Abstract
स्टेम सेल म्यूटेशन उपाय करने की क्षमता, एक रासायनिक संभावित कैंसर को जन्म दे कि म्यूटेशन के लिए प्रेरित कर सकते हैं, और किस हद तक एक महत्वपूर्ण सेल की आबादी में यों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एक्स से जुड़े ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज जीन में स्टेम सेल म्यूटेशन यों के लिए एक एंजाइमी परख का उपयोग पहले से सूचित किया गया है। एक यह तरीका एक है कि पैदावार एक प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ sectioned ऊतक के जमे हुए वर्गों और ऊष्मायन की तैयारी की आवश्यकता है कोशिकाओं कार्यात्मक ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (G6PD) एंजाइम का उत्पादन करता है, तो नीला रंग। यदि नहीं, तो कोशिकाओं श्वेताभ दिखाई देते हैं। हम polyvinyl शराब की जगह में इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर) माध्यम का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण को संशोधित किया है। यह, पीएच माप की सुविधा G6PD धुंधला घटकों के solubilization बढ़ जाती है और G6PD एंजाइम का प्रसार प्रतिबंधित करता है। एक उत्परिवर्तन एक स्टेम सेल में होने वाले प्रदर्शन करने के लिए, पूरे तहखाना G6PD एंजाइमी की कमी चाहिएगतिविधि। एक स्टेम सेल बंदरगाहों तभी एक प्ररूपी G6PD उत्परिवर्तन कब्रगाह में संतान के सभी G6PD enzymatic गतिविधि की कमी होगी। एक स्टेम सेल उत्परिवर्तन के साथ तहखाने की पहचान करने के लिए, लगातार चार आसन्न जमे हुए वर्गों (एक स्तर) 7 माइक्रोन मोटाई में काट रहे थे। आसन्न कटौती करने का यह दृष्टिकोण एक ही उत्परिवर्तित तहखाना आसन्न वर्गों में मनाया जाएगा के बाद से एक तहखाना पूरी तरह से उत्परिवर्तित था कि रचना प्रदान करता है। 50 से अधिक माइक्रोन अलग थे कि ऊतकों के नमूनों के साथ स्लाइड माउस प्रति> 10 4 तहखाने की कुल आकलन करने के लिए तैयार थे। उत्परिवर्तन आवृत्ति एक इलाज के समूह में जंगली प्रकार (नीला) के तहखाने की संख्या से ÷ मनाया उत्परिवर्तित (सफेद) तहखाने की संख्या है।
Introduction
पेट के कैंसर का डीएनए को नुकसान पहुंचा सकता है कि पर्यावरण एजेंटों और आहार घटकों के लिए जोखिम शामिल है और (जैसे एपीसी) ट्यूमर शमन जीन में म्यूटेशन ओंकोजीन में दैहिक म्यूटेशन को सक्रिय करने के लिए (जैसे, एसएस catenin) या निष्क्रिय उत्पादन करने के लिए सोचा है। यह इन महत्वपूर्ण म्यूटेशन colonic स्टेम कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि माना जाता है। क्योंकि colonic उपकला की अनूठी तहखाना वास्तुकला की, यह पेट के कैंसरजनन के साथ जुड़े रसायनों के लिए जानवरों को प्रकाश में लाने के बाद पेट में स्टेम सेल म्यूटेशन को मापने के लिए संभव है। म्यूटेशन एक तहखाना के भीतर सभी कोशिकाओं में उपस्थित रहेंगे रूप में कई एक्स से जुड़े एंजाइमों, स्टेम कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि परिवर्तन के लिए संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं।
