Introduction
Resistência a herbicidas em ervas daninhas apresenta uma séria ameaça para a produção mundial de alimentos e fibras 1,2. Atualmente, milhares de populações resistentes e biótipos de mais de cem espécies de plantas daninhas em todo o mundo têm sido documentadas e estudadas 3. Um importante mecanismo que confere resistência a herbicida em plantas, é a alteração de herbicidas genes e proteínas do local-alvo, incluindo as mutações genéticas que afectam a cinética de ligação proteína-herbicida ou amplificação do gene-alvo local 2. Desintoxicação metabólica via actividades elevados de mono-oxigenase citocromo P450 (P450) ou glutationa S -transferase (GST) enzimas é outro mecanismo que confere resistência a herbicidas em ervas daninhas, que é distinto de várias formas de mecanismos baseados em local de destino 2. Resistência à base metabólica tem ramificações significativas para se os custos de fitness planta (aka sanções aptidão) pode resultar dos mechanis de resistência ao herbicidam, bem como em relação ao potencial para um único mecanismo de desintoxicação para conferir resistência cruzada ou de vários herbicidas em populações de plantas daninhas 1,2,4. Geralmente, o metabolismo do herbicida em plantas pode ser dividida em três fases distintas 5. Fase I envolve a conversão herbicida ou de activação tal como hidroxilação P450-mediada de anéis aromáticos ou grupos alquilo, ou por N - ou reacções de desalquilação O-, levando ao aumento da polaridade e herbicida parcial desintoxicação 5,6. Recentemente introduzido grupos funcionais na Fase I podem proporcionar sítios de ligação para conjugação de glutationa reduzida por GSTs ou para glicose pelo glicosiltransferases UDP-dependentes na Fase II 5,7. Por exemplo, o principal metabolito inicial de primi sul furão-metilo no milho é hidroxi-primi sul furão-metilo 8, que pode ser posteriormente metabolizado para hidroxi-primisulfurão-glucósido (Fase II) e, em seguida, transportados para o vacúolo para armazenamento a longo prazo ou mais metabólica prócessamento 5,6 (Fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) é uma de difícil controle, dicot espécies de plantas daninhas anuais que dificulta a produção de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e algodão (Gossypium hirsutum) nos Estados Unidos. O alto grau de diversidade genética de waterhemp é facilitada pela sua biologia dióico e de longa distância vento polinização, e uma única planta waterhemp fêmea pode produzir até um milhão de sementes 9. Estas sementes são pequenas e facilmente se espalhar, o que naturalmente dotar waterhemp com um mecanismo de dispersão eficaz. Waterhemp exibe germinação contínua durante todo o período de crescimento 9, e suas sementes são capazes de germinar após vários anos de dormência. Waterhemp é uma planta C 4 que possui uma taxa de crescimento mais elevada do que a maioria das ervas daninhas de folha larga em sistemas de culturas arvenses 10. Além disso, numerosas populações waterhemp são resistentes a múltiplos famílias de herbicidas 3.
Uma população de waterhemp (designado MCR) de Illinois é resistente à 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tais como a mesotriona, bem como a atrazina e acetolactato sintase (ALS) -inhibiting herbicidas, incluindo primi sul furão-metilo , devido à não-alvo do local mecanismos baseados 12,13. Uma população diferente de waterhemp designado ACR 14, que é-primi sul furão-metilo resistentes (devido a uma mutação no gene de ALS) e atrazina-resistentes, mas sensível a mesotriona, e uma população waterhemp designado WCS 14 que é sensível à primi sul furão-metilo, mesotriona, atrazina e foram usadas em comparação com MCR na nossa pesquisa anterior 12 e experiências actuais (resumidas na Tabela 1). Estudos iniciais não detectaram alterações nos níveis de sequências genéticas HPPD ou expressão, ou reduzida absorção mesotriona, no MCRpopulação quando comparados com populações sensíveis à mesotriona 12. No entanto, estudos de metabolismo com plantas inteiras mostraram níveis significativamente mais baixos de pai mesotriona herbicida em comparação com o ACR MCR e WCS, o que se correlacionou com respostas fenotípicas anteriores para mesotrione 11,12.
