Protocol
모든 혈액 그리기 절차는 허가 및 인증 전문가에 의해 수행되어야합니다. 연구를위한 인체의 사용은 임상 시험 심사위원회 또는 기타 적절한 권한 승인을 포함한다. 동의서에 관한 및 참가자 식별을 보호하는 특별주의 사항을 따라야합니다. 이 프로토콜에 나와있는 모든 실험은 인간의 혈액 및 / 또는 혈액 제품과 적절한 개인 보호 장비의 처리는 항상 착용해야합니다 포함한다. 폐기물은 생물로 간주 규정에 따라 처리해야한다.
1. 정맥 천자
- 환자 / 참가자를 확인하고 기존의 기록을 확인합니다. 세부 연구를 설명하고 동의를 얻을.
- 평평하고 안정된 표면에 표시 튜브와 개별 환자에 대한 설정 트레이가 있습니다.
- 절차를 설명하고 지원 팔을 편안하게 환자 좌석을 확인합니다. 환자 자신 또는 SH 알리전자는 작은 핀치를 느낄 것이다 및 절차 전반에 걸쳐 여전히 남아 있어야한다.
- 어댑터에 바늘을 연결합니다.
- 손을 씻고 장갑을 착용하십시오.
- 바깥쪽으로 중심에서 동심원 70 % 이소 프로필 알코올로 청소하여 정맥 천자에 대한 전주 포사를 준비합니다. 30 초 동안 자연 건조 사이트를 허용합니다.
- 촉진하여 적절한 정맥을 확인합니다.
- (아직 반경 펄스를 느끼면서) 너무 꽉 있는지 만드는 천자 사이트 위의 지혈대 3-4을 적용합니다.
- 하나의 부드러운 동작으로 피부에 바늘 15 ~ 30 도의 경사를 삽입하여 정맥 천자를 수행합니다. 바늘을 통해 혈관을 누르고 전체 혈액의 9 ml의를 수집합니다.
- 지혈대를 제거합니다. 바늘에서 튜브를 제거합니다.
- 바늘을 철회하고 바늘을 제거하기 전에 천자 부위에 거즈 광장을 적용합니다. 적절한 생물 학적 용기에 바늘을 폐기하십시오.
- 홍보 유지하기 위해 환자에게 문의펑크 사이트에서 essure.
- 튜브 레이블
- 출혈이 중지 확인하기 위해 천자 사이트를 확인하십시오.
- 환자가 (통증이 팽창하거나 빛 머리가) 확실히 느끼고 있는지 물어, 거즈 광장을 통해 접착 붕대 나 테이프를 적용
- 배출하기 전에 환자 / 참가자 감사합니다.
2. L-PRF 준비
- 바로 붉은 얹어 건조 유리 튜브에 정맥 채혈 한 후, 원심 분리기에 넣습니다.
- 적절한 카운터 밸런스를 배치 한 후 실온에서 12 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 주기의 끝에서 튜브를 제거한다. 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP), 혈소판 풍부 피브린 (L-PRF) 및 적혈구베이스 (그림 1) : 세 개의 층을 확인할 수 있습니다.
- 피펫을 사용하여 PPP를 대기음. 사용 핀셋 부드럽게 L-PRF를 당겨 멸균, 천공 금속 메쉬에 넣습니다.
- 외과 용 메스를 사용하여 조심스럽게 버프 떠나는 RBC 층의 벌크를 긁어Y 코트 그대로.
- 부드럽게 30 초 동안 (멸균 금속 플레이트, 대략적인 무게 225g 사용) L-PRF 응고를 압축. 혈소판 가난한 플라즈마는 압착된다.
- 플레이트를 제거하고 부드럽게 L-PRF 막을 올립니다. L-PRF 막은 실험 12에서 사용하기위한 준비가되어있다.
3. 일축 인장 시험
- 취급의 용이성을 위해 여과지에 놓고 L-PRF 막 (N = 6)과 (7.5 mm의 게이지 길이 자신의 좁은 지점에 폭 2.75 mm)를 주문 제작 금속이 죽었을 사용하여 "개 뼈"에 펀치.
- 세 지점에서 각 샘플의 두께를 측정하고 평균을 취.
- 신중 축성 테스트 시스템의 턱 그립의 중앙에 L-PRF 막 결합.
- 조심스럽게 L-PRF 막을 노출 파일러 용지 지원을 찢어.
- 프로그램 장비 가동 헤드가 일정한 속도 (10.0 mm / 분)로 작동되도록 할 때 L- 실험을 시작할PRF는 아직 젖어있다.