इससे पहले, एक प्रक्रिया चूहों में पेट के ट्यूमर को उत्पन्न कि रसायन भी एक्स से जुड़े ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (G6PD) जीन में उत्परिवर्तन के विश्लेषण के माध्यम से पेट में दैहिक स्टेम सेल म्यूटेशन उत्पन्न प्रदर्शन है कि प्रकाशित किया गया था। 1-3विधि किसी भी चयन दबाव के बिना colonic स्टेम कोशिकाओं में यादृच्छिक दैहिक म्यूटेशन की घटनाओं quantifies। प्रक्रिया का इलाज किया और नियंत्रण चूहों से unfixed जमे हुए पेट के वर्गों के उत्पादन और कार्यात्मक G6PD गतिविधि का उत्पादन है कि कोशिकाओं से रहित तहखाने की पहचान शामिल है। सफेद दिखाई देते हैं जो इन उत्परिवर्तित तहखाने, उत्परिवर्तन भी एक उत्परिवर्तित G6PD जीन को शरण देने संतान को जन्म दे दिया है कि एक स्टेम सेल में होने वाले संकेत मिलता है। एंजाइमी परख में, G6PD कमी उत्परिवर्ती तहखाने नाइट्रो नीले tetrazolium (एनबीटी) की कमी के लिए आवश्यक है, जो ग्लूकोज-6-फॉस्फेट, oxidize नहीं कर सकते। G6PD एंजाइम कार्यात्मक हो गया है, धुंधला मिश्रण में एनबीटी एंजाइम और नीले "धुंधला" कोशिकाओं के स्थान पर जमते, अघुलनशील formazan और अवक्षेप के लिए कम है। G6PD म्यूटेंट हैं कि कोशिकाओं नीले दाग जंगली प्रकार तहखाने के विपरीत श्वेताभ रहते हैं। इस पद्धति का एक "शून्य" phenotype है कि म्यूटेशन के उपाय। एन क्योंकिzymes, ऐसे G6PD के रूप में, वर्गों एक जलीय घोल में रखा जाता है, तो एक unfixed ऊतक खंड पर कोशिकाओं के बाहर फैलाना कर सकते हैं, यह विश्लेषण करने की ऊतक वर्गों में एंजाइम को स्थिर करने के लिए आवश्यक है। 4 में एंजाइम का स्थिरीकरण ऊतक G6PD enzymatic प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक छोटे अभिकर्मक अणुओं के प्रसार के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए।
हम मूल प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन के एक नंबर दिया गया है। महत्वपूर्ण एंजाइमी धुंधला के लिए मध्यम पीएच नियंत्रण और परख में इस्तेमाल किया घटकों के solubilization सुविधा है, जो इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर), के लिए polyvinyl शराब से बदल दिया गया है। प्रत्येक ऊतक अनुभाग G6PD प्रतिक्रिया मिश्रण का एक ही मात्रा प्राप्त इतना है कि स्टील वाशर का बना 0.5 मिलीलीटर कुओं - धुंधला 0.4 का उपयोग किया जाता है। एक प्रक्रिया के लिए बिना colonic ऊतक का एक बड़ा नमूना प्रदान करता है कि एक imaged अनुभाग में तहखाने की संख्या का अनुमान करने के लिए विकसित किया गया था,मैन्युअल> प्रत्येक पेट के लिए 10 5 तहखाने गिनती करने के लिए। आसन्न 7 माइक्रोन ऊतक वर्गों का विश्लेषण संभावित धुंधला कलाकृतियों को कम कर देता है, जो एक से अधिक स्लाइड, पर एक उत्परिवर्ती तहखाना के दृश्य देता है। ये परिवर्तन प्रक्रिया को और अधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाते हैं।
इस संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम, मूषक में एक प्रसिद्ध पेट के कैसरजन azoxymethane को C57BL / 6 चूहों के प्रदर्शन के बाद colonic स्टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्तन आवृत्ति मात्रा निर्धारित किया है। 5-7