| Waterhemp População | Abreviatura | Fenótipo para Mesotriona | Mecanismo de resistência mesotriona | Fenótipo para primisulfurão | Mecanismo de resistência primisulfurão |
| O Condado de McLean-Resistant | MCR | Resistente | Metabolismo * | Resistente | Metabolismo |
| Adams County-Resistant | ACR | Sensitive | - | Resistente | Mutação alvo local em ALS 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Sensível | - | Sensível | - |
* Mecanismos de resistência não-alvo do local, com excepção metabolismo reforçada, também podem conferir resistência mesotriona na população MCR 12.
Tabela 1: Descrição das populações waterhemp de Illinois utilizados neste estudo.
Além de determinar as taxas de metabolismo herbicida em plântulas waterhemp intactas, uma abordagem experimental diferente foi desenvolvido e utilizado na nossa investigação anterior para investigar o metabolismo usando um ensaio excisado waterhemp folha 12, bem como vários inibidores de P450 (por exemplo, tetcyclacis e malatião). Este método foi adaptado especificamente para waterhemp de um PREVIinvestigação ous do metabolismo primisulfurão-metil em milho extirpado deixa 15, uma vez que o ensaio de folha excisada ainda não haviam sido notificados para a realização de pesquisas metabolismo herbicida numa planta dicotiledônea. O inseticida malathion organophophosate tem sido frequentemente utilizado para in vivo e em pesquisa herbicida metabolismo vitro para indicar envolvimento P450 16. Por exemplo, a tolerância eo metabolismo rápido de mesotriona no milho são devido a hidroxilação do anel P450 catalisada, o que foi verificado quando malathion aumento da sensibilidade do milho para mesotriona 17. Da mesma forma, malatião inibiu o metabolismo do inibidor de primi sul furão-metilo ALS de milho em folhas excisadas 15. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada é que os dados gerados são independentes de padrões de translocação da planta inteira de, um factor importante a considerar quando se avalia o metabolismo de sistémicas, herbicidas pós-emergentes em plantas. Por conseguinte, este método permite que quantitativa emetabólica análises qualitativas para se concentrar em uma única folha tratada 12.
Uma estratégia de clonagem vegetativo, em combinação com o protocolo de folha excisada, foi previamente utilizado em waterhemp para conduzir estudos de metabolismo 12. Devido à natureza de cruzamento de waterhemp (plantas masculinas e femininas separadas), e elevado grau de diversidade genética dentro das espécies Amaranthus dióicas 9, este protocolo assegurado que waterhemp mudas geneticamente idênticas foram analisadas dentro dos experimentos longo do tempo. Este artigo demonstra a utilidade do método para a medição de folha excisada taxas de metabolismo herbicida em plantas daninhas dicotiledóneas um (waterhemp). A quantidade de herbicida-mãe remanescente foi determinada em cada ponto de tempo (Figura 1) por análise não linear de regressão dos mínimos quadrados, e foi adequado com uma curva de primeira ordem simples, a fim de estimar o tempo para 50% de herbicida absorvida para degradar ( DT 50). Representantecromatogramas da cromatograf ia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) são exibidos para ALS-resistentes e sensíveis ao waterhemp populações, que indicam o desaparecimento de herbicida-mãe e formação concomitante de metabolito polar (s) durante um estudo de tempo-curso (figura 2). O foco do nosso artigo é descrever e demonstrar a utilidade do ensaio da folha excisada em combinação com um método de clonagem vegetativa para determinar as taxas precisas e reprodutíveis do metabolismo de herbicidas em plantas dicotiledôneas, utilizando anel marcado (URL-14 C) herbicidas de maneira uniforme em três populações waterhemp que diferem nas suas respostas a planta inteira de HPPD- e inibidores da ALS herbicidas (Tabela 1).
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Protocol
1. Planta Material, condições de crescimento, e vegetativo Clonagem
Nota: Três populações waterhemp foram investigados nesta pesquisa: MCR (do Condado de McLean, IL), ACR (a partir de Adams County, IL), e WCS (a partir de Wayne County, IL) (Tabela 1).
