Protocol
所有血液采集程序应当由授权和认证的专业人士来完成。使用人类受试者的研究涉及的机构审查委员会或其他有关机关批准。有关知情同意，保护参与者的身份特殊的预防措施，需要遵循。在这个协议中列出的所有实验涉及处理的人血和/或血液制品和适当的个人防护设备需要在任何时候都被磨损。废物应被视为生物危害和设置按规定的。
1.静脉穿刺
- 确定病人/参与者和确认与现有的记录。解释研究的细节，并得到了知情同意书。
- 有一个托盘设置为个别病人有标注在平整稳定的表面管。
- 解释程序，使患者座椅舒适与支撑臂。告知病人，他或SHË会觉得小捏，应保持不动整个过程。
- 附加针到适配器。
- 洗手和戴手套。
- 通过用70％的异丙醇从中心清洗同心圆向外制备肘窝静脉穿刺。允许站点风干30秒。
- 通过触诊确定适当的静脉。
- 在穿刺部位确保它是不是太紧张（同时仍感觉桡动脉）上述应用止血带3-4。
- 通过将针15-30度的斜角，以在皮肤上平滑的动作进行静脉穿刺。通过针推血液收集管，并收集9毫升全血。
- 取出止血带。从针移除管。
- 撤回针头并应用纱布平方在之前针移除穿刺部位。处置针以适当的生物危害的容器。
- 询问病人保持PRessure在穿刺部位。
- 标签管
- 检查穿刺部位，以确保出血已停止。
- 应用粘性绷带或磁带上的纱布方，询问患者的感觉好吗（无疼痛，肿胀或轻头晕）
- 感谢在出院前病人/参与者。
2，L-PRF准备
- 紧接着静脉采血的红色平顶玻璃干管，将其放置在离心机。
- 将适当的反平衡后离心400 XG在室温为12分钟。
- 取出管在周期的末端。注意三层：贫血小板血浆（PPP），富血小板纤维蛋白（L-PRF）和RBC基（ 图1）。
- 用吸管吸出PPP。使用镊子轻轻一拉L-PRF出来，并将其放置在一个无菌，冲孔网。
- 使用手术刀，刮去大部分RBC层精心留下的buffŸ上衣完好。
- 轻轻压缩的L PRF凝块（使用无菌金属板，近似的重量225克）30秒。贫血小板血浆将被挤掉。
- 取出板，轻轻抬起L-PRF膜。在L-PRF膜是准备在实验中使用的12。
3.单轴拉伸试验
- 在滤纸上以易于处理代替L- PRF膜（6）和冲压成“狗骨头”使用定做的金属模具（2.75毫米宽在其最窄处为7.5毫米的测量长度）。
- 测量每个样品的厚度在三个点并取平均值。
- 仔细地接合的L- PRF膜在单轴测试系统的颚夹具的中心。
- 小心撕文件管理器文件支持，以揭露L-PRF膜。
- 程序的仪器，以使可动头工作在一个恒定的速率（10.0毫米/分钟）和实验开始时为L-PRF仍然是湿的。
- 记录弹性模量，断裂能，和应变从伴随单轴试验系统中的软件中断。这些值被自动计算并没有用户定义输入是必需的。请参见图3。
4.缝合保留实力
- 在滤纸上以易于处理代替L- PRF膜（N = 3）并切成使用外科手术刀矩形样品进行测定（10毫米×25毫米）。
- 测定各样品（平均3）的厚度。
- 使用不锈钢正畸绷带导线（直径为220微米），在样品的中心的针孔。
- 通过针孔传递结扎线，以形成一个环，并将其固定在拉力试验机。将L-PRF膜的边缘下颚把手13。
- 编程仪器，以使可动头工作在一个恒定的速率（10毫米/分钟）和起动实验。
- 记录弹性模量，断裂能，和应变从伴随单轴试验系统中的软件中断。这些值被自动计算并没有用户定义输入是必需的。请参见图3。
5.形态学考察
- 使用10 mm的皮肤活检穿孔准备L-PRF样本进行扫描电镜检查，并放置在一个24孔板。
- 洗用PBS样品，用2.5％戊二醛（于PBS中）20分钟固定。
- 脱水试样通过浸渍在连续增加的乙醇浓度（50％，70％，80％，90％和100％），每次5分钟。
- 治疗与0.5毫升100％的HMDS（六甲基二）5分钟。充气O / N，除去过量的HMDS 14。
- 使用双面胶带上存根安装样品，溅射涂层铂为70秒，并检查在扫描型电子显微镜在一个加速操作20千伏关合作电压（或相应的设置）。
L-PRF，胰蛋白酶敏感性和茚三酮测定6.京尼平交联
- 为了制备京尼平交联的L- PRF，冲洗膜用PBS和48小时浸泡在4ml 1％京尼平溶液（在70％的乙醇）。用PBS实验前漂洗以除去过量的京尼平15,16。
- 由它的胰蛋白酶降解的抗性评估L-PRF的京尼平交联的稳定性。代替L- PRF膜（N = 3）和京尼平交联的L-PRF在500μl0.01％胰蛋白酶和胰蛋白酶的每日变化在37℃下进行3天。
- 称取样品在1天前酶在开始曝光，并在3天的差异，并最终权重代表酶降解17。
- 通过茚三酮测定法量化京尼平处理的L- PRF（G-PRF）的交联的量。首先准备的标准CURVe。使用甘氨酸（1毫-0.031毫米）的曲线来建立游离氨基酸浓度（FAA）和吸光度之间的关系。
- 热PRF样品与1ml 2％（重量/体积）茚三酮为15分钟，在100℃。
- 让溶液冷却至室温，并添加1.5 ml的50％的乙醇。
- 分析使用适宜分光光度计570nm处的吸光度。
- 确定的交联百分比使用低于 15式
7. MTS细胞增殖试验
- 在T-75烧瓶生长MC3T3（小鼠颅盖前成骨细胞）的极限必需培养基-alpha修饰（αMEM），直到获得80％的汇合单层。
- 准备好新鲜，无菌L-PRF膜（打开L-PRF管细胞培养罩内）和膜转移到一个新的细胞培养皿。
- 从烧瓶中吸出介质并冲洗用PBS单层，加入5 ml的0.05％胰蛋白酶，并放置在37℃培养箱烧瓶5分钟，吸取烧瓶的内容到一个离心管中并离心，在400×g离心5分钟。
- 滗析出上清液，轻轻拍打管打破细胞沉淀和重新悬浮用4ml新鲜αMEM，分配细胞悬浮液（50微升）和台盼蓝（50微升）的混合物放入血球和计数的数细胞
- 种子内放置在L-PRF膜保留细胞的细胞膜中的前10毫米的玻璃克隆环4×10 5个细胞 （环能24小时后删除）。
- 在第4天，冲洗构建体用PBS三次10分钟。
- 加入1毫升不含血清的培养基，并加入200μl的MTS试剂至各孔，孵育2小时，在37℃。
- 测量从200微升等份490nm处的吸光度。
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Representative Results
L形的PRF凝块在不同的部分（顶部，中部和底部）层表示在图2的扫描电子显微镜的图像。如可以看到的，顶部主要是纤维蛋白网状的组成无细胞。中间层富含血小板与他们的活化和脱颗粒的证据。下层具有白细胞和血纤蛋白基质中包埋的红血细胞的混合物。
单轴拉伸测试和缝合保留强度试验：机械性能是在两种模式进行评价。结果证明L-PRF的粘弹性行为。即使弹性模量较低（0.47兆帕），该膜是坚韧（断裂能，5 N·毫米）和能够经历显著变形（217％，图3）的。从缝合线保持的测试数据，对在膜的能力的指标要缝合到组织，提出了显著强硬一个第二可变形材料（模量- 0.2兆帕，应变140％和断裂能-3.2 N.mm）在L-PRF（图4）。
之一的血纤维蛋白的产品在再生医学的局限性是其短的生物的生命。由从内源性纤维蛋白，L- PRF易受酶降解并经受纤溶。为了评价L-PRF的抗酶介导的降解，新鲜的L- PRF进行胰蛋白酶处理（0.01％），并在37℃。我们观察到三天之内L-PRF完全降解。 L-PRF膜的京尼平交联近60％（图5）降低降解。
L-PRF膜，以支持细胞生长的能力是由上交联和未交联的膜培养小鼠颅骨成骨细胞进行评价。未交联的血块进行降解，各个层次，而京尼平交联膜保留了它们的结构，并支持ÇELL 生长 （图6）。
图1的步骤中的L- PRF的产生。（A）的全血离心分离在玻璃管中之后，三个层将是可见的。（B）中滗析的PPP后，L-PRF正在使用无菌镊子除去（℃）的红血细胞基地正在刮掉使用解剖刀和铺设在穿孔金属托盘（D）中 。温和压缩后，PPP被挤压出来，形成一个坚定的L-PRF膜。 请点击此处查看该图的放大版本。
图下面的单轴拉伸测试模式（A）和缝合保持强度（B）的机械负荷的L- PRF 3.应力应变曲线 。各样品的装载模式被表示在不同的颜色。单轴拉伸试验数据（A）表示低模量，大弹性变形并迅速失败。一旦扩张由缝线（B）中 ，L-PRF代表一个膜是坚韧的（曲线下面积）以及膨胀的。数据的良好聚类表明样品之间的变化最小。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.在照片缝合保留强度试验实际故障。阿220微米厚的不锈钢正畸绷带导线被传递至L-PRF的中间，绑在拉力试验机的上部钳夹部件。另一端被安装到下夹持和拉伸以恒定的速率。注意到该膜和它的抗撕的伸长率，这表明L-PRF的优良的韧性。OM /文件/ ftp_upload / 53221 / 53221fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
孵化后在0.01％胰蛋白酶图5.降解L-PRF膜，所有 L-PRF膜完全解体胰蛋白酶3天之内，而京尼平交联的L-PRF分别为60％，比较稳定。这表明，当置于体内化学交联可以是一个可行的策略，以改善的L- PRF膜的寿命。
的L-PRF交联对细胞活力图6.效应。MC3T3细胞上未交联的L-PRF（A）中 ，京尼平交联的L-PRF（B）的一个的4天培养的代表性图像次组织培养塑料（C）。未交联的L-PRF降解文化变程度和表现出类似塑料细胞的活性。京尼平交联的L-PRF保持它们的结构，并支持鲁棒细胞的存活。右边是从3个重复独立实验量化的数据（+ SD）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
自体血小板浓缩物是有希望的，因为生长因子的丰度在再生医学18的领域。但是，这些准备工作往往缺乏一个明确的结构，使手术操作非常困难。许多次，悬浮液和凝胶不能有效地在递送位点保留，导致不可预测的结果。 L-PRF是一个巨大的进步在血小板的演变集中在它本质上是一个牢固的血纤维蛋白膜截留的血小板。这些固体膜具有优异的操控性能，并且可以在开放式手术安全地缝合在解剖学上所需的位置。然而，它的物理和生物特性相对未知的。
L形的PRF将形成一贯当上述步骤均严格遵守（ 图1）。其中一个在创造一个良好的L-PRF膜的重要考虑因素是TI我拖延抽血和离心之间。 L-PRF技术的成功完全取决于血液收集和立即转移的速度至离心机19，通常在一分钟。这是不可能的，以产生一个结构良好的L-PRF血块（与其特异性细胞含量，基质体系结构和生长因子的释放曲线），如果血液收获被延长，而不是均匀的;形成有未知内容纤维蛋白的一小语无伦次，松脆块状物代替。
它已被接受的细胞和细胞外基质（ECM）之间mechanobiological相互作用具有在细胞行为的各个方面，包括迁移，增殖和分化20,21具有决定性的影响。 L-PRF，血块的一个独特的类型，则在特定情况下形成，并且由纤维蛋白的复杂的，支链的网络。 L-PRF功能被移交到功能性组织愈合过程中的临时ECM。受到米器的机械力，成功愈合结果是依赖于L-PRF，因此阐明它们的物理性能的结构完整性是重要的。我们进行单轴拉伸试验（以确定材料的固有特性），并缝合保留测试（以确定故障特性）新鲜L-PRF。不像PRP凝胶或凝结的血液不具有一个限定的结构中，L-PRF类似于具有操作性优异的致密结缔组织。我们对于L-PRF膜报告的0.470兆帕（标准差= 0.107）的弹性模量和失败（215％应变）之前其初始长度拉伸两倍。这些数据匹配与发表的文献22,23谁才打破报低刚度（1-10兆帕）和高应变（高达150％）。中的值的差异可能由于使用纤维蛋白网状相比，在上述研究中使用的单纤维蛋白纤维的AFM分析。
缝合保持强度是外科手术移植材料的重要参数，它被定义为从接枝拉缝线或导致移植物的壁失败所需要的力。使用我们的实验直跨程序（如由ANSI 24定义）。所需的力通过3.23 N.mm（SD = 0.329）的L-PRF拉结扎线。总体而言，我们发现L-PRF是机械地坚韧，能够支持负载和拉伸两倍于张力的能力，并保持缝合得很好（撕裂之前显著变形）。
稳定性和L-PRF在生物环境中的结构完整性的缺乏是在其在组织工程应用的主要限制。我们试图通过化学交联的L- PRF使用京尼平来解决这个问题。不像它与毒性相关戊二醛，京尼平是一种天然存在的生物可降解的分子具有低的细胞毒性。京尼平后处理，膜是在胰蛋白酶和suppo显著稳定rted细胞增殖4天以上。然而，仅有20％的L- PRF的混合物交联的京尼平（由茚三酮测定法测定）。此数据表明，尽管化学交联是一个可行的策略，其他替代方案需要探讨。
基于这些发现，很显然，L-PRF是一种新型的生物材料具有独特的属性：从自体血液可预测的制备，协议的简易性，定义体系结构，令人印象深刻的机械性能和丰度的生长因子从激活的血小板。血液是允许的生理条件，没有暴露于抗凝血剂，外源的凝血酶和氯化钙下凝结。所有这些特征使L-PRF前途的生物材料用于在再生医学应用中。
一种临床问题来处理期L-PRF的应用是在血小板和血液组分的质量的不均匀性。目前，很少了解关于L-PRF患者凝血功能障碍的患者，或对影响凝血（肝素，华法林或血小板抑制剂）的药物产生。这些问题的答案，无疑将提高我们的愈合的认识，以及有助于促进个性化医疗领域。
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Disclosures
作者什么都没有透露，并确认不存在任何已知的利益冲突与该发布关联。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle 19G | BD | 305186 | |