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Protocol
प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और पशु के एथिकल ट्रीटमेंट पिट्सबर्ग IACUC विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल # 1,104,674) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
G6PD धुंधला मिश्रण के 1. तैयारी
नोट: इस प्रकार के रूप में प्रत्येक अभिकर्मकों के अंतिम एकाग्रता है कि सुनिश्चित करना; 5 मिमी ग्लूकोज-6-फॉस्फेट (G6P); 2 मिमी NADP, 5 मिमी 2 MgCl, 0.35 मिमी 1-methoxy-5-methylphenazinium मिथाइल सल्फेट (MMPMS) और 0.8 मिमी एनबीटी। प्रारंभिक एकाग्रता एक 40 मिलीलीटर अंतिम मात्रा के लिए निकाली थी प्रत्येक अभिकर्मक के लिए 1,8,9। समाधान हौसले से तैयार है और प्रत्येक दिन का इस्तेमाल किया गया।
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अक्टूबर माध्यम के 35 मिलीलीटर के लिए 200 मिमी 7.4 पीएच फॉस्फेट बफर (पंजाब) के 2 मिलीलीटर जोड़ें और सख्ती से हिला। समाधान ~ 7.4 पीएच है कि पीएच पेपर के साथ की पुष्टि करें। यदि नहीं, तो समाधान त्यागें।
- 61 मिलीग्राम G6P 200 मिमी पंजाब के 0.94 मिलीलीटर में भंग जोड़ने के लिए, 61 मिलीग्राम NADP 200 मिमी पंजाब के 0.94 मिलीलीटर में भंग, और 41 मिलीग्राम 2 MgCl 0.96 मिलीलीटर 100 मिमी की पंजाब में भंग कर दिया। पीएच है कि Reconfirm ~ 7.4 बुद्धिज पीएच पेपर। नहीं ~ 7.4 है, तो समाधान त्यागें।
- 200 मिमी पंजाब (7.4 पीएच) के 0.25 मिलीलीटर में भंग MMPMS की 5 मिलीग्राम जोड़ें। सख्ती एक स्पष्ट गहरे लाल homogenate उत्पन्न करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया मिश्रण हिला। समाधान परेशान है, तो मिश्रण खारिज किया जाना चाहिए। प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त ट्यूब लाइट के लिए जोखिम कम करने के लिए पन्नी में लपेटा जाता है। अंतिम घटक, एनबीटी, तैयार किया जाता है, जबकि आरटी पर प्रतिक्रिया मिश्रण स्टोर।
- एक हे अंगूठी ढक्कन के साथ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में एनबीटी की 164 मिलीग्राम से 0.4 एमएल निर्जल डाइमिथाइल formamide (DMF) और 0.4 एमएल निर्जल इथेनॉल जोड़कर अलग से एक 5 मिमी एनबीटी समाधान तैयार है। शिथिल ढक्कन बंद (कसकर बंद नहीं) और एनबीटी समाधान में है जब तक एक तेल स्नान में एक जोरदार फोड़ा करने के लिए समाधान लाने के लिए। 8
- Solubilized एनबीटी आरटी को शांत करने के लिए और फिर अक्टूबर प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए समाधान के सभी जोड़ सकते हैं और एक स्पष्ट समाधान प्राप्त करने के लिए सख्ती से हिला करने की अनुमति दें। एक अंधेरे लाल या purp के लिए प्रारंभिक नारंगी-लाल से समाधान रंग बदलने का निरीक्षणसमय के साथ Le रंग। यह सामान्य बात है।
- उपयोग करने से पहले 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म कमरे में अंतिम G6PD धुंधला मिश्रण रखें।
2. पशु उपचार और ऊतक संग्रह