- Coletar e suspender sementes waterhemp em 0,1 g L -1 de ágar: solução de água a 4 ° C durante pelo menos 30 dias para melhorar a germinação. Nota: Algumas populações waterhemp estão dormentes, mas este passo ajuda a superar a dormência de sementes e fazer germinar mais uniformemente.
- Germinar sementes de cada população waterhemp (como na Tabela 1) em 12 x 12 cm tabuleiros contendo um meio de envasamento em estufa.
- Manter condições de estufa em 28/22 ° C temperaturas dia / noite dentro de um fotoperíodo 16/8 hr 12.
- Suplemento de luz natural da estufa com luz de lâmpadas de halogeneto de mercúrio para fornecer um mínimo de 500 umol m -2 seg1 fóton no nível da planta dossel.
- Transplante mudas surgiu quando eles são 2 cm de altura em 80 cm 3 vasos em casa de vegetação.
- O transplante das plântulas em 950 cm 3 vasos contendo uma mistura 3: 1 de mistura de envasamento:: 1: 1 de solo: areia de turfa: quando mudas são 4 cm de altura. Adicionar 5 g de grânulos de libertação lenta de fertilizantes para cada vaso e misturar esta mistura com o solo.
- Cortar e remover o meristema apical contendo as três folhas mais novas a partir de 7 cm plantas altas para eliminar dominância apical.
Nota: Esta etapa garante que cada planta vai crescer o suficiente tiros três centímetros axilares para clonar. - Especiais de Consumo cinco rebentos axilares (3 cm de comprimento), quando mudas são cerca de 14 cm de altura de cada população waterhemp (como na Tabela 1). Remover a maior parte das folhas de rebentos axilares desses para diminuir a perda de água após a subsequente manuseamento, mas mantêm as duas folhas mais jovens para permitir um maior crescimento em cima do transplante.
- Transplante axilar atira em 80 cm 3 vasos (uma de mudas por vaso) em substrato, que é o mesmo meio utilizado para a germinação. Substrato deve ser saturado inicialmente até formar raízes na câmara de crescimento, em seguida, manter a umidade e coloque panelas constantes na câmara de crescimento durante 7 dias para estabelecer raízes.
Nota: As plantas são muito sensíveis, neste ponto e não deve ser salientado.- Manter o crescimento em condições de câmara 28/22 ° C temperaturas dia / noite dentro de um fotoperíodo 16/8 hr 12.
- Uma combinação de lâmpadas incandescentes e fluorescentes pode ser utilizada para fornecer a luz na câmara de crescimento e deve fornecer, pelo menos, 550? Mol m -2 s -1 fluxo de fotões em planta nível calote 12.
- Transplante de novo em 950 cm 3 potes (uma muda por vaso) containing uma mistura 3: 1 de mistura de envasamento:: 1: 1 de solo: turfa: areia (também incluem 5 g de liberação lenta grânulos de fertilizantes) quando as plantas clonadas são 4 cm de altura, em seguida, transferir de volta para o efeito estufa.
- Clonar as plantas uma segunda vez usando o mesmo método descrito acima (ou seja, repetir as etapas 1,5-1,8, e, em seguida, vá para o passo 2.1). Para um estudo típico curso de tempo, gerar clones a partir de, pelo menos, seis usinas independentes de cada população waterhemp e gravá-los como linhas MCR 1-6, 1-6 e ACR WCS 1-6.
- Estabelecer pelo menos seis "pai" linhas clonais distintos, a fim de repetir a experiência e adequadamente representar a variabilidade genética dentro de cada população waterhemp.
- Dependendo de quantos pontos serão analisados tempo, gerar sub-clones suficientes de cada um "pai" linha clonal para realizar um estudo curso de tempo.
2. Realização de um estudo de metabolismo com extirpado Waterhemp Leaves
- Extirpar o terceiro mais jovens folhas (2 a 3 cm de comprimento; incluem 0,5 cm de pecíolo ligado) quando as plantas waterhemp clonados são de 10 a 12 cm de altura para o metabolismo do herbicida ea DT 50 análise.
