Introduction
Herbicideresistentie in onkruid vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde productie van voedsel en vezels 1,2. Momenteel duizenden van resistente bevolking en biotypen van meer dan honderd wiet soorten wereldwijd zijn gedocumenteerd en onderzocht 3. Een belangrijk mechanisme dat herbicide resistentie in planten is de verandering van herbicide doel- ter genen en eiwitten, met inbegrip van genetische mutaties die herbicide-eiwit binding kinetiek of amplificatie van het target-gen ter 2 beïnvloeden. Metabole ontgifting via de verhoogde activiteiten van cytochroom P450 monooxygenase (P450) of glutathion S-transferase (GST) enzymen is een ander mechanisme dat herbicideresistentie in onkruid, dat verschilt op verschillende manieren van target-locatie-gebaseerde mechanismen 2 verleent. -Metabolische gebaseerde verzet heeft belangrijke gevolgen voor de vraag of planten fitness kosten (aka fitness sancties) kan het gevolg zijn van het herbicide-resistentie mechanism, alsmede over de mogelijkheden voor een enkele detoxificatie mechanisme om cross- of meerdere herbicideresistentie in onkruidpopulaties 1,2,4 verlenen. In het algemeen, kunnen herbicide metabolisme in planten worden onderverdeeld in drie fasen 5. Fase I omvat herbicide conversie of activering zoals P450-gemedieerde hydroxylering van aromatische ringen of alkylgroepen of door N - of O- dealkylering reacties, wat leidt tot verhoogde polariteit en gedeeltelijke herbicide ontgifting 5,6. Nieuw geïntroduceerde functionele groepen in Fase I koppeling plaatsen voor conjugatie kunnen bieden aan gereduceerd glutathion met GST of glucose door UDP-afhankelijke glycosyltransferases in Fase II 5,7. Bijvoorbeeld, grote initiële metaboliet van primisulfuron-methyl in maïs hydroxy-primisulfuron-methyl 8, die verder kan worden omgezet in hydroxyl-primisulfuron-glucoside (fase II) en vervolgens getransporteerd naar de vacuole voor langdurige opslag of verdere metabolische proverwerking 5,6 (Fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) is moeilijk te control, tweezaadlobbige jaarlijkse onkruidsoorten die de productie van maïs (Zea mays), sojaboon (Glycine max), en katoen (Gossypium hirsutum) in de Verenigde Staten belemmert. De hoge mate van genetische diversiteit van waterhemp wordt vergemakkelijkt door zijn tweehuizig biologie en lange afstand wind bestuiving, en een vrouwelijke waterhemp plant kan produceren tot een miljoen zaden 9. Deze zaden zijn klein en gemakkelijk verspreid, wat natuurlijk begiftigen waterhemp een effectieve verspreiding mechanisme. Waterhemp toont continu kieming gedurende het groeiseizoen 9, en de zaden kunnen ontkiemen na enkele jaren van kiemrust. Waterhemp is een C 4 plant die een hoger groeipercentage dan de meeste breedbladige onkruiden in akkerbouw teeltsystemen 10 bezit. Daarnaast waren er talrijke waterhemp populatie resistent zijn tegen meerdere famIlies herbiciden 3.
Een populatie van waterhemp (aangeduid MCR) vanaf Illinois is tegen 4-hydroxy-fenylpyruvaat dioxygenase (HPPD) -inhibiting herbiciden 11, zoals mesotrione, alsmede atrazine en acetolactaatsynthase (ALS) -inhibiting herbiciden, waaronder primisulfuron-methyl , als gevolg van niet-target-site op basis mechanismen 12,13. Een andere populatie waterhemp aangewezen ACR 14, die primisulfuron-methyl-bestand (als gevolg van een mutatie in het ALS-gen) en atrazine-resistent maar gevoelig voor mesotrione en een waterhemp populatie aangewezen WCS 14 die gevoelig is voor primisulfuron-methyl, mesotrione en atrazine werden vergeleken met MCR in ons eerder onderzoek 12 en actuele experimenten (samengevat in tabel 1). Eerste studies niet veranderingen in de HPPD gensequentie of expressie niveaus, of verminderde opname mesotrione detecteren, in de MCRpopulatie vergelijking met mesotrione-gevoelige populaties 12. Echter, het metabolisme studies met hele planten aangetoond aanzienlijk lagere niveaus van de ouder mesotrion herbicide in MCR vergelijking met ACR en WCS, die gecorreleerd zijn met eerdere fenotypische reacties op Mesotrione 11,12.