- 단축 테스트 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 휴식, 휴식 에너지 및 변형을 탄성 계수를 기록합니다. 이 값은 자동으로 계산하며 사용자 정의 입력이 필요하지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.
4. 봉합 유지 강도
- 장소 L-PRF 처리의 용이성을 위해 여과지에 멤브레인 (N = 3)과 수술 메스를 사용하여 측정 시료의 직사각형 (10mm X 25mm)로 잘라.
- 각 시료 ((3)의 평균)의 두께를 측정한다.
- 스테인리스 교정 결찰 와이어 (지름 220 μm의)을 사용하여 시료의 중심에 핀홀을 만든다.
- 루프를 형성하고, 인장 시험기에 그것을 해결하기 위해 핀홀을 통해 합자 와이어를 전달합니다. 아래턱 그립 (13)에 L-PRF 멤브레인의 가장자리를 놓습니다.
- 이동 헤드가 일정한 속도 (10mm / 분) 시작에서 작동되도록 기기를 프로그래밍실험.
- 단축 테스트 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 휴식, 휴식 에너지 및 변형을 탄성 계수를 기록합니다. 이 값은 자동으로 계산하며 사용자 정의 입력이 필요하지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.
5. 형태 학적 검사
- 10mm 피부 생검 펀치를 사용하여 현미경 검사의 L-PRF 샘플을 준비하고 24 웰 플레이트에 배치합니다.
- PBS로 샘플을 씻고 20 분 (PBS)에 2.5 % 글루 타르 알데하이드로 고정한다.
- 순차적으로 5 분마다의 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 %) 증가에 침지하여 시험편 탈수.
- 5 분 동안 100 % HMDS (헥사 메틸 디 실라 잔) 0.5 ㎖로 처리한다. HMDS (14) 초과 제거 O / N을 공급하십시오.
- 양면 테이프를 이용하여 스터브에 마운트 샘플은 70 초 동안 백금 스퍼터 코팅 및 가속 작동 주사 전자 현미경으로 검사또한 알고리즘 20 kV의 전압 (또는 적절한 설정).
L-PRF, 트립신 감수성과 닌히 드린 분석 6. Genipin 가교
- genipin 가교 L-PRF를 준비하려면, PBS로 세포막을 씻어 48 시간 동안 (70 % 에탄올) 1 % genipin 용액 4 mL에 흠뻑 젖어. 초과 genipin (15), (16)를 제거하기 전에 실험에 PBS로 씻어.
- 트립신 분해에의 저항에 의해 L-PRF의 genipin 가교의 안정성을 평가합니다. 장소 L-PRF 막 (N = 3), 0.01 % 트립신 500 μL에 가교 L-PRF genipin 트립신의 일일 변화로 3 일 동안 37 ℃에서 배양 하였다.
- 시작에 노출 하루 3에서 차이를 효소와 무게는 효소 분해 (17)를 나타냅니다 종료 1 일 이전에 샘플의 무게를 측정.
- 닌히 드린 시험을하여 처리 genipin L-PRF (G-PRF)로 가교 결합의 양을 정량화. 먼저 표준 CURV를 준비E 글리신을 사용하여 (1 ㎜의 0.031 mM)을 곡선은 유리 아미노산 농도 (FAA)와 흡광도 사이의 관계를 수립한다.
- 2 % 1 ㎖와 샘플 열 PRF (w / v)의 100 ℃에서 15 분 동안 닌히 드린.
- 용액을 실온으로 냉각하고 50 % 에탄올 1.5 mL를 추가 할 수 있습니다.
- 적합한 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 분석한다.
- (15) 아래의 식을 이용하여 가교 결합 백분율을 결정
7. MTS 세포 증식 분석
- 80 %의 합류 단층을 얻을 때까지 T-75 플라스크에 최소 필수 중간 - 알파 수정 (αMEM)에서 MC3T3 (마우스 두개골 preosteoblasts)을 성장.
- 신선한 멸균 L-PRF 막 (세포 배양 후드 안쪽 L-PRF 튜브를 열)를 준비하고 새로운 세포 배양 접시에 막 전송.
- 대기음 플라스크에서 미디어와, PBS와 단층 린스 5 ml의 0.05 % 트립신을 추가 5 분 동안 37 오 C 배양기에 플라스크를 놓고, 5, 400 XG에서 원심 분리 튜브에서 원심 분리에 플라스크의 내용물을 피펫 분.