- Pecíolos Cut folha de cada planta waterhemp uma segunda vez (assegurando que 0,3 cm de pecíolo permanece) sob a água, e coloque estas extremidades cortadas em 1,5 ml frascos de plástico (uma folha por frasco) 15.
Nota: Cortando uma segunda vez sob a água impede a formação de bolhas de ar e conectar vasos do xilema.- Em primeiro lugar, submergir parcialmente folhas excisadas com corte pecíolo em tampão de pré-incubação (200 ul) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6) durante 1 h.
- Em segundo lugar, cada folha se mover para um novo frasco contendo 1,5 ml de um tampão de incubação (200 ul) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6), além de 150 fiM [URL-14 C] herbicida, e incuba-se a 28 ° C durante 1 h para permitir a absorção do herbicida nas folhas.
Nota: A C-14 e mesotriona
Nota: O efeito de inibidores metabólicos sobre o metabolismo do herbicida pode ser determinada, modificando passos 2.2.1 e 2.2.2. Adicionar 100 uM do inibidor para o tampão de pré-incubação e deixar incubar durante 2 horas, em seguida, transferir para tampão de incubação com o herbicida e adicionar novamente 100 uM de inibidor. Por exemplo, malathion e tetcyclacis inibir certas actividades do citocromo P450 em plantas 15-17. - Lave a parte imersa das folhas excisadas com água deionizada e transferir folhas excisadas para um quarto de força Murashige e Skoog (MS) solução sais (500 mL) para 0 h, 5 h, 11 h, 23 h, ou 35 horas, respectivamente, na câmara de crescimento durante o estudo do metabolismo curso de tempo.
- Colheita removendo licenças a partir da solução de incubação no ponto de tempo apropriado e moer manualmente cada folha do tecido em azoto líquido usando um tubo de polipropileno (15 ml) e pilão de vidro.
- Extrair herbicida marcado radioactivamente e os seus metabolitos de cada folha com 7 ml de acetona a 90% com um homogeneizador de tecidos laboratorial no mesmo tubo de polipropileno como acima. Lavar homogeneizador de tecidos com um adicional de 7 ml de 90% de acetona, e continuar a homogeneizar até que o tecido está completamente pulverizado (geralmente cerca de 2 min). Nota: 90% de acetona pode ser utilizado para a extracção da maior parte dos herbicidas a partir de tecidos de plantas. No entanto, se este método é possível extrair mais do que 90% dos compostos radiomarcados absorvidas, em seguida, 90% de metanol ou 90% de acetonitrilo pode ser substituído, tal como o solvente de extracção.
- Etiqueta 90% extractos de acetona (14 mL no total) e armazenar a 4 ° C durante 16 horas para permitir a extracção adicional para ocorrer.
Nota: Após esta extração de folhas tratadas, a quantidade de rad extraívelioactivity é tipicamente pelo menos 98% de compostos radiomarcados absorvidos pela folha tratada. Radioactividade não extractável (resíduos ligados) em folhas excisadas em média apenas 0,3% em todos os pontos de tempo no nosso estudo anterior 12, mas esta quantidade pode variar de acordo com o herbicida utilizado e ponto de tempo examinado. - Centrifugar as amostras a 5000 xg durante 10 min e concentrar-se os sobrenadantes a 40 ° C com um evaporador rotativo até um volume final de 0,5 ml é obtida. Transfira este volume para um tubo de plástico de 2,0 ml.
- Adicionar acetonitrilo: água (1: 1, por volume) para ajustar o volume final da planta extrai a 1,25 ml e re-centrifugar a 10000 xg durante 10 minutos para remover quaisquer partículas.
- Medir radioactividade total em uma alíquota de cada amostra (dpm ul -1) por espectroscopia de cintilação líquida (LSS) 12 e normalizar valores de [marcado com 14 C] compostos injectados para análise por HPLC (por exemplo, 10,000 total de dpm / amostra / run) para y-eixos será uniforme entre as amostras ao representar graficamente os resultados.