| Waterhemp Bevolking | Afkorting | Fenotype Mesotrione | Mesotrione resistentiemechanisme | Fenotype primisulfuron | Primisulfuron resistentiemechanisme |
| McLean County-Resistant | MCR | Resistente | Metabolisme * | Resistente | Metabolisme |
| Adams County-Resistant | ACR | SENSITive | - | Resistente | Target-website mutatie in ALS 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Gevoelig | - | Gevoelig | - |
* Niet-target-terrein resistentie mechanismen, anders dan verbeterde stofwisseling, kan ook verlenen mesotrione weerstand in de MCR bevolking 12.
Tabel 1: beschrijving waterhemp populaties van Illinois in deze studie.
Naast het bepalen van de tarieven van herbicide metabolisme in intacte waterhemp zaailingen, werd een verschillende experimentele benadering ontwikkeld en toegepast in lopende onderzoek metabolisme onderzoeken met behulp van een uitgesneden waterhemp bladassay 12 en verschillende P450 remmers (bijv tetcyclacis en malathion). Deze methode is specifiek aangepast voor waterhemp een Previlende onderzoek primisulfuron-methyl metabolisme in weggesneden maïs laat 15, omdat de weggesneden blad test nog niet gemeld voor het uitvoeren van herbicide metabolisme onderzoek in een tweezaadlobbige plant. De organophophosate insecticide malathion is vaak gebruikt voor in vivo en in vitro-metabolisme herbicide onderzoek P450 betrokkenheid 16 geven. Bijvoorbeeld, tolerantie en snelle metabolisme van mesotrione in maïs zijn te wijten aan P450-gekatalyseerde ring hydroxylering, die werd gecontroleerd toen malathion verhoogde gevoeligheid maïs mesotrione 17. Ook malathion remde het metabolisme van de ALS-remmer primisulfuron-methyl in weggesneden maïs laat 15. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek is dat gegevens die onafhankelijk zijn van gehele plant translocatie patronen, een belangrijke factor om te overwegen bij het beoordelen metabolisme van systemische herbiciden na het opkomen in planten. Derhalve maakt deze werkwijze kwantitatief enkwalitatieve metabole analyses te richten op één behandeld blad 12.
Een vegetatieve kloneringsstrategie, in combinatie met het uitgesneden blad protocol, is eerder gebruikt in waterhemp tot metabolismeonderzoeken 12 voeren. Vanwege de aard van uitkruising waterhemp (aparte mannelijke en vrouwelijke planten), en de grote mate van genetische diversiteit binnen tweehuizig Amaranthus soorten 9, dit protocol ervoor gezorgd dat genetisch identieke waterhemp zaailingen werden geanalyseerd binnen het tijdsverloop experimenten. Dit artikel toont de bruikbaarheid van het uitgesneden blad werkwijze voor het meten van snelheden van herbicide metabolisme in een dicotyl onkruid (waterhemp). De resterende hoeveelheid bovenliggende herbicide werd bepaald op elk tijdstip (figuur 1) door niet-lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse, en werd geschikt met een eenvoudige eerste orde curve voor de schatting van de tijd tot 50% van de geabsorbeerde herbicide te breken ( DT 50). Vertegenwoordigerchromatogrammen van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) worden getoond voor ALS-bestendige -gevoelige waterhemp populaties, waarbij de verdwijning van bovenliggende herbicide en gelijktijdige vorming van polaire metabolieten (s) geven gedurende een tijdsverloop studie (figuur 2). De focus van het artikel is het beschrijven en demonstreren van de bruikbaarheid van het uitgesneden blad assay in combinatie met een vegetatieve klonen werkwijze voor het bepalen nauwkeurige en reproduceerbare snelheden van herbicide metabolisme in dicotyle planten, met behulp gelijkmatig ring gemerkt (URL- 14 C) herbiciden waterhemp drie populaties die verschillen in hun hele plant reacties op HPPD- en ALS-remmende herbiciden (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plant Materiaal, Groei Voorwaarden en vegetatieve Klonen
Opmerking: Drie waterhemp populaties werden onderzocht in dit onderzoek: MCR (van McLean Provincie, IL), ACR (van Adams County, IL) en WCS (van Wayne County, IL) (tabel 1).