- 부드럽게, 뜨는을 가만히 따르다 세포 펠렛을 깰 튜브를 누르고 신선한 α의 (MEM)의 4 ㎖로 다시 중단, 혈구에 세포 현탁액 (50 μL)와 트리 판 블루 (50 μL)의 혼합물을 분배하고의 수를 계산 세포
- 시드 막 내에 세포를 유지하기 위해 L-PRF 막 위에 배치 10mm 유리 클로닝 고리 내에 4 × 5 셀 (링 24 시간 후에 제거 될 수있다).
- 4 일에, 10 분 동안 PBS의 세 번에 구조를 씻어.
- 각 웰에 혈청이없는 배지 200 ㎕를 MTS 시약 1 ML을 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어.
- 490 nm에서 200 μL 씩에서 흡광도를 측정한다.
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Representative Results
(상부, 중간 및 하부) 층이도 2에 도시 된 다른 섹션에서 L-PRF 응고의 주사 전자 현미경 이미지. 알 수있는 바와 같이, 상기 상부는 더 세포 주로 섬유소 네트워크로 구성된다. 중간 층은 자신의 활성화 및 탈과립의 증거와 혈소판 풍부하다. 하층은 백혈구 및 피브린 매트릭스 내에 포획 적혈구의 혼합물을 갖는다.
단축 인장 시험 및 봉합 고정 강도 시험 : 기계적 특성은 두 가지 모드에서 평가 하였다. 결과는 L-PRF의 점탄성 동작을 보여줍니다. 탄성률 (0.47 MPa의) 낮은 경우에도, 막 터프 (5 N · mm 휴식 에너지)이며 심각한 변형 (217퍼센트,도 3)을 견딜 수있다. 봉합 유지 테스트로부터의 데이터가, 멤브레인의 능력의 지표가 조직에 봉합하는, 상당히 힘든 제안차 변형 가능한 재료 (계수-0.2 MPa의, 변형 140 %, 에너지는 브레이크 3.2 N.mm) L-PRF에 (그림 4).
재생 의학의 섬유소 제품의 한계 중 하나는 짧은 생물학적 생명이다. 내인성 섬유소로 만든, L-PRF는 분해 효소에 민감하고 섬유소 용해를 겪는다. L-PRF의 저항을 평가하기 위해 분해를 매개하는 효소, L-PRF 신선한 37 O C.에서 트립신 처리 (0.01 %)을 실시하고 인큐베이션했다 우리는 3 일 이내에 L-PRF의 완전한 분해를 관찰했다. L-PRF 막의 Genipin 가교 거의 60 % (그림 5)에 의해 분해 감소했다.
세포의 성장을 지원하기 위해 L-PRF 막의 기능은 가교 및 비가 교 막의 마우스 두개골에 골아 세포를 배양하여 평가 하였다. genipin 가교 막은 그 구조를 유지하고 C를 지원하면서 미가 교 혈전 다양한 수준으로 저하를 시행엘 성장 (그림 6).
L-PRF의 생성에도 1의 단계. (A) 유리관에서 전혈을 원심 분리 한 후, 세 개의 층이 표시된다. (B)는 PPP을 경사 분리 한 후, L-PRF는 무균 핀셋을 사용하여 제거되고 . (C) 적혈구베이스 메스를 사용하여 긁어 및 천공 금속 트레이 (D)에 배치되고있다. 부드러운 압축 한 후, PPP는 압착하고 회사 L-PRF 막을 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 단축 인장 시험 모드 (A)과 봉합 고정 강도 (B)에서 L-PRF의 기계적 하중 3. 다음의 응력 - 변형 곡선. 각 샘플의 로딩 패턴은 다른 색으로 표시된다. 단축 인장 시험 데이터 (A)가 저 탄성률을 나타내는, 큰 탄성 변형 및 신속한 오류가 발생했습니다. 봉합사 (B)에 의해 팽창하면, L-PRF는 힘든 막 (곡선 아래 영역)과 팽창성을 나타냅니다. 데이터의 좋은 클러스터링은 샘플 사이에 최소한의 변화를 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 봉합 고정 강도 시험에서 실제 실패 4. 사진. 220 μm의 두께 스테인리스 교정 결찰 와이어 L-PRF의 중앙을 통과하고, 인장 시험기의 상부 조오 부재에 연결 하였다. 타단은 하부 그립에 부착하고 일정한 속도로 연신 하였다. L-PRF의 우수한 복원력을 제안, 막과 찢어 저항의 신장을 알 수 있습니다.OM / 파일 / ftp_upload / 53221 / 53221fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
genipin 교 L-PRF는 60 % 더 안정 동안 0.01 % 트립신에서 배양 한 다음 L-PRF 막 그림 5. 저하. 모든 L-PRF 막은 후 3 일 이내에 트립신 완전히 붕괴. 이것은 생체 내에서 배치되는 경우 화학 가교 L-PRF 막의 수명을 향상시키기 가능한 전략이 될 수 있음을 보여준다.
세포 생존에 L-PRF 가교 그림 6. 효과. 비가 교 L-PRF (A)에 MC3T3 세포, genipin - 가교 L-PRF (b)는 4 일 문화의 대표 이미지ND 조직 배양 플라스틱 (C). 미가 교 L-PRF 가변 정도 배양 열화 및 플라스틱과 유사한 세포 활성을 보였다. Genipin 가교 L-PRF는 구조를 유지하고 강력한 세포 생존을 지원했다. 권리 세 복제와 독립적 인 실험에서 정량화 된 데이터 (+ SD)입니다합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
자가 혈소판 농축 때문에 성장 인자의 풍부 (18)의 재생 의료 분야에서 유망. 그러나, 이러한 제제는 종종 외과 적 조작이 매우 곤란하게 정의 구조 부족. 여러 번, 현탁액 젤은 예측할 수없는 결과를 초래, 배달의 현장에서 효과적으로 유지되지 않습니다. L-PRF는 혈소판의 발전에 큰 사전이 본질적으로 내포 된 혈소판과 회사 섬유소 막 인 것을 집중 나타냅니다. 이 고체 막은 우수한 핸들링 특성을 가지고, 안전하게 개방 수술 중 해부학 적으로 원하는 위치에 봉합 될 수있다. 그러나, 물리적 및 생물학적 특성은 상대적으로 알려져 있지 않다.
위에서 설명한 단계를 엄격하게 (그림 1)에 부착 할 때 L-PRF는 지속적으로 형성 할 것이다. 좋은 L-PRF 막 생성에 중요한 고려 사항 중 하나 인 TI나 채혈 및 원심 분리 사이에 지연. L-PRF 기술의 성공은 전적으로 통상적 분 이내에 원심 분리기 (19)에 채혈 즉시 전송 속도에 의존한다. 그것은 혈액 채취가 장기간 균질하지 않은 경우, (해당 특정 세포 함량 매트릭스 아키텍처 및 성장 인자의 방출 프로파일) 잘 구조화 L-PRF 응괴를 생성하는 것은 불가능하다; 알 콘텐츠 피브린 작은 간섭 무른 질량 대신에 형성된다.
이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간 상호 작용 mechanobiological 이주, 증식 및 분화 (20, 21)를 포함 셀 동작의 모든 측면에서 중요한 영향을 미치는 것이 허용되었다. L-PRF, 혈병의 고유 형태는, 특정 상황에서 형성되고, 피브린의 복잡한 지형 네트워크로 구성된다. 치료하는 동안 기능 조직으로 뒤집어 임시 ECM으로 L-PRF 기능. M을 실시 되echanical 힘은, 성공적인 치료 결과는 L-PRF 따라서 자신의 물리적 특성을 해명의 구조적 무결성에 의존하는 것이 중요하다. 우리는 단축 인장 시험 (고유의 소재를 확인하는)와 신선한 L-PRF에 봉합 보존 시험 (장애 특성을 파악하기 위해) 수행. PRP 젤 또는 정의 된 구조를 가지고 있지 않습니다 응고 혈액과는 달리, L-PRF는 뛰어난 핸들링 특성을 가진 조밀 한 결합 조직과 유사합니다. 우리는 L-PRF 막에 대한 0.470 MPa로 (SD = 0.107)의 탄성 계수를보고하고 실패 (2백15퍼센트의 변형) 전에 두 번 초기 길이를 늘릴. 파괴하기 전에 낮은 강성 (1 ~ 10 MPa의)과 (150 %까지) 높은 균주를보고 출판 문학 (22, 23)와 이러한 데이터 일치합니다. 값의 차이는 전술 한 연구에서 단일 피브린 섬유의 AFM 분석의 사용에 비해 피브린 네트워크의 사용에 기인 할 수있다.