- डीएनए हानिकारक एजेंट, जैसे के साथ 6 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 नर चूहों को समझो, आईपी इंजेक्शन द्वारा 200 μl पीबीएस के एक मात्रा में 10 मिलीग्राम / किग्रा azoxymethane (AOM)। आईपी इंजेक्शन द्वारा पीबीएस के 200 μl के साथ चूहों पर नियंत्रण समझो।
- 90 दिनों में सीओ द्वारा IACUC प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित के रूप में ग्रीवा अव्यवस्था के बाद 2 asphyxiation चूहों euthanize।
- शल्य चिकित्सा सिर्फ उरोस्थि के आधार पर गुदा के ऊपर से उदर गुहा खुला। शरीर गुहा के बाहर छोटी आंत कदम है, लेकिन यह आबकारी नहीं है। सिर्फ मलाशय के लिए सेसम नीचे कम आंत आबकारी। 10
- ध्यान से एक माइक्रो-विच्छेदन कैंची का उपयोग करते हुए पेट के एक पक्ष के साथ टुकड़ा और स्वच्छ बाँझ पीबीएस के साथ धोने से खोला बृहदान्त्र से मल को हटा दें। आबकारी स्विस रोलएक ऊतक सांचे में ल्यूमिनल जावक का सामना करना पड़ पक्ष, और जगह के साथ घ बृहदान्त्र। 10
- पूरी तरह से एक देवर तरल एन 2 युक्त में अक्टूबर मध्यम और जगह सांचे में पेट के विसर्जित कर दिया। प्लास्टिक के आधार सिर्फ अक्टूबर मध्यम ठोस जमे हुए है, जब तक तरल एन 2 के साथ संपर्क में है कि इतने ढालना पकड़ो।
- जमे हुए वर्गों को काटने तक -80 में जमे हुए ऊतक ब्लॉक स्टोर। G6PD एंजाइम की निष्क्रियता का परिणाम होता है, जो किसी भी लगानेवाला, का प्रयोग न करें।
जमे हुए वर्गों के 3. तैयारी
- -25 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat का उपयोग कर 7 माइक्रोन की मोटाई पर जमे हुए ऊतक वर्गों में कटौती। 4 लगातार 7 माइक्रोन वर्गों में कटौती और एक ही स्लाइड (चित्रा 1) पर उनमें से दो जगह है। पेट के (चित्रा 1) में से एक स्तर का प्रतिनिधित्व करने के लिए 2 स्लाइड, या लगातार चार 7 माइक्रोन वर्गों तैयार करें।
- जनसंपर्क के पिछले भाग से> 50 माइक्रोन की न्यूनतम दूरी के साथ अगले स्तर के लिए दोहराएँevious स्तर। इस दूरी के लिए प्रत्येक स्तर के लिए मूल्यांकन तहखाने एक दूसरे की नकल नहीं था कि यह सुनिश्चित किया।
- बार-बार काटने के दौरान जम जाता है कि अक्टूबर अवशेषों को हटाने के लिए 100% इथेनॉल के साथ cryostat ब्लेड पोंछ। सेक्शनिंग फिर से शुरू करने से पहले, सूखी ब्लेड संचित स्थिर प्रभार फैलने के लिए एक antistatic ड्रायर पत्र के साथ साफ हो गया है। सी ओ -80 में जमे हुए वर्गों के साथ दुकान स्लाइड्स
जमे हुए खंड ऊतक 4. धुंधला
- उच्च नमी के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म कमरे में एंजाइम ऊतकरसायनशास्त्र प्रतिक्रिया प्रदर्शन।
नोट: एक ऊष्मायन ओवन में या एक गर्म स्लाइड पर enzymatic प्रतिक्रिया का प्रयास कर गरीब और असंगत G6PD धुंधला करने के लिए नेतृत्व किया। - सिलिकॉन तेल (चित्रा 1) का उपयोग कर एक साथ बंधुआ रहे हैं कि दो 1.5 सेमी x 0.15 सेमी स्टील वाशर (आंतरिक व्यास x ऊँचाई) का उपयोग ऊतक धुंधला के लिए कुओं का निर्माण करें। केंद्र के साथ अच्छी तरह से आधार फिट करने के लिए parafilm कट बाहर कटौती और अच्छी तरह से जगहस्लाइड पर ऊतक खंड पर घ।