3. HPLC Análise do herbicida nas folhas excisadas Metabolismo
Nota: Resolva radioatividade extraível total de herbicidas em pai e herbicidas metabólitos utilizando as seguintes condições RP-HPLC 12.
- Realizar RP-HPLC com uma coluna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 um de tamanho de partícula, por HPLC analítica) com um caudal de 1 ml min -1 para a maioria dos herbicidas não-polares.
Nota: as colunas C 4 ou C 12 de RP-HPLC pode também ser utilizado para optimizar a separação do herbicida parente de seus metabolitos. Um filtro pré-coluna e / ou pré-coluna também pode ser usado para proteger e aumentar a vida útil da coluna RP.- Utilize a seguinte fase móvel para RP-HPLC: Eluente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) em água, e Eluente B 100% de acetonitrilo de grau HPLC.
Nota: metanol de grau HPLC, também pode ser utilizado como Elafluente B para a resolução de compostos mais polares e metabolitos, mas esteja ciente de que os tempos de retenção também pode mudar.
Nota: O perfil de eluição usado para resolver a mesotriona ou primi sul furão-metilo a partir dos seus metabolitos polares em nossa pesquisa 12 é a seguinte: Etapa 1, A: B (4: 1, v / v) a A: B (3: 2, v / v ) num gradiente linear (12 min); Passo 2, A: B (3: 2, v / v) a A: B (3: 7, v / v) num gradiente linear (5 min); Passo 3, A: B (3: 7, v / v) a A: B (1: 9, v / v) em um gradiente linear durante 2 minutos (num total de 19 min).
Nota: Gradientes isocráticas e passos podem ter de ser ajustadas com base nas propriedades físicas do material de origem, de modo a optimizar a resolução. - Seguir os passos de gradiente linear acima, com A: B (1: 9, v / v) A: B (4: 1, v / v) num gradiente linear (3 min) e A: B (4: 1, v / v) passo isocrático (durante pelo menos 2 min) para re-equilibrar a coluna RP antes de injectar o seguinte extracto 12.
- Utilize a seguinte fase móvel para RP-HPLC: Eluente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) em água, e Eluente B 100% de acetonitrilo de grau HPLC.
- Detectar e visualizar compostos radiomarcados com um fluxo Scintillation Analyzer. Registar a quantidade de herbicida-mãe restante em cada amostra como uma percentagem da radioactividade total em cada amostra (detectados e quantificados pelo fluxo de cintilação Analisador de acordo com as instruções do fabricante) para determinar as taxas de metabolismo herbicida em cada população waterhemp durante o curso do tempo.
4. Procedimentos Estatísticos
- Organizar tratamentos em um delineamento inteiramente ao acaso (ou outro arranjo adequado para análise estatística).
- Realizar duas experiências independentes com cada tratamento, composta de três réplicas biológicas para cada experimento. Os dois experimentos independentes incluem seis repetições biológicas no total. Se o efeito de experiência não é significativa (α = 0,05), combinar e analisar os dados de cada experiência independente. Se o efeito experimento é significativo, em seguida, analisar cada experiência em separado.
Nota: Inclua os primeiros três repetições biológicas in Experimento 1 e os próximos três repetições biológicas no Experimento 2. Cada repetição biológica representa um "pai" distinta linha clonal derivada de cada população (MCR 1-6, 1-6 ACR, e WCS 1-6), de modo que cada tempo- Curso de Análise utiliza plantas geneticamente idênticas. Os dois experimentos independentes incluem seis repetições biológicas no total, o que permite uma representação adequada da variabilidade genética ea determinação de um mediano DT 50 para cada população waterhemp. - Analisar os dados com análise não linear de regressão dos mínimos quadrados e encaixá-los com uma curva simples de primeira ordem, a fim de estimar a DT 50 s. A equação abaixo descreve o modelo:
- onde, neste modelo de Y representa a percentagem de herbicida-mãe remanescente no tempo t, μ i é a DT para cada 50waterhemp população i, eo parâmetro C 0 é o valor estimado do pai herbicida presente em t = 0 12.