봉합 고정 강도는 수술이며중요한 이식 재료의 매개 변수 그리고 그것은 이식에서 봉합사를 당기거나 이식의 벽이 실패 할 수하는 데 필요한 힘으로 정의된다. 우리의 실험 과정에 걸쳐 직선 (ANSI (24)에 의해 정의 된 바와 같이) 사용. 에 필요한 힘은 3.23 N.mm (SD = 0.329)의 L-PRF를 통해 합자 와이어를 잡아 당깁니다. 전체적으로, 우리는 L-PRF는로드 및 장력에 더 배 신장하는 기능을 지원할 수있는 기계적 어려운 것으로 밝혀 꽤 잘 봉합을 유지 (찢어 전에 상당히 변형).
안정성과 생물학적 환경에서 L-PRF의 구조적 무결성의 부족은 조직 공학에서의 사용의 주요 제한 사항입니다. 우리는 화학적으로 genipin를 사용하여 L-PRF을 가교하여이 문제를 해결하기 위해 노력했다. 독성과 연관된 글루 테르 알데히드 달리 genipin 낮은 세포 독성을 가진 천연 생분해 성 분자이다. genipin 처리 후, 멤브레인은 트립신 및 suppo에서 상당히 안정사일을 통해 세포 증식을 rted. 그러나, L-PRF의 20 %가 genipin으로 가교 된 (닌히 드린 분석에 의해 결정). 이 데이터는 화학적 가교 결합이 가능한 전략 동안, 다른 대안이 모색 될 필요가 있음을 시사한다.
자가 혈액 제제로부터 예측 프로토콜을 간단히 정의 구조 인상적 기계적 특성 및 활성화 된 혈소판으로부터 성장 인자 풍부 이러한 발견에 기초하여, L-PRF는 독특한 특성을 가진 신규 한 생체 재료 인 것이 분명하다. 혈액 항응고제, 외인성 트롬빈과 염화칼슘에 노출되지 생리적 조건 하에서 응고시킨다. 이러한 특성은 모두 L-PRF는 재생 의학에 응용 프로그램에 대한 생체 재료를 약속합니다.
L-PRF의 응용 프로그램에서 처리하는 임상 문제 중 하나는 혈소판 및 혈액 성분의 품질 이질성이다. 현재, 거의가에 대한 이해L-PRF 혈액 응고 (헤파린, 와파린 또는 혈소판 억제제)에 영향을 약물에 대한 혈액 응고 장애 또는 환자와 환자에서 발생. 이러한 질문에 대한 답변은 의심 할 여지없이 치유에 대한 우리의 이해를 향상시킬뿐만 아니라 맞춤 의학 분야의 발전에 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어 그리고이 책과 관련된 관심의 알려진 충돌이 없는지 확인합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle 19G | BD | 305186 | |
| Needle Disposal Container | Fisherbrand | 14-827-122 | |
| Red-Topped Glass Collection Tube | BD | 8020129 | |
| Gauze Pads | Tyco | 5750 | |
| Bandage | Johnson & Johnson | 5005989 | |
| Surshield | Terumo | SV*S19BL | Safety winged infusion set |
| Blood Collection Assembly | BD | 303380 | |
| Tourniquets | BD | 367203 | |
| Brand Luer Adapter | Vacutainer | L42179 | |
| Intra-Spin System | Intra-Lock International | ISS110 | Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit |
| Pipettes (Serological & Micro) | Corning | ||
| Scalpel | Exelint | 29552 | |
| MTS Bionix 200 | MTS Systems Corporation | Material testing systems | |
| MTS Test Works 4 | MTS Systems Corporation | ||
| Whatman Filter Paper | Whatman | 1004 070 | |
| SS Orthodontic ligature wire | Patterson Dental | 628-4228 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Aldrich | 440191 | |
| Aluminium Mounting Stubs | Ted Pella | 16324 | |
| Double Sided Carbon Tape | PELCO Tabs | 16084-1 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | LV 5610 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| Cell Culture Incubator | Thermo Fisher Scientific Inc | 51026282 | |
| Antibiotic-Antimicotic | Gibco | 15240-062 | |
| Genipin | Wako | 078-03021 | |
| Cell Culture Media | Gibco | 12000-022 | Minimum Essential Medium-Alpha |
| MTS Reagent | Promega | G1118 | |
| PMS Reagent | Sigma | P9625 | |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch Spectrophotometer | |
| 10mm Glass Cloning Rings | Corning | 3166-10 | |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| DPBS | Corning | 55-031-PB | |
| Ninhydrin 98% | Aldrich | 454044 | |
| 24 Well Plate | Corning | 3987 | |
| Biopsy Punch | Acu Punch | P1025 | |
| Digital Micrometer | Pittsburgh | 68305 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| 12 Well Plate | Corning | 3336 | |
| 96 Well Plate | Corning | 3596 |
References
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