayalı yöntemlerin kullanımını gerektirmez. Beyin damarlarında kullanılmasının bir diğer avantajı zaten murine14 için gösterildiği gibi, diğer türlere arıtma protokolü adapte olasılığıdırİnsanlarda 41,42 yanı sıra bovine13. Son olarak, mevcut tekniğin bir başka gelişimi, beyin damarları parçalarının in vitro kültür olacaktır. Primer astrosit nöronlar ve mikroglial hücreleri ile saflaştırılmış damarların Co-kültür hücreleri ilk bozulmamış beyin damarlarında 43. Böylece saflaştırmayı yeniden birleştirilen önce izole edilir ve saflaştırılır kompleks 3 boyutlu çok-hücreli kültür sistemleri daha doğru bir şekilde nörovasküler birimini yeniden birleştirmek için yardımcı olabilir BBB çalışma, in vitro tahlillerin herhangi bir tür gelişimi için büyük yardım olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma LABEX MemoLife tarafından ve ARSEP tarafından desteklenmiştir (Fondation la recherche sur la sclérose tr plaklar à l'aide dökmek)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Tags

Neuroscience Sayı 105 serebrovasküler sistem kan-beyin bariyeri Gemi saflaştırma endotel hücreleri Astrosit endfeet perisitler düz kas hücreleri
Fare Beyin Gemiler saflaştırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boulay, A. C., Saubaméa, B.,… More

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter