Introduction
Otların herbisit direnci gıda ve lif 1,2 küresel üretim ciddi bir tehdit sunuyor. Şu anda yüzden fazla ot türünden dayanıklı nüfus ve biyotipten dünya çapında binlerce belgelenmiş ve 3 çalışılmıştır. Bitkilerde herbisit dayanıklılığı veren önemli bir mekanizma, herbisite protein bağlama kinetikleri veya hedef site gen 2 amplifikasyonu etkileyen genetik mutasyonlar da dahil olmak üzere herbisit hedef sitesi genler ve proteinler, değişikliktir. Sitokrom P450 monooksigenazı (P450) ya da glutation S -Transferase (GST) enzimlerin yüksek aktiviteleri ile metabolik detoksifikasyon hedef alan bazlı mekanizmalar 2 çeşitli şekillerde farklı olan bir yabani ot herbisid direnci kazandıran bir mekanizmadır. Metabolik tabanlı direnç (spor cezaları aka) bitki spor maliyetleri herbisit dayanıklılığı mekaniği kaynaklanabilecek olup önemli etkileri vardırm, hem de yabani popülasyonları 1,2,4 bölgesindeki çapraz veya birden fazla herbisit direnci vermek için, tek bir detoksifikasyon mekanizması potansiyeli açısından. Genel olarak, bitkilere herbisid metabolizması üç ayrı 5 ayrılabilir. Artan polarite ve kısmi herbisit detoksifikasyon 5,6 giden ya da O-dealkilasyon reaksiyonları - Faz I Bu aromatik halkaların ya da alkil gruplarının P450 aracılı hidroksilasyon, ya da N ile olduğu gibi, herbisit veya değiştiren aktivasyonunu içermektedir. Yeni ben GST'lerin azaltılmış glutatyon konjugasyon için bağlantı siteleri sağlayabilir veya Faz II 5,7 UDP-bağımlı glikosiltransferazların tarafından glikoza Faz fonksiyonel gruplar tanıttı. Örneğin, mısırda primisulfuron-metil baştaki metaboliti hidroksi-primisulfuron-glukosite (Phase II) ve daha sonra metabolize uzun süreli depolama ya da daha fazla metabolik için vaküole nakledilebilir hidroksi-primisulfuron-metil 8, olduğu profesyonelcessing 5,6 (Phase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) Birleşik Devletler mısır üretimini (Zea mays), soya fasulyesi (Glycine max) ve pamuk (Gossypium hirsutum) engelleyen bir zor kontrol, dikot yıllık yabancı ot türüdür. Waterhemp genetik çeşitliliğin yüksek derecede onun ikievcikli biyolojisi ve uzun mesafe rüzgar tozlaşma ile kolaylaştırılır ve bir tek kadın waterhemp bitki milyon tohumlar 9 kadar üretebilir. Bu tohumlar doğal olarak etkili bir dağılma mekanizmasına sahip waterhemp bağışlamak, hangi küçük ve kolayca yayılırlar. Waterhemp büyüyen sezon 9 boyunca sürekli çimlenme görüntüler ve tohumları uyuşukluk birkaç yıl sonra filizlenmeye edebiliyoruz. Waterhemp ekilebilir kırpma sistemlerinde 10 en geniş yapraklı yabancı otların daha yüksek büyüme oranını sahip bir C 4 bitkidir. Ayrıca, çok sayıda waterhemp popülasyonları birden fam dayanıklıdırherbisit 3 ilies.
Illinois waterhemp (MCR adlandırılır) popülasyonu 4-hidroksi-fenilpiruvat dioksigenaz (HPPD) bu tür mezotrion olarak inhibe edici herbisitler 11, hem de atrazin ve asetolaktat sintazı (ALS) için, herbisit inhibe edici primisulfuron-metil içeren dayanıklı , hedef dışı site bazlı mekanizmalar 12,13 nedeniyle. Ve atrazin dirençli ancak mezotrion duyarlı ve primisülfüron-metil duyarlıdır DTH 14 olarak adlandırılan bir waterhemp popülasyon (nedeniyle ALS geninin mutasyona) primisülfüron-metil-dirençli ACR 14 belirlenen waterhemp farklı bir popülasyon, mezotrion ve atrazin, bizim daha önceki araştırmalar 12 ve mevcut deneylerde MCR ile karşılaştırıldığında kullanıldı (Tablo 1 'de özetlenmiştir). İlk çalışmalar MCR içinde, HPPD gen dizisi veya ifade düzeylerinde değişikliklere, veya azaltılmış mezotrion alımını tespit etmediNüfus zaman mezotrion duyarlı nüfus 12 ile karşılaştırıldığında. Ancak, bütün bitkilerle metabolizma çalışmaları 11,12 mezotrion önceki fenotipik yanıtları ile ilişkili ACR ve WCS ile karşılaştırıldığında MCR ebeveyn mezotrion herbisit anlamlı derecede düşük düzeylerde gösterdi.
| Waterhemp Nüfus | Kısaltma | Mezotrion için Fenotip | Mezotrion Direnç Mekanizması | Primisülfüron için Fenotip | Primisülfüron Direnç Mekanizması |
| McLean İlçe Dayanıklı | MCR | Dayanıklı | Metabolizma * | Dayanıklı | Metabolizma |
| Adams County Dayanıklı | ACR | Sensitive | - | Dayanıklı | ALS 14 Hedef site mutasyonu |
| Wayne County Duyarlı | WCS | Duyarlı | - | Duyarlı | - |
* Geliştirilmiş metabolizma dışında hedef olmayan site direnç mekanizmaları, aynı zamanda MCR nüfus 12 mezotrion direnci kazandırabilmektedir.
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Illinois'den waterhemp popülasyonlarının tanımlanması.
Sağlam waterhemp fide herbisid metabolizması hızlarının belirlenmesine ek olarak, farklı deneysel yaklaşım geliştirilmiştir ve kesilmiş waterhemp yaprak tahlil 12 yanı sıra çeşitli P450 inhibitörlerinin (ör tetcyclacis malathion) kullanarak, metabolizmayı incelemek için önceki çalışmada kullanılan. Bu yöntem, bir önceki yaklaşımlardan waterhemp için özel olarak uyarlanmıştıreksize yaprak tahlili henüz bir dikot bitkide herbisit metabolizması araştırma için rapor edilmemiştir beri eksize mısırda primisulfuron-metil metabolizması lı soruşturma, 15 bırakır. Organophophosate insektisit malation sıklıkla in vivo kullanılmıştır ve in vitro herbisite metabolizması araştırma P450 tutulumu 16 gösterir. Örneğin, tolerans ve mısırdaki mezotrion ve hızlı metabolizma malation mezotrion 17 mısır duyarlılığı arttıkça doğrulanmıştır P450 katalizlenen halka hidroksilasyon, kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, malation kesilmiş mısır ALS inhibitörü primisulfuron-metil 15 yaprak metabolizmasını inhibe etti. Bitkilerde sistemik olarak, topraktan çıkma herbisidlerin metabolizmasını değerlendirirken eksize yaprak tekniğin önemli bir avantajı, üretilen veriler bütün bitki translokasyon desen bağımsız olmasıdır, önemli bir faktör dikkate. Sonuç olarak, bu yöntem, niceliksel izin verir veNitel metabolik tedavi edilen tek bir yaprak 12 odaklanmak analizleri.
Bir bitkisel klonlama stratejisi, eksize yaprak protokolü ile kombinasyon halinde, daha önce metabolizma çalışmaları 12 yapmak için waterhemp da kullanılmıştır. Nedeniyle waterhemp (ayrı erkek ve dişi bitkiler) ve ikievcikli amaranthus türlerinin 9 içindeki genetik çeşitliliğin büyük derecesi outcross doğası gereği, bu protokol genetik özdeş waterhemp fidanları zaman ders deneyler içinde analiz edildi sağlanmalıdır. Bu makalede, bir dikot ot (waterhemp) herbisid metabolizmasının oranlarını ölçmek için kesilmiş yaprak yöntemin kullanımını göstermektedir. Ana yabani ot öldürücü miktarı, (absorbe herbisitin% 50 indirgeme için zaman tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğrisi ile uygun olan doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile her bir zaman noktasında (Şekil 1) belirlendi ve geri kalan DT 50). Temsilciters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile ilgili kromatogramlar karşı ALS ve zaman-akışı çalışma sırasında ana yabani ot öldürücü ve kutupsal metabolit (ler) eşlik eden oluşumuyla kaybolması göstermektedir -duyarlı waterhemp popülasyonları (Şekil için gösterildi 2). Bizim derlemenin konusu düzgün olarak bir halka etiketli (URL- 14 ° C) herbisit kullanarak, tarif ve dikot bitkilerdeki herbisid metabolizmasının yeniden üretilebilir ve kesin hızını belirlemek için bitkisel klonlama yöntemi ile kombinasyon halinde kesilmiş yaprak testinin kullanılmasını göstermek için bunların bütün bitki yanıtlarında farklı üç waterhemp popülasyonları HPPD- ve ALS engelleyici herbisitler (Tablo 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki Malzeme Büyüme Koşullar ve Bitkisel Klonlama
Not: Üç waterhemp nüfusları bu araştırmada incelenmiştir: MCR (Adams County, IL itibaren), ACR ve WCS (McLean County, IL itibaren) (Tablo 1) (Wayne County, IL itibaren).
- Toplamak ve 0.1 g L-1 agar içinde waterhemp tohumları askıya: çimlenmeyi artırmak için en az 30 gün süre ile 4 ° C 'de su çözeltisi. Not: Bazı waterhemp popülasyonları uykuda, ama bu adım dinlenmesi aşmak ve tohum daha muntazam çimlenme yapmak için yardımcı olur.
- Bir serada saksı ortamı içeren 12 x 12 cm tepsilere (Tablo 1 'de olduğu gibi), her waterhemp nüfusun tohum çimlenme.
- Bir 16/8 saat fotoperyod 12 içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında sera koşulları koruyun.
- 500 umol m minimum sağlamak için cıva halide lambaları ışık serada doğal ışık Supplement -2 -1 foton akı.
- Onlar 80 cm serada 3 tencere içine 2 cm boyunda olduğunda Nakli fidan ortaya çıktı.
- 1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: kum fidanları 4 cm boyunda 950 cm 3 içeren 3 kap içine Nakli fidanları. Her tencereye yavaş salınımlı gübre granüllerinin 5 g ekleyin ve bu toprak karışımı ile karıştırın.
- Apikal hakimiyetini ortadan kaldırmak için kesin ve 7 cm boyunda bitkilerden üç genç yaprakları içeren sürgün apikal meristemi kaldırın.
Not: Bu adım her bitki klonlamak için yeterli 3 cm aksiller sürgünler büyüyecek olmasını sağlar. - Fideleri (Tablo 1 'de olduğu gibi), her waterhemp popülasyonundan boyunda yaklaşık 14 cm olan tüketim beş aksiller filizleri (uzunluğu 3 cm). Daha fazla kullanım sırasında su kaybını azaltmak için bu aksiller sürgünlerde yaprak çoğunluğu çıkarın, ancak nakli üzerine daha fazla büyümesini sağlamak için iki genç yaprakları korumak.
- Nakli Aksiller çimlenme için kullanılan aynı orta saksı ortamı içine 80 cm 3 tencere (saksı başına bir fide) içine vuruyor. Dolgu ortamı başlangıçta, doymuş bir büyüme odasında kökleri oluşana kadar, daha sonra kökleri oluşturmak için 7 gün boyunca bir büyüme odasında sabit bir nem ve yeri kaplar muhafaza edilmelidir.
Not: Bitkiler bu noktada çok hassastır ve stresli olmamalıdır.- Bir 16/8 saat fotoperyod 12 içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında büyüme odası koşulları koruyun.
- Akkor ve floresan ampuller bir arada büyüme odasında ışık sağlamak için kullanılabilir ve en az 550 ľmol m -2 bitki gölgelik düzeyinde 12 at sn -1 foton akı teslim etmelidir.
- 950 cm 3 tencere içine tekrar Nakli (saksı başına bir fide) c1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: 3 içeren gruptur klonlanmış bitkiler 4 cm boyunda olduğunda kum sonra tekrar seraya transfer (ayrıca 5 gr yavaş salınımlı gübre granülleri dahil).
- Yukarıda açıklanan aynı yöntemi kullanarak bitkilere ikinci kez Clone (yani tekrar adımlar daha sonra 1.8 1.5 ve 2.1 den adıma geçin). Tipik bir zaman ders çalışması için, her waterhemp nüfus en az altı bağımsız bitkilerden klonlar oluşturmak ve çizgiler MCR 1-6, 1-6 ve ACR WCS 1-6 olarak kaydeder.
- Deneyi tekrar ve yeterli her waterhemp nüfus içindeki genetik değişkenliği temsil etmek için en az altı farklı "üst" klonal hatları oluşturulması.
- Analiz edilecektir kaç zaman noktalarında bağlı olarak, zaman ders çalışma yürütmek için her bir "ebeveyn" klonal satırından yeterli alt klonları oluşturmak.
2. eksize Waterhem ile Metabolizma Çalışması yürütmekp Yapraklar
- Klonlanmış waterhemp bitkiler herbisit metabolizması ve DT 50 analiz için uzun boylu 10 ila 12 cm ne üçüncü en genç yaprakları (ekli petiole 0.5 cm dahil uzunluğu 2 ila 3 cm) tüketim.
- Her waterhemp bitkiden Kesme yaprak sapı ikinci kez su altında (yaprak sapı 0,3 cm kalmasını sağlayarak) ve Bu kesme 1,5 ml'lik plastik tüplere (şişe başına bir yaprak) 15 içine sona yerleştirin.
Not: su altında bir kez kesme biçimlendirilmiş ve odunsu doku damarları takmayı hava kabarcıkları önler.- İlk olarak, kısmi olarak 1 saat süre ile 0.1 M Tris-HCl (pH 6) ile ön inkübasyon tampon maddesi (200 ul) kesme Petiol ile birlikte eksize yaprakları bırakın.
- İkinci olarak, yeni bir 1.5 ml'lik bir şişe, 0.1 M Tris-HCl (pH 6) artı 150 uM [URL- 14C] herbisitin (200 ul), bir inkübasyon tampon içeren, her bir yaprak getirin ve 1 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin yaprak bitkilerine herbisit emme için izin verir.
Not: Her iki 14 C-mezotrion ve
Not: herbisit metabolizması metabolik inhibitörlerinin etkisi, adım 2.2.1 yukarıda 2.2.2 değiştirerek belirlenebilir. Ön kuluçka tamponu inhibitörün 100 uM ekleyin ve sonra herbisit ile kuluçkalama tamponuna aktarma ve yeniden 100 uM inhibitörü ekleyin, 2 saat süre ile inkübe edin. Örneğin, malation ve tetcyclacis bitkiler 15-17 belirli sitokrom P450 aktivitelerini inhibe eder. - Deiyonize su ile eksize yaprakları dalmış kısmını yıkayın ve çeyrek gücü Murashige ve Skoog (MS) tuzları solüsyonu (500 ul), sırasıyla 0 saat, 5 saat, 11 saat, 23 saat veya 35 saat için eksize yaprakları transfer zaman akışı metabolizması çalışma için bir büyütme odasında.
- Izin kaldırarak HasatEl ile inkübasyon, uygun bir zaman noktasında çözeltisi ve S, bir polipropilen tüp (15 mi) ve cam havan tokmağı kullanarak sıvı azot içinde, her bir yaprak dokusu öğütün.
- Radyo-etiketli herbisit ve yukarıdaki gibi aynı polipropilen tüp içinde laboratuar doku homojenizörü ile% 90 aseton 7 ml her yaprağın onun metabolitleri ekstrakte edin. % 90 aseton ek 7 ml doku homojenleştirici durulayın ve doku iyice (genellikle yaklaşık 2 dakika) toz haline gelene kadar homojenize devam eder. Not:% 90 aseton bitki dokularında en herbisitlerin ekstraksiyonu için de kullanılabilir. Bu yöntem emilen radyo-etiketli bileşikler% 90'dan daha fazla elde etmek için mümkün olan, ancak, daha sonra% 90 metanol veya% 90 asetonitril özütleme çözücüsü gibi ikame edilebilir.
- Ek çıkarma oluşması için Etiket% 90 aseton ekstreleri (14 ml toplam) ve mağaza da -4 16 saat C izin °.
Not: işlenmiş yaprakların bu çekimi sonrasında, özütlenebilir rad miktarıioactivity işlenmiş yaprak tarafından emilen radyo-etiketli bileşiklerden en az% 98, tipik olarak. Eksize yapraklarda olmayan ekstrakte radyoaktivite (bağlanmış artıklar) daha önceki çalışmada 12 tüm zaman noktaları arasında sadece% 0.3 ortalama, fakat bu miktar incelenmiştir kullanılan herbisitin ve zaman noktasına göre değişebilir. - 0.5 ml'lik bir nihai hacme kadar santrifüj 10 dakika boyunca 5000 x g'de örnekler ve bir döner buharlaştırıcı ile 40 ° C 'de konsantre süpernatanlar elde edilir. 2.0 ml bir plastik tüpe Bu hacim aktarın.
- Tesisinin son hacmi 1.25 ml özler ayarlayın ve yeniden santrifüj 10,000 x g'de 10 dakika boyunca herhangi bir partikülleri ortadan kaldırmak için: (1 hacim itibarı ile, 1) su: asetonitril ekleyin.
- (Dpm ul -1), sıvı sintilasyon spektroskopisi (LSS) 12 ile her bir örnek alınan bir alikot toplam radyoaktivite ölçülür ve miktarlarını normalize (örneğin HPLC analizi için enjekte bileşikler, 10,00 [14C-etiketli]Sonuçları grafik zaman 0 toplam dpm / numune / run) yani y-eksenleri örnekleri arasında muntazam olacaktır.
Kesilen Leaves Herbisit Metabolizma 3. HPLC Analizi
Not: Aşağıdaki RP-HPLC koşulları 12 ile ana herbisit ve herbisit metabolitleri içine toplam ekstrakte radyoaktivite giderin.
- 1 ml dk bir akış oranında bir C18 kolonu (4.6 x 250 mm, analitik HPLC için 5 um parçacık boyutu) olan, RP-HPLC gerçekleştirme -1 en polar olmayan herbisit.
Not: C 4 ya da Cı 12 RP-HPLC sütunları da onun metabolitleri ile ilgili ana yabani ot öldürücü ayrılmasını optimize etmek için kullanılabilir. Ön sütun filtresi ve / ya da koruyucu sütunu korunması ve RP kolonuna ömrünü uzatmak için kullanılabilmektedir.- Eluent A, su içinde% 0.1 formik asit (hac / hac) ve Taşıyıcı B% 100 HPLC-grade asetonitril: RP-HPLC için aşağıdaki mobil faz kullanın.
Not: HPLC-dereceli metanol El olarak kullanılabiliruent daha polar bileşikleri ve metabolitleri çözülmesi için B, ama tutma süreleri de değişebilir unutmayın.
Not: araştırmamızda 12 kendi polar metabolitlerden mezotrion ya primisulfuron-metil çözmek için kullanılan elüsyon profili: Adım 1, A: B (4: 1, hac / hac): B (3: 2, hac / hac ) doğrusal gradyanı (12 dakika); B: A: (2, hac / hac 3): Aşama 2, bir B (3: 7, v / v) bir doğrusal gradyan (5 dakika); Aşama 3, A: B: A: (7, hac / hac 3) B: 2 dakika boyunca lineer gradyanı (9: 1, v / v) (19 dakika toplam içeren) karıştırılır.
Not: Degradeler ve İzokratik adımlar çözünürlüğünü optimize etmek için ana malzemenin fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerekebilir. - B (4: 1, v / v) bir doğrusal gradyan (3 dakika) ve a: A: (9, h / h 1) B: A, yukarıda doğrusal gradyan adımları B (4: 1, v / h) en az 2 dakika izokratik aşama () aşağıdaki özü 12 enjekte etmeden önce RP sütunu yeniden dengelemek için.
- Eluent A, su içinde% 0.1 formik asit (hac / hac) ve Taşıyıcı B% 100 HPLC-grade asetonitril: RP-HPLC için aşağıdaki mobil faz kullanın.
- Algılama ve Akış sintigrafisinde ile radyoaktif işaretli bileşikler görselleştirmekllation Analyzer. Her bir numunedeki toplam radyoaktivite yüzdesi olarak, her bir numune içinde Kalan üst herbisit miktarını kaydedin (algılanabilir ve üreticinin talimatlarına uygun olarak akış Sintilasyon Analiz cihazı ile ölçülmüştür) bir zaman boyunca, her waterhemp popülasyonda herbisit metabolizmasının oranlarını belirlemek için.
4. Statistik prosedürler
- Bir tesadüf tasarım (ya da istatistiksel analizler için başka uygun bir düzenleme) tedavileri düzenleyin.
- Her bir deney için üç biyolojik çoğaltır oluşan her tedavi, iki bağımsız deneyler yapın. İki bağımsız deney toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. Deney etkisi (α = 0.05) anlamlı olmayan ise, her bir bağımsız deneyde verileri birleştirmek ve analiz. Deney etkisi önemli ise, o zaman ayrı ayrı deney analiz.
Not: İlk üç biyolojik çoğaltır dahil in 1 Deney ve Deney 2'de önümüzdeki üç biyolojik çoğaltır Her biyolojik çoğaltmak (MCR 1-6, ACR 1-6 ve 1-6 WCS) Her nüfus türetilen klonal çizgi böylece ayrı bir "üst" temsil her zaman- Tabii analizi genetik özdeş bitkiler kullanır. Iki bağımsız deney her waterhemp nüfus için bir medyan DT 50 genetik değişkenliği ve kararlılık, yeterli temsili sağlayan toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. - Doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile verileri analiz ve DT 50 s tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğri ile uyum. Aşağıdaki denklem modeli anlatılmaktadır:
- nerede bu model y t zamanında kalan ebeveyn herbisit yüzdesini temsil, μ i her DT 50waterhemp nüfusu i ve parametre C 0 t = 0 12 de ana herbisit mevcut tahmini tutardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mezotrion metabolizma oranlarında büyük farklılıklar WCS veya ACR ve MCR (Şekil 1) ya arasında tespit edildi. Her zaman noktasında, MCR daha hızlı bir şekilde daha önceki bütün bitki fenotipik yanıtların 11 ile ilişkilidir, iki mezotrion-hassas grupların, WC'ler ve ACR, daha mezotrion metabolize olan. Her nüfus tek bir ebeveyn bitkiden yeterince bitkiler klonlama yoluyla, herbisit metabolizması zaman ders analizleri nedeniyle her zaman ders 12 içindeki genetik değişkenlik eksikliği üniforma ve tekrarlanabilir. Örneğin, klonal çizgi 5 12 mezotrion metabolizması için zamana Şekil 1 'de gösterilir. Altı farklı klonal hatları toplam altı ayrı ayrı üst bitkilerden türetilen, her popülasyon (Tablo 1) için analiz edilmiştir genel medyan DT belirlenmesi MCR o mezotrion metabolizmayı belirtilen 50 değer önemli ölçüde daha hızlı idi (
MCR in mezotrion direnç mekanizmalarının incelenmesi ek olarak, ilgili bir amacı, MCR ALS inhibitörleri direnç için bir mekanizma ortaya koymaktır. Önceki araştırmalar, MCR türetilmiş bir alt-popülasyonunun ALS dirençli fakat hedef olmayan site göre mekanizma 13 gösteren, ALS hedef site geninde bir mutasyon sahip olmadıklarını gösterdi. Bu durum, daha az duyarlı ALS enzim 14 sağlayan hedef alan mutasyonunun, ALS dayanıklıdır ACR ile tezat oluşturur. Tes içint Bu hipoteze eksize yaprak deneyi [URL- 14C] primisulfuron-metil, sülfonilüre ailesinin bir ALS inhibe edici bir herbisit ile gerçekleştirilmiştir. Temsili bir HPLC kromatogramı 14 C-primisulfuron-metil pik alanı (yaklaşık 21.6 dakika alıkoyma süresi) 12 HAT (Şekil 2), en ACR ve tuvaletler daha MCR önemli ölçüde daha küçüktü. Buna ek olarak, primisülfüron-metil, daha kısa tutma süreleri olan iki kutuplu metabolitleri her üç popülasyonlar (Şekil 2), çıkarılan yaprak ekstreleri tespit edilmiştir. Bu iki kutup metabolitlerin yapıları bu çalışmada tespit edilmemiştir rağmen, hızlı oluşum glikoz çekimleri 5 (Faz II metabolizma) takip primisulfuron-metil 8 (Faz I metabolizma) halka hidroksilasyonu ile tutarlıdır.
MCR, ACR ve WCS içinde primisülfüron metabolizmasının kalitatif analizlerde ile birlikte (Şekil 2), tutarıHer bir zaman noktasında kalan ebeveyn herbisit ölçülmesi ve MCR (13.6 saat), ACR (> 24 saat) primisulfuron-metil DT 50 değerlerini belirlemek için kullanıldı ve DTH (> 24 saat) (Şekil 3). MCR anlamlı olarak kısa DT 50 değeri, önceki bütün bitki araştırması 13 ile uyum içinde bu popülasyonda ALS direnci önemli bir mekanizma olarak artan metabolizma ile tutarlıdır. MCR ve ACR hem ALS-inhibitör dirençli fenotipleri (Tablo 1) gösterilmesine rağmen Ancak ilginç bir ACR ve tuvaletler bölgesindeki primisulfuron DT 50 değerleri, önemli ölçüde daha uzun MCR (Şekil 3) daha henüz benzerdir. ACR ana direnci mekanizması 14 gibi daha az duyarlı ALS enzim vardır çünkü, hızlı bir şekilde metabolize etme primisülfüron gerekli değildir, çünkü ACR nispeten uzun DT 50 olasılıkla. Özetle, bizim araştırma kullanılan kesilmiş waterhemp yaprak tahlili değerli nereye vermiştirlitative ve nicel veriler ve MCR, ACR ve WCS iki farklı herbisit karşı metabolizma tabanlı direnç mekanizmalarına yeni anlayışlar sağladı.
Şekil 1:. Eksize waterhemp içinde mezotrion metabolizmasının zaman seyri vejetatif klonlanmış popülasyonlardan yaprak kesilen yapraklar (üçüncü genç yaprak, uzunluğu 2 ila 3 cm) waterhemp fideleri (10 cm ila 12) için vejetatif olarak klonlandı, her zaman akışı ve böylece her bir hat için bir çalışma genetik özdeş bitki oluşuyordu. Kesilen yaprak ('yanıp') 1 saat süre ile 0.1 M Tris-HCl (pH 6) artı 150 uM radyoaktif olarak işaretlenmiş mezotrion, ardından 1 saat boyunca 0.1 M Tris-HCl tamponu (pH 6) yerleştirilmiştir, daha sonra çeyrek kuvvetli Murashige ve Skoog (MS) tuzları çözeltisi 0 saat, 5 saat, 11 saat, 23 saat ve 35 saat ("av"), metabolizma oluşmasına izin vermek. DaACR ve WCS klonal hatları mezotrion metabolize olurken ta, doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile ve 12 hayranlarıyla MCR klonal çizgi hızla mezotrion metabolize her klonlanmış waterhemp nüfus için ayrı ayrı DT 50 tahmin etmek basit bir birinci dereceden eğri uyması edildi daha yavaş. Gösterilen veriler (Bitki Biyologlar American Society Telif) önceki kağıdı 12 modifiye edilmiş her waterhemp nüfus, sadece klonal çizgi 5'ten zaman dersleridir.
Şekil 2:. MCR, ACR, ve tuvaletler (12 HAT) 'de primisulfuron-metil metabolizması Örnek ters-faz HPLC kromatogramları 150 uM (Protokol tarif edildiği gibi) radyo-etiketlenmiş primisulfuron-metil arasından ile birlikte kesilmiş waterhemp yaprak ekstreleri (12 HAT) için McLean County (MCR, A), Adams County (ACR, B), birnd Wayne County herbiside duyarlı (DTH, C) popülasyonları (Tablo 1). Otantik analitik bir standart ile mukayese edilerek tayin edildiği 21.6 dakikalık bir tutma süresi olan radyoaktif pik, primisülfüron-metil içerir. Daha kısa tutma süresi ile pikleri Böyle hidroksi primisulfuron-metil 8 ya da hidroksile edilmiş metabolitlerin 5,6 glikosile edilmiş formları gibi primisulfuron-metil muhtemel polar az fitotoksik metabolitleri sözkonusu olmaktadır. MCR nüfusu MCR için daha düşük bir DT 50 (Şekil 3) olarak elde edilmiştir ACR ve tuvaletler için üst primisulfuron-metil nisbetle miktarında önemli bir azalma göstermiştir.
Şekil 3:. Eksize waterhemp yapraklarda Kesilen waterhemp yaprak primisulfuron-metil metabolizmasının zaman seyri (third- genç yaprak; Şekil 1 ve mezotrion 12 ile önceki araştırmalar tarif edildiği gibi "pulse 've yapraklar 0 saat MS tuzları çözeltisi (" av ") içinde kuluçkalanmıştır olarak bu 150 uM radyoaktif olarak işaretlenmiş primisülfüron dahil olması hariç olmak üzere 2) cm ila 3, tedavi edildi , 3 saat ve 11 saat. Mezotrion metabolizması (Şekil 1), 12 daha önce tarif edildiği gibi veriler doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile analiz edilmiştir. ACR ve WCS daha yavaş (DT 50> 24 saat) primisulfuron-metil metabolize ederken MCR nüfus hızla, primisulfuron-metil (DT 50 = 13.6 saat) metabolize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen kesilmiş yaprak yöntemi, mısır yaprak 15 içinde primisülfüron metabolizma araştırma, daha önce kullanılmış olan, ancak sonuçlar, bu protokol, aynı zamanda, bir dikot zararlı bitki türleri 12 herbisid metabolizmasını ölçmek için, etkili, uygun ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bütün bitki çalışmalarla karşılaştırıldığında kesilmiş yaprak tekniğin önemli bir avantajı, bir kesilmiş yaprak bütün bitki translokasyon toprak yüzeyine çıkma sonrası kalıpları, sistemik herbisitler bitkilerin veya popülasyonlar arasında herbisit uptake farklar bağımsız olmasıdır. Eksize yaprak deneyleri, sera koşulları altında yetiştirilmiştir tüm bitkiler okuyan ile karşılaştırıldığında bir tüpe yerleştirilir Tek bir yaprak ile, bir büyütme odası içinde yürütülmektedir Ek olarak, çevresel değişkenlik azalır. Bir bitkisel klonlama stratejisi de içindeki genetik varyansın büyük derecede en aza indirmek ve olmaya MCR 12 mezotrion-direnç mekanizmaları çalışmak için bizim yönteminde dahilara Amaranthus popülasyonları 9. Otlu Amaranthus popülasyonları içinde genetik çeşitlilik topraktan çıkma herbisit 18 çeşitli ailelerin bütün bitki yanıtları belgelenen değişkenlik miktarı ile görüntülenmiştir. Doğru DT 50 s belirlemek için zaman kurs çalışmaları yürütürken ve önemli farklılıklar tespit için waterhemp popülasyonları 12 arasında DT 50 değerleri karşılaştırırken, bu adımlar (bizim eksize yaprak ve bitkisel klonlama protokolde belirtildiği gibi) ortadan kaldırılması ya da genetik ve çevresel azaltılması için kritik olan değişkenliği.