नोट: वॉशर के तल पर Parafilm स्लाइड और ऊतक खंड पर चिपचिपा G6PD धुंधला मिश्रण का कहना है कि वॉशर के बीच एक मुहर बनाता है। अध्ययन में प्रत्येक ऊतक अनुभाग G6PD प्रतिक्रिया धुंधला मिश्रण का एक ही मात्रा प्राप्त करता है, ताकि 0.5 मिलीलीटर मात्रा - इस का निर्माण एक 0.4 के साथ एक अच्छी तरह से देता है। - 10 मिनट के लिए एक गर्म कमरे में 37 ओ सी पर जमे हुए ऊतक स्लाइड सेते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45-50 मिनट के लिए प्रत्येक ऊतक अनुभाग में अच्छी तरह से (स्लाइड प्रति 2 वर्गों) को G6PD धुंधला प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें। गर्म कमरे से स्लाइड्स निकालें, और ध्यान से स्लाइड बंद स्टेनलेस स्टील कुओं उठा।
- उनके लंबे किनारे पर सेट स्लाइड प्रतिक्रिया माध्यम से पलायन करने की अनुमति देने के लिए। 30-60 मिनट के लिए 100 मिमी पंजाब (7.4 पीएच) में जगह स्लाइड ऊतक धुंधला बिना परेशान ऊतकों से G6PD धुंधला प्रतिक्रिया मिश्रण को दूर करने के लिए। पंजाब लवण को दूर करने के लिए 5-10 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड्स डूब
- ऐड से ऊतक सीलऊतक पर एक ड्रॉपर से फ्लोरो जेल हैैं और यह शुष्क करने के लिए ~ 30 मिनट इंतज़ार कर रहे। उत्परिवर्तित तहखाने की पहचान उलझाना कर सकते हैं कि बुलबुले से बचें।
नोट: बुलबुले फार्म हैं, तो प्रक्रिया आसुत पानी में भिगोने से फ्लोरो जेल को हटाने के बाद दोहराया जा सकता है। वे जाल हवा के बुलबुले के लिए करते हैं के रूप में कवर फिसल जाता है का उपयोग न करें।
G6PD उत्परिवर्ती तहखाने और उत्परिवर्तन आवृत्ति 5. निर्धारण
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत G6PD उत्परिवर्ती तहखाने के लिए स्लाइड का विश्लेषण करें।
नोट: एक पूरी तरह से उत्परिवर्ती तहखाना की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया मापदंड थे: (i) पूरे तहखाना नीले रंग से रहित था; (Ii) तहखाना की बाहरी संरचना (iii) उत्परिवर्ती तहखाना (iv) के दो पर्यवेक्षकों एक उत्परिवर्ती के रूप में ही तहखाना की पहचान के लिए किया था, आसन्न 7 माइक्रोन वर्गों पर मनाया जाता है और किया गया था, बरकरार था। आसन्न 7 माइक्रोन वर्गों पर मनाया म्यूटेंट एक उत्परिवर्ती के रूप में गिने जाते हैं। - छवि प्रत्येक G6PD उत्परिवर्ती 40x बढ़ाई तहखाना और एक 5.0 मेगापिक्सेल कैमरा के साथ उपयोग कर छवियों सूचीइमेजिंग सॉफ्टवेयर।
- 10x बढ़ाई चित्रा (1 सी) में सबसे छोटी सतह क्षेत्र और छवि के साथ यह स्तर से प्रत्येक माउस के लिए एक प्रतिनिधि अनुभाग का चयन करके एक माउस में जांच तहखाने की कुल संख्या यों।
नोट: एक स्तर की वजह से उनकी निकटता को अक्सर एक से अधिक खंड पर तहखाने उत्परिवर्तित दिखा जो लगातार चार 7 माइक्रोन वर्गों (चित्रा -1) का प्रतिनिधित्व करता है। स्तरों पेट के विभिन्न क्षेत्रों से तहखाने कल्पना करने के लिए माइक्रोन 50> से अलग हो रहे हैं। - प्रत्येक छवि फ़ाइल को खोलने और नेत्रहीन (चित्रा 1C में बक्से के रूप में दिखाया गया है) फ़ाइलों का विश्लेषण करके एक स्तर पर तहखाने की संख्या गिनती। चित्र फ़ाइलें एक फ़ाइल में के रूप में कम 