- Verzamelen en schorten waterhemp zaden in 0,1 g L -1 agar: water oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 30 dagen kieming te verbeteren. Opmerking: Sommige waterhemp populaties slapende, maar deze stap helpt om kiemrust overwinnen en zaad ontkiemt gelijkmatiger.
- Ontkiemen zaden van elke waterhemp populatie (zoals in tabel 1) bij 12 x 12 cm schalen met een medium potten in de kas.
- Handhaven kas omstandigheden bij 28/22 ° C dag / nacht temperatuur binnen een 16/8 hr fotoperiode 12.
- Supplement natuurlijk licht in de kas met licht van kwik halogeen lampen met een minimum van 500 umol m bieden -2 -1 fotonflux in de fabriek luifel niveau.
- Transplant ontstond zaailingen als ze 2 cm lang in 80 cm 3 potten in de kas.
- Zaailingen in 950 cm 3 potten met een 3: 1: 1: 1 mengsel van potgrond: bodem: turf: zand als zaailingen zijn 4 cm hoog. Voeg 5 g slow-release meststof granules elke pot en meng dit grondmengsel.
- Snijd en verwijder de shoot topmeristeem die de drie jongste blaadjes van 7 cm hoge planten aan apicale dominantie te elimineren.
Opmerking: Deze stap zorgt ervoor dat elke plant genoeg 3 cm oksel scheuten te klonen zal groeien. - Accijns vijf axillaire scheuten (3 cm lang) wanneer zaailingen ongeveer 14 cm lang van elke waterhemp populatie (zoals in tabel 1). Verwijder het merendeel van de bladeren van deze axillaire scheuten vochtverlies bij verdere verwerking af, maar behouden twee jongste bladeren verdere groei toe bij overplanten.
- Transplant oksel schiet in 80 cm potten 3 (één zaailingen per pot) in potten medium, die hetzelfde medium voor kieming. Oppotten medium moet in eerste instantie worden verzadigd totdat wortels vorm in de groeikamer, onderhouden dan constant vocht en plaats potten in de groei kamer voor 7 dagen om wortels te vestigen.
Opmerking: Planten zijn zeer gevoelig op dit punt en mag niet worden benadrukt.- Onderhouden kweekkamer omstandigheden bij 28/22 ° C dag / nacht temperatuur binnen een 16/8 hr fotoperiode 12.
- Een combinatie van gloeilampen en tl-lampen kunnen worden gebruikt om licht te geven in de groei kamer en moet ten minste 550 umol m -2 s -1 fotonflux op fabriek luifel level 12 te leveren.
- Weer transplantatie in 950 cm 3 potten (één zaailing per pot) containing een 3: 1: 1: 1 mengsel van potgrond: bodem: turf: zand (ook 5 g slow-release meststof korrels) als gekloonde planten zijn 4 cm lang, over te dragen dan terug naar de kas.
- Kloon de planten een tweede keer met behulp van dezelfde methode hierboven beschreven (dwz, herhaal stappen 1,5-1,8, en ga dan verder met stap 2.1). Voor een typische tijdsverloop studie, het genereren van klonen van ten minste zes onafhankelijke planten uit elke waterhemp bevolking en ze opnemen als lijnen MCR 1-6, ACR 1-6 en WCS 1-6.
- Vaststellen ten minste zes verschillende "ouder" klonale lijnen, om het experiment te herhalen en adequaat vertegenwoordigen genetische variabiliteit binnen elke waterhemp populatie.
- Afhankelijk van hoeveel tijd de punten zullen worden geanalyseerd, het genereren van voldoende sub-klonen van elkaar "ouder" klonale lijn naar een tijdsverloop studie uit te voeren.
2. Het uitvoeren van een metabolisme studie met weggesneden Waterhemp Bladeren
- Uitsnijden derde-jongste bladeren (2-3 cm lang, 0,5 cm onder geschakelde bladsteel) wanneer gekloneerd waterhemp planten 10 tot 12 cm lang voor herbicide metabolisme en DT 50 analyse.
- Gesneden blad bladstelen van elkaar waterhemp fabriek een tweede keer (zorgen dat 0,3 cm van de bladsteel blijft) onder water, en leg deze cut eindigt in 1,5 ml plastic flesjes (één blad per flesje) 15.