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Representative Results
Foram detectadas grandes diferenças nas taxas de metabolismo mesotriona entre qualquer WCS ou ACR e MCR (Figura 1). Em cada ponto de tempo, MCR tinha metabolizado mesotriona mais rapidamente do que as duas populações sensíveis à mesotriona, WCS e ACR, que se correlaciona com a planta inteira de respostas fenotípicas anteriores 11. Ao clonar plantas suficientes a partir de uma única planta parental de cada população, análises de curso-tempo do metabolismo dos herbicidas estão uniforme e reprodutível devido à falta de variabilidade genética de cada curso de tempo 12. Por exemplo, o curso de tempo para o metabolismo mesotriona na linha clonal 5 12 é exibido na Figura 1. Um total de seis linhas clonais diferentes, derivado a partir de seis plantas parentais individuais, foram analisados a partir de cada população (Quadro 1) para determinar um tempo total mediano DT 50 valor, o que indica que o metabolismo mesotriona em MCR foi significativamente mais rápida (
Além de estudar os mecanismos de resistência em mesotriona MCR, um objectivo relacionado foi determinar o mecanismo de resistência a inibidores da ALS em MCR. Investigações anteriores demonstraram que uma sub-população derivada de MCR foi ALS resistentes mas não possuem uma mutação no gene de ALS local alvo, indicando um mecanismo de base de não-alvo local 13. Isto está em contraste com o ACR, a qual é resistente a ALS, devido a uma mutação no local alvo que confere uma enzima ALS menos sensível 14. A fim de TESt esta hipótese, o ensaio de folha excisada foi realizada com [URL-14 C] primi sul furão-metilo, um herbicida de inibidores da ALS da família de sulfonilureia. A área de pico de 14 C-primi sul furão-metilo em um cromatograma de HPLC representativo (tempo de retenção de cerca de 21,6 min) foi significativamente menor do que no MCR em ACR 12 e WCS no HAT (Figura 2). Além disso, dois metabolitos polares com tempos de retenção mais curtos do que primi sul furão-metilo foram detectados em extractos de folha excisada de todas as três populações (Figura 2). Embora as estruturas destes dois metabolitos polares não foram determinados neste estudo, a sua formação rápida é consistente com a hidroxilação do anel de primi sul furão-metilo 8 (metabolismo de fase I), seguida por conjugação de glicose 5 (metabolismo de fase II).
Em combinação com as análises qualitativas de metabolismo primisulfurão em MCR, ACR, e WCS (Figura 2), a quantidade-mãe remanescente de herbicida em cada ponto de tempo foi quantificada e utilizada para determinar os valores de DT 50 primi sul furão-metilo em MCR (13,6 horas), ACR (> 24 h), e WCS (> 24 h) (Figura 3). A significativamente menor valor DT 50 em MCR é consistente com o aumento do metabolismo como o principal mecanismo de resistência ALS nesta população, de acordo com pesquisas anteriores de planta inteira 13. É interessante notar, no entanto, os 50 valores para a DT primisulfurão em ACR WCS são semelhantes e ainda significativamente maior do que em MCR (Figura 3), apesar de ambos MCR e ACR visualizadas fenótipos resistentes aos inibidores de ALS (Tabela 1). O DT relativamente longo em ACR 50 é, possivelmente, porque não é necessária para metabolizar primisulfurão rapidamente, uma vez que tem um ACR enzima ALS menos sensíveis como o seu principal mecanismo de resistência 14. Em resumo, o ensaio de folha excisada waterhemp utilizados na nossa pesquisa rendeu qua valiosolitative dados e quantitativos e forneceu uma nova visão sobre os mecanismos de resistência à base de metabolismo no sentido de dois herbicidas diferentes em MCR, ACR, e WCS.