Farklı mekanizmalar herbisid direnci kazandıran 1,2 için bitki bulunmaktadır. Örneğin, ALS inhibe eden herbisitlere waterhemp direnci, hedef site olabilir 14 göre ya da 13, hedef olmayan sitesini göre. Primisulfuron-metil (Şekil 3) Metabolik oranları açıkça iki ALS dayanıklı waterh arasındaki bu farklılıklar göstermektediremp popülasyonları, MCR ve ACR (Tablo 1). PCR amplifikasyonu ve herbisit hedef sitesi genlerin dizi analizi ile kombinasyon halinde, kesilmiş yaprak deney büyük waterhemp veya diğer dikot otlara herbisid direnci, hedef sitesi veya hedef olmayan site mekanizmaları 2 ile verilen olup olmadığının belirlenmesi yönelik yardımcı olacaktır.
Hücresel veya alt-hücresel haciz mekanizmalar yabani otların 2 hedef olmayan site bazlı direnç kazandıran varsa bizim eksize yaprak yöntemi Sınırlamalar görselleştirmek veya tüm bitki boyunca herbisit translokasyon desenleri ölçmek veya belirlemek için yetersizlik sayılabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu yönü, mezotrion dayanıklı yabani popülasyonları 12 hassas herbisit metabolizması oranlarını tespit bir avantaj olarak kabul edildi, fakat bitkiler önemli ölçüde metabolize edilmeyen sistemik herbisitler incelenirken tersine (yani, seçici olmayan bir bitki bir dezavantajı kabul edilebiliricides) bu tür paraquat veya glufosinat 19 gibi doğal yabani popülasyonları olmayan seçici glifosat 2, ya da kontak herbisitler gibi. Herbisit metabolizmasının hedef sitesi mekanizması başlangıçta ortaya değildir, ancak daha sonra geliştirilmiş oranlar tipik olarak, özellikle bu tür mezotrion 12 gibi, HPPD önleyici herbisitlere ot direnci okuyan bir sonraki 1,4 incelenmiştir, örneğin primisulfuron-metil 13 gibi ALS-inhibe edici herbisitler örneğin atrazin 1,12, veya fotosistem II-inhibe edici herbisitler herbisitler 4 asetil-CoA-inhibe.
P450 MCR 12,13 ALS bir Echinochloa nüfus 20 direnç, bir işe yaramaz ot türünün yanı sıra ile mezotrion ALS direnci ile ilişkilidir. Waterhemp ilgili bir ikievcikli, dikot ot, Palmer amarant (A. Palmeri), çeşitli mekanizmalarla 1- üzerinden de gelişmekte olan herbisit direnci eğilimliDaha fazla herbisit dirençli yabani ot popülasyonları ve türlerin dünyada 3 çapında belgelenmiştir gibi 3.., Hızla potansiyel bir direnç mekanizması olarak herbisit metabolizmasını incelemek için ihtiyaç artmaya devam edecek. Farklı ama genelde herbisit direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılan tüm fabrika çalışmalarına ilgilidir eksize yaprak yaklaşımı, değerlendirmek ve bitkilerde herbisit metabolizmasını ölçmek için doğru ve değerli bir araçtır. Sonuç olarak, yeteneği büyük ölçüde hem ot 4 ve dikot 12 otların olmayan hedef site direnç mekanizmalarını belirleyen araştırmacılar yardımcı olacaktır eksize yaprak tahlili de dahil olmak üzere, doğru, tekrarlanabilir yöntemlerle bu analizleri yapmak.
Bu yöntemin gelecek uygulamalar, soya fasulyesi ve pamuk gibi dikot bitkilerinde herbisit metabolizmasının oranlarını tespit içerebilir. Herbisit toleranslı soya çeşitleri ile laboratuvarımızda devam eden araştırmalar da eksize l kullanmıştırEAF yaklaşım. Ancak, soya fasulyesi üç yapraklı yapraklı bir baklagil kırpma beri, bir 'eksize sapı' tekniği adapte edilmiştir ve her üç yapraklı yaprak ana petiole (Skelton, Lygin ve Riechers, yayınlanmamış veri) aracılığıyla alımı yoluyla radyoaktif işaretli herbisit absorbe böylece gelişti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