Opmerking: Het snijden van een tweede keer onder water voorkomt luchtbellen vormen en houtvaten inpluggen.- Ten eerste, gedeeltelijk onderdompelen uitgesneden blad met gesneden bladsteel in pre-incubatie buffer (200 pl) van 0,1 M Tris-HCl (pH 6) gedurende 1 uur.
- Ten tweede verplaatst elk blad een nieuwe 1,5 ml flacon met een incubatiebuffer (200 pl) van 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 pM [URL- 14 C] herbicide en incubeer bij 28 ° C gedurende 1 uur tot zorgen voor herbicide absorptie in de bladeren.
Opmerking: Beide 14 C-mesotrione en
Opmerking: Het effect van metabole remmers op herbicide metabolisme kan worden bepaald door het modificeren stappen 2.2.1 en 2.2.2 hierboven. Voeg 100 pM van de remmer aan het pre-incubatie buffer en laat incubeer gedurende 2 uur, vervolgens transfer naar incubatiebuffer met herbicide en opnieuw toevoegen 100 pM remmer. Bijvoorbeeld malathion en tetcyclacis remmen bepaalde cytochroom P450-activiteiten in planten 15-17. - Was het ondergedompelde gedeelte van weggesneden bladeren met gedemineraliseerd water en breng uitgesneden bladeren tot een kwart sterkte Murashige en Skoog (MS) zoutoplossing (500 ul) voor 0 uur, 5 uur, 11 uur, 23 uur of 35 uur, respectievelijk, in de groei kamer voor het tijdsverloop metabolisme studie.
- Oogst door het verwijderen van verlofs van incubatieoplossing op het juiste tijdstip handmatig slijpen elk blad weefsel in vloeibare stikstof via een polypropyleen buis (15 ml) en glazen stamper.
- Extract radioactief gemerkt herbicide en metabolieten uit elk blad met 7 ml 90% aceton met een laboratorium weefselhomogenisator dezelfde polypropyleen buis als hierboven. Spoel weefselhomogenisator met een extra 7 ml 90% aceton, en blijven homogeniseer totdat weefsel grondig verpulverd (gewoonlijk ongeveer 2 min). Opmerking: 90% aceton kan worden gebruikt voor de winning van de meeste herbiciden uit plantenweefsel. Indien deze methode kan niet meer dan 90% van het radioactief gemerkte verbindingen opgenomen te extraheren, vervolgens 90% methanol en 90% acetonitril kan worden vervangen als het extractieoplosmiddel.
- Label 90% aceton extracten (14 ml totaal) en opslag bij -4 ° C gedurende 16 uur om voor extra extractie plaatsvinden.
Let op: Na deze extractie van behandelde bladeren, de hoeveelheid winbare radioactivity is typisch ten minste 98% van de radioactief gemerkte verbindingen opgenomen door het behandelde blad. In uitgesneden bladeren niet-extraheerbare radioactiviteit (gebonden resten) gemiddeld slechts 0,3% voor alle tijdstippen in onze vorige studie 12, maar dit aantal kan variëren afhankelijk van het gebruikte herbicide en tijdstip onderzocht. - Centrifugeer monsters bij 5000 xg gedurende 10 min en de supernatanten geconcentreerd bij 40 ° C met een roterende verdamper tot een eindvolume van 0,5 ml wordt verkregen. Transfer dit volume naar een 2,0 ml plastic buis.
- Voeg acetonitril: water (1: 1, betrokken op volume) regelen het eindvolume van de plantenextracten 1,25 ml en re-centrifuge bij 10.000 xg gedurende 10 min om eventuele deeltjes te verwijderen.
- Meet totale radioactiviteit in een monster genomen uit elk monster (dpm gl -1) met vloeistofscintillatietelling spectroscopie (LSS) 12 en normaliseren hoeveelheden [14 C-gelabelde] verbindingen geïnjecteerd voor HPLC-analyse (bijvoorbeeld 10,000 totale dpm / monster / run) zodat y-assen uniform onder monsters zijn als grafische resultaten.
3. HPLC analyse van herbicide Metabolisme in weggesneden Bladeren
Opmerking: Resolve totaal extraheerbare radioactiviteit in ouder herbicide en herbicide metabolieten met behulp van de volgende RP-HPLC omstandigheden 12.
- Voer RP-HPLC met een kolom C 18 (4,6 x 250 mm, 5 urn deeltjesgrootte analytische HPLC) met een stroomsnelheid van 1 ml min-1 voor de meeste niet-polaire herbiciden.
Opmerking: C 4 of C 12 RP-HPLC kolommen kunnen ook worden gebruikt om de scheiding van de bovenliggende herbicide van de metabolieten optimaliseren. Een pre-column filter en / of voorkolom kunnen ook worden gebruikt om te beschermen en de levensduur van de kolom RP.- Gebruik de volgende mobiele fase voor HPLC-RP: Eluent A, 0,1% mierenzuur (v / v) in water en elutiemiddel B 100% HPLC-kwaliteit acetonitril.
Opmerking: HPLC-kwaliteit methanol kan ook gebruikt worden als Eluent B voor het oplossen van meer polaire verbindingen en metabolieten, maar wees ervan bewust dat de retentietijd ook kunnen veranderen.
Opmerking: Het elutieprofiel gebruikt mesotrione of primisulfuron-methyl oplossen van de polaire metabolieten in het onderzoek 12 is: Stap 1, A: B (4: 1, v / v) A: B (3: 2, v / v ) in een lineaire gradiënt (12 min); Stap 2, A: B (3: 2, v / v) A: B (3: 7, v / v) in een lineaire gradiënt (5 min); Stap 3, A: B (3: 7, v / v) A: B (1: 9, v / v) in een lineaire gradiënt gedurende 2 min (met in totaal 19 min).
Opmerking: Gradiënten en isocratische stappen moeten mogelijk worden aangepast op basis van de fysische eigenschappen van het uitgangsmateriaal om de oplossing te optimaliseren. - Volg de bovenstaande lineaire gradiënt stappen A: B (1: 9, v / v) A: B (4: 1, v / v) in een lineaire gradiënt (3 min) en A: B (4: 1, v / v) isocratisch stap (tenminste 2 min) opnieuw equilibreren van de kolom RP vóór het injecteren van de volgende extract 12.
- Gebruik de volgende mobiele fase voor HPLC-RP: Eluent A, 0,1% mierenzuur (v / v) in water en elutiemiddel B 100% HPLC-kwaliteit acetonitril.
- Detecteren en visualiseren radioactief gemerkte verbindingen met een Flow Scintillation Analyzer. Noteer de hoeveelheid bovenliggende herbicide resteert in elk monster als percentage van totale radioactiviteit in elk monster (gedetecteerd en gekwantificeerd door flow Scintillation Analyzer volgens de instructies van de fabrikant) met snelheden van herbicide metabolisme in elk waterhemp populatie bepaalt gedurende het tijdsverloop.
4. Statistische Procedures
- Schik behandelingen in een volledig gerandomiseerd design (of een andere geschikte regeling voor statistische analyse).
- Voer twee onafhankelijke experimenten bij elke behandeling, uit drie biologische herhalingen voor elk experiment. De twee onafhankelijke experimenten omvatten zes biologische herhalingen in totaal. Indien het experiment effect niet significant (α = 0,05), combineren en analyseren van gegevens van elk onafhankelijk experiment. Indien het experiment effect significant is, dan analyseert elk experiment afzonderlijk.
Let op: Neem de eerste drie biologische repliceert in Experiment 1 en de volgende drie biologische repliceert in Experiment 2. Elke biologische repliceren vertegenwoordigt een duidelijke "ouder" klonale lijn afgeleid van elke populatie (MCR 1-6, 1-6 ACR en WCS 1-6), zodat elke tijd- Natuurlijk analyse maakt gebruik van genetisch identieke planten. De twee onafhankelijke experimenten omvatten zes biologische herhalingen in totaal, die zorgt voor een adequate vertegenwoordiging van genetische variabiliteit en de bepaling van een gemiddelde DT 50 voor elke waterhemp bevolking. - Analyseer de gegevens met niet-lineaire kleinste kwadraten regressie en passen ze met een eenvoudige eerste orde curve in te schatten DT 50 s. De vergelijking hieronder beschrijft het model:
- wanneer in dit model y staat voor het percentage van de ouder herbicide resterende op tijdstip t, μ i de DT 50 perwaterhemp bevolking i, en de parameter C 0 is het geschatte bedrag van de ouder herbicide aanwezig bij t = 0 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grote verschillen in snelheden van mesotrione metabolisme gedetecteerd tussen een WCS en ACR en MCR (figuur 1). Op elk tijdstip was MCR mesotrione sneller dan de twee mesotrione gevoelige populaties, WCS en ACR, correleert met eerdere hele plant fenotypische respons 11 gemetaboliseerd. Door klonen genoeg planten uit een enkele ouderplant van elke populatie, herbicide metabolisme tijdsverloop analyses uniform en reproduceerbaar door het ontbreken van de genetische variatie binnen elke tijdsverloop 12. Zo wordt het tijdsverloop voor mesotrione metabolisme in klonale lijn 5 12 weergegeven in figuur 1. Een totaal van zes verschillende klonale lijnen, afgeleid van zes afzonderlijke moederplanten werden geanalyseerd elke populatie (Tabel 1) met een totale mediaan DT bepalen 50 waarde, die MCR bleek dat mesotrione metabolisme significant sneller (
Naast het bestuderen van de mechanismen voor de resistentie in mesotrione MCR, een verwant doel was om het mechanisme van resistentie tegen ALS-remmers MCR bepalen. Voorafgaand onderzoek heeft aangetoond dat een subpopulatie ontleend MCR was ALS resistent maar geen mutatie in het ALS doellocatie gen bezitten, hetgeen een non-target locatiegebaseerde mechanisme 13. Dit in tegenstelling ACR, die resistent ALS wijten aan een doelwitplaats mutatie die een minder gevoelig ALS enzym 14 verleent. Om test Deze hypothese werd uitgesneden leaf assay uitgevoerd met [URL- 14 C] primisulfuron-methyl, een ALS-remmende herbicide van het sulfonylureum familie. Het piekoppervlak van 14 C-primisulfuron-methyl in een representatief HPLC-chromatogram (retentietijd ongeveer 21,6 min) werd in MCR beduidend kleiner dan in ACR en WCS in 12 PET (figuur 2). Bovendien zijn twee polaire metabolieten met kortere retentietijden dan primisulfuron-methyl werden gedetecteerd in uitgesneden bladextracten uit alle drie populaties (Figuur 2). Hoewel de structuren van deze twee polaire metabolieten niet bepaald in deze studie, de snelle vorming overeenstemming met ring hydroxylering van primisulfuron-methyl-8 (fase I metabolisme), gevolgd door conjugatie glucose 5 (fase II metabolisme).
In combinatie met de kwalitatieve analyse van primisulfuron metabolisme in MCR, ACR en WCS (figuur 2), het bedragvan ouder herbicide resterende op elk tijdstip werd gekwantificeerd en gebruikt om de DT 50 waarden voor primisulfuron-methyl in MCR (13,6 uur), ACR (> 24 uur) te bepalen, en WCS (> 24 uur) (figuur 3). De aanzienlijk kortere DT 50 waarde in MCR is consistent met verhoogd metabolisme als de belangrijkste mechanisme voor ALS resistentie in deze populatie, in overeenstemming met eerdere hele plant-onderzoek 13. Interessant is echter de DT 50 waarden voor primisulfuron in ACR en WCS lijken nog aanmerkelijk langer dan in MCR (figuur 3), ondanks zowel MCR en ACR tonen ALS-remmer resistente fenotypen (tabel 1). De relatief lange DT 50 in ACR is mogelijk omdat het niet nodig is om snel metaboliseren primisulfuron, aangezien ACR een minder gevoelige ALS enzym als voornaamste resistentiemechanisme 14. Samengevat, de weggesneden waterhemp blad assay gebruikt in ons onderzoek leverde waardevolle qualitative en kwantitatieve gegevens en verstrekt nieuw inzicht in metabolisme-gerelateerde resistentie mechanismen in de richting van twee verschillende herbiciden in MCR, ACR en WCS.
Figuur 1:. Tijd loop van mesotrione metabolisme in weggesneden waterhemp vertrekt vanaf vegetatief gekloonde populatie weggesneden bladeren (derde jongste blad, 2-3 cm in lengte) van waterhemp zaailingen (10 tot 12 cm) werden vegetatief gekloond zodat elke tijdsverloop studie voor elke lijn bestond uit genetisch identieke planten. Uitgesneden bladeren werden in 0,1 M Tris-HCl buffer (pH 6) geplaatst gedurende 1 uur, gevolgd door 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 pM radioactief gemerkte mesotrione gedurende 1 uur ('puls'), daarna kwart sterkte Murashige en Skoog (MS) zoutoplossing ('chase') voor 0 uur, 5 uur, 11 uur, 23 uur en 35 uur om de stofwisseling te voorkomen. Data werden geanalyseerd door niet-lineaire kleinste kwadraten regressieanalyse en te voorzien van een eenvoudige eerste orde curve te schatten een DT 50 afzonderlijk voor elk gekloond waterhemp populatie 12 .De MCR klonale lijn snel gemetaboliseerd mesotrione, terwijl de ACR en WCS klonale lijnen gemetaboliseerd mesotrione langzamer. De getoonde gegevens zijn tijdsverloop van slechts klonale lijn 5 voor elke waterhemp bevolking, die is gewijzigd ten opzichte van onze vorige papier 12 (Copyright door de American Society of Plant Biologen).
Figuur 2:. Primisulfuron-methyl metabolisme in MCR, ACR en WCS (12 HAT) Vertegenwoordiger omgekeerde fase HPLC chromatogrammen voor weggesneden waterhemp bladextracten (12 HAT) met 150 uM radioactief gemerkt primisulfuron-methyl (zoals beschreven in het protocol) van geleverde McLean County (MCR, A), Adams County (ACR, B), eennd Wayne County herbicide-gevoelige (WCS, C) populaties (tabel 1). Radioactieve piek met een retentietijd van 21,6 min bevat primisulfuron-methyl, zoals bepaald door vergelijking met een authentiek standaardmengsels. Pieken met kortere retentietijden waarschijnlijk polair, minder fytotoxische metabolieten van primisulfuron-methyl, zoals hydroxy-primisulfuron-methyl 8 of geglycosyleerde vormen van gehydroxyleerde metabolieten 5,6. De MCR populatie vertoonde een significante afname van de hoeveelheid bovenliggende primisulfuron-methyl opzichte ACR en WCS, die wordt gekwantificeerd als een lagere DT 50 voor MCR (figuur 3).
Figuur 3:. Tijd loop van primisulfuron-methyl metabolisme in weggesneden waterhemp bladeren weggesneden waterhemp bladeren (third-jongste blad; 2-3 cm) werden behandeld zoals beschreven in figuur 1 en het lopende onderzoek met mesotrione 12, behalve dat 150 pM radioactief gemerkte primisulfuron werd opgenomen als de "pols en bladeren werden geïncubeerd in MS zoutoplossing (" chase ") van 0 uur , 3 uur en 11 uur. Gegevens werden geanalyseerd door niet-lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse zoals eerder beschreven voor mesotrione metabolisme (figuur 1) 12. De MCR bevolking snel gemetaboliseerd primisulfuron-methyl (DT 50 = 13,6 uur), terwijl de ACR en WCS gemetaboliseerd primisulfuron-methyl langzamer (DT 50> 24 uur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De uitgesneden blad hierin beschreven werkwijze is eerder gebruikt in onderzoeken primisulfuron metabolisme in maïs bladeren 15, maar onze resultaten tonen aan dat dit protocol ook doeltreffend, nauwkeurig en reproduceerbaar te meten herbicide metabolisme in een tweezaadlobbige onkruidsoorten 12. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek vergeleken met hele plant studies is dat een uitgesneden blad onafhankelijk is van de hele plant translocatie patronen postemergence, systemische herbiciden of verschillen in herbicide opname onder installaties of populaties. Bovendien wordt de variabiliteit milieu gereduceerd omdat de uitgesneden blad assays worden uitgevoerd in een kweekkamer met een enkel blad geplaatst in een buis tegenover het bestuderen hele planten onder broeikasomstandigheden gekweekt. Een vegetatieve kloneringsstrategie was ook in onze methode voor het bestuderen mesotrione-resistentiemechanismen in MCR 12 de grote mate van genetische variatie binnen minimaliseren en tetween Amaranthus populatie 9. Genetische diversiteit binnen iel Amaranthus populaties wordt geïllustreerd door de hoeveelheid variabiliteit gedocumenteerd gehele plant reacties op verscheidene families van postemergence herbiciden 18. Bij het uitvoeren van tijdsverloop studies om nauwkeurige DT 50 s te bepalen en voor het opsporen van significante verschillen bij het vergelijken van DT 50 waarden tussen waterhemp bevolkingsgroepen 12, deze stappen (zoals beschreven in onze uitgesneden blad en vegetatieve klonen protocol) zijn van cruciaal belang voor het elimineren of verminderen van genetische en omgevingsfactoren variabiliteit.