Figura 1:. Decurso no tempo do metabolismo mesotriona em waterhemp excisado folhas de populações vegetativamente clonadas folhas excisadas (folha terço mais novo; 2 a 3 cm de comprimento) a partir de mudas waterhemp (10 a 12 cm) foram vegetativamente clonadas de modo que cada curso de tempo estudo para cada linha consistia em plantas geneticamente idênticas. Folhas excisados foram colocados em tampão de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6) durante 1 h, seguido de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6), além de 150 fiM mesotriona radiomarcados durante 1 h ("pulse"), em seguida, um quarto de força de Murashige e Skoog (MS) solução sais ('perseguição') para 0 h, 5 h, 11 h, 23 h, 35 h e para permitir que o metabolismo ocorra. Data foram analisadas por análise não-linear de regressão dos mínimos quadrados e se encaixam com uma curva de primeira ordem para estimar a DT 50 separadamente para cada população waterhemp clonado 12 .A MCR linha clonal rapidamente metabolizado mesotriona, enquanto que as linhas clonais ACR e WCS metabolizado mesotriona mais devagar. Os dados apresentados são cursos de tempo de apenas uma linha clonal 5 para cada população waterhemp, que tem sido modificado a partir do nosso anterior artigo 12 (Direitos de autor pela sociedade americana de biólogos da planta).
Figura 2:. Metabolismo primi sul furão-metilo em MCR, ACR, e WCS (12 HAT) representativas de fase reversa cromatogramas de HPLC para os extractos excisadas waterhemp folha (12 HAT) fornecido com 150 uM marcado radioactivamente primisulfurão-metilo (como descrito no protocolo) de O Condado de McLean (MCR, A), Adams County (ACR, B), umnd Wayne County sensível ao herbicida (WCS, C) populações (Tabela 1). Pico radioactivo com um tempo de retenção de 21,6 min contém primi sul furão-metilo, tal como determinado por comparação com um padrão analítico autêntica. Os picos com tempos de retenção mais curtos são susceptíveis metabolitos polares, menos fitotóxicos de primi sul furão-metilo, tais como hidroxi-metil-8 primisulfurão ou formas glicosiladas de metabolitos hidroxilados 5,6. A população de MCR apresentado uma diminuição significativa na quantidade de pai primi sul furão-metilo em relação ao ACR e WCS, o qual é quantificado como uma DT inferior 50 para MCR (Figura 3).
Figura 3:. Curso de tempo do metabolismo primisulfurão-metil em folhas waterhemp excisadas folhas waterhemp cortado (third-mais novo em folha; De 2 a 3 cm) foram tratados como descrito na Figura 1 e a pesquisa anterior com mesotriona 12, excepto que 150 uM primisulfurão radiomarcado foi incluído como o "pulsar" e as folhas foram incubadas na solução de MS sais ("chase") para 0 hr , 3 horas e 11 horas. Os dados foram analisados por análise não linear de regressão dos mínimos quadrados, como descrito anteriormente para o metabolismo mesotriona (Figura 1) 12. A população de MCR rapidamente metabolizado primisulfurão-metilo (DT 50 = 13,6 h), enquanto ACR e WCS metabolizado primi sul furão-metilo mais lentamente (DT 50> 24 h).
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Discussion
O método extirpado-leaf aqui descrito foi usado anteriormente em pesquisar metabolismo primisulfurão no milho deixa 15, mas os nossos resultados demonstram que este protocolo é igualmente eficaz, preciso e reprodutível para medir o metabolismo do herbicida em um dicot 12 espécies de plantas daninhas. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada em comparação com os estudos da planta inteira de uma folha que é excisada é independente de padrões de translocação da planta inteira de pós-emergência de herbicidas sistémicos, ou diferenças de absorção do herbicida entre as plantas ou as populações. Além disso, a variabilidade ambiental é reduzido uma vez que os ensaios de folhas excisadas são conduzidas em câmara de crescimento, com uma única folha colocada em um tubo, em comparação com o estudo de plantas inteiras cultivadas em casa de vegetação. Uma estratégia de clonagem vegetativa também foi incluído no nosso método para o estudo de mecanismos de resistência a mesotriona em MCR 12 para minimizar o grande grau de variação genética dentro e sejatween Amaranthus populações 9. Diversidade genética em populações daninhas Amaranthus é ilustrado pela quantidade de variabilidade nas respostas documentada da planta inteira de várias famílias de herbicidas pós-emergência de 18. Quando a realização de estudos do curso de tempo para determinar precisos DT 50 s e para detectar diferenças significativas na comparação entre DT 50 valores entre populações waterhemp 12, essas etapas (conforme descrito em nossa folha excisada e protocolo de clonagem vegetativa) são fundamentais para eliminar ou reduzir genética e ambiental variabilidade.