| Needle Disposal Container | Fisherbrand | 14-827-122 | |
| Red-Topped Glass Collection Tube | BD | 8020129 | |
| Gauze Pads | Tyco | 5750 | |
| Bandage | Johnson & Johnson | 5005989 | |
| Surshield | Terumo | SV*S19BL | Safety winged infusion set |
| Blood Collection Assembly | BD | 303380 | |
| Tourniquets | BD | 367203 | |
| Brand Luer Adapter | Vacutainer | L42179 | |
| Intra-Spin System | Intra-Lock International | ISS110 | Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit |
| Pipettes (Serological & Micro) | Corning | ||
| Scalpel | Exelint | 29552 | |
| MTS Bionix 200 | MTS Systems Corporation | Material testing systems | |
| MTS Test Works 4 | MTS Systems Corporation | ||
| Whatman Filter Paper | Whatman | 1004 070 | |
| SS Orthodontic ligature wire | Patterson Dental | 628-4228 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Aldrich | 440191 | |
| Aluminium Mounting Stubs | Ted Pella | 16324 | |
| Double Sided Carbon Tape | PELCO Tabs | 16084-1 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | LV 5610 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| Cell Culture Incubator | Thermo Fisher Scientific Inc | 51026282 | |
| Antibiotic-Antimicotic | Gibco | 15240-062 | |
| Genipin | Wako | 078-03021 | |
| Cell Culture Media | Gibco | 12000-022 | Minimum Essential Medium-Alpha |
| MTS Reagent | Promega | G1118 | |
| PMS Reagent | Sigma | P9625 | |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch Spectrophotometer | |
| 10mm Glass Cloning Rings | Corning | 3166-10 | |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| DPBS | Corning | 55-031-PB | |
| Ninhydrin 98% | Aldrich | 454044 | |
| 24 Well Plate | Corning | 3987 | |
| Biopsy Punch | Acu Punch | P1025 | |
| Digital Micrometer | Pittsburgh | 68305 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| 12 Well Plate | Corning | 3336 | |
| 96 Well Plate | Corning | 3596 |
References
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