Verschillende mechanismen bestaan in planten voor het verlenen herbicideresistentie 1,2. Zo kan waterhemp resistentie tegen ALS-remmende herbiciden doelwit-site basis 14 of niet-doelsoorten locatiegebaseerde 13. Stofwisseling van primisulfuron-methyl (figuur 3) tonen duidelijk de verschillen tussen twee ALS-resistente waterhemp bevolking, MCR en ACR (tabel 1). In combinatie met PCR-amplificatie en sequentie-analyse van herbicide target-terrein genen, zal de weggesneden blad test sterk op weg naar het identificeren of herbicideresistentie in waterhemp of andere tweezaadlobbige onkruiden door doelplaats of non-target-terrein mechanismen 2 wordt verleend.
Beperkingen van onze weggesneden blad werkwijze omvatten het onvermogen om te visualiseren of maatregel herbicide translocatie patronen gedurende de gehele plant, of bepalen of cellulaire of sub-cellulaire opslag mechanismen bestaan die verlenen non-target-site op basis weerstand in onkruid 2. Zoals eerder vermeld, was dit aspect ook als een voordeel bij het bepalen van exacte herbicide metabolisme prijzen mesotrione-resistente onkruidpopulaties 12, maar omgekeerd kan worden beschouwd als een nadeel bij het bestuderen systemische herbiciden die niet significant gemetaboliseerd in planten (dat wil zeggen niet-selectieve herbicides) zoals glyfosaat 2 of contact herbiciden die niet-selectief natuurlijke onkruidpopulaties, zoals paraquat en glufosinaat 19. Echter, als target-website mechanismen in eerste instantie niet worden onthuld dan verbeterde tarieven van de herbicide metabolisme worden doorgaans onderzocht komende 1,4, in het bijzonder bij het bestuderen van onkruid weerstand tegen HPPD remmende herbiciden zoals mesotrione 12, ALS-remmende herbiciden, zoals primisulfuron-methyl 13 , fotosysteem II-remmende herbiciden zoals atrazine 1,12, of acetyl-CoA-remmende herbiciden 4.
P450's zijn geassocieerd met ALS resistentie in een populatie Echinochloa 20, een iele grassoorten, alsook met mesotrione en ALS resistentie bij MCR 12,13. Een tweehuizig, dicotyl onkruid in verband met waterhemp, Palmer amaranth (A. palmeri), is vatbaar voor het ontwikkelen herbicideresistentie via verschillende mechanismen 1-3. Als meer herbicide-resistente onkruidpopulaties en species zijn gedocumenteerd wereldwijd 3, wordt de noodzaak voor het snel onderzoeken van herbicide metabolisme als potentiële resistentiemechanisme blijven toenemen. De uitgesneden blad aanpak, die verschillende, maar in verband met hele plant studies meestal gebruikt om herbicideresistentie mechanismen te onderzoeken is, is een nauwkeurig en waardevol instrument om te evalueren en te kwantificeren herbicide metabolisme in planten. Bijgevolg is het vermogen om deze analyses nauwkeurige, reproduceerbare werkwijzen zoals de uitgesneden leaf assay onderzoekers sterk helpen bij het bepalen van niet-doelwit-plaats resistentiemechanismen in zowel gras 4 en tweezaadlobbige onkruiden 12.
Toekomstige toepassingen van deze werkwijze kan ook het bepalen van tarieven herbicide metabolisme in tweezaadlobbige gewassen zoals sojabonen en katoen. Lopend onderzoek in ons laboratorium met herbicide-tolerante soja variëteiten is ook gebruik gemaakt van de weggesneden leaf aanpak. Echter, omdat soja een peulvrucht gewas met trifoliate bladeren, een 'weggesneden bladsteel' techniek is aangepast en uitgebreid, zodat elke drietallige blad radiolabeled herbicide kunnen opnemen via opname via de belangrijkste bladsteel (Skelton, Lygin en Riechers, ongepubliceerde gegevens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