Diferentes mecanismos existem em plantas para conferir resistência a herbicidas 1,2. Por exemplo, resistência a herbicidas waterhemp inibidores da ALS pode ser local de destino com base 14 ou local não-alvo com base 13. As taxas metabólicas de primisulfurão-metilo (figura 3) mostram claramente as diferenças entre waterh resistente a ALS doispopulações emp, MCR e ACR (Tabela 1). Em combinação com a amplificação PCR e análise de seqüência de herbicidas genes-alvo do site, o ensaio de folha excisada vai ajudar muito no sentido de identificar se a resistência a herbicidas em waterhemp ou outras ervas daninhas dicotiledôneas é conferida pelo no local alvo ou não-alvo do local mecanismos 2.
Limitações do nosso método de folha excisada incluem a incapacidade de visualizar ou medir os padrões de translocação de herbicidas em toda a fábrica, ou determinar se existem mecanismos de seqüestro de celulares e sub-celulares que conferem resistência com base não-alvo local em ervas daninhas 2. Como mencionado anteriormente, este aspecto foi também considerada uma vantagem quando a determinação da taxa de metabolismo herbicida precisos em populações de plantas daninhas mesotriona resistente 12, mas por outro lado pode ser considerado uma desvantagem quando se estuda herbicidas sistémicos que não são metabolizados de forma significativa em plantas (isto é, erva não-selectivoicides), tais como glifosato 2, ou entre em contato herbicidas que são não-seletiva em populações de plantas daninhas naturais, como o paraquat ou glufosinato 19. Taxas No entanto, se os mecanismos de site-alvo não são revelados inicialmente, em seguida, reforçada do metabolismo do herbicida normalmente são investigadas próxima 1,4, particularmente quando se estuda resistência de plantas daninhas a herbicidas inibidor da HPPD como mesotriona 12, herbicidas inibidores da ALS como primisulfurão-metil 13 , fotossistema II de inibição de herbicidas, tais como atrazina 1,12, ou de acetil-CoA-herbicidas inibidores 4.
P450 tem sido associada com a resistência do ALS numa população Echinochloa 20, um espécies de gramíneas daninhas, bem como com mesotriona e resistência ALS em MCR 12,13. Um, erva daninha dicot dióico relacionadas com waterhemp, Palmer amaranto (A. palmeri), também é propenso a desenvolver resistência ao herbicida através de vários mecanismos diferentes 1-3. À medida que mais populações e espécies de ervas daninhas resistentes a herbicidas estão documentados em todo o mundo 3, a necessidade de examinar rapidamente metabolismo herbicida como um mecanismo potencial de resistência irá continuar a aumentar. A abordagem folha excisada, a qual é distinta, mas relacionada com estudos da planta inteira de tipicamente utilizados para investigar os mecanismos de resistência a herbicidas, é uma ferramenta precisa e valiosa para avaliar e quantificar o metabolismo herbicida em plantas. Como resultado, a capacidade de realizar essas análises com métodos reproduzíveis, precisas, incluindo o ensaio de folha excisada vai ajudar muito os investigadores para determinar os mecanismos de resistência não-alvo do local em ambos os grama 4 e dicot 12 ervas daninhas.
Futuras aplicações deste método pode também incluir a determinação da taxa de metabolismo do herbicida em culturas de dicotiledóneas, tais como soja e algodão. Investigação em curso em nosso laboratório com variedades de soja tolerantes a herbicidas também tem utilizado o l excisadasabordagem EAF. No entanto, uma vez que a soja é uma leguminosa com trifólios, uma técnica de "extirpado pecíolo 'foi adaptado e desenvolvido para que cada folha trifoliolada pode absorver herbicida radiolabeled via absorção através da principal pecíolo (Skelton, Lygin, e Riechers, dados não publicados).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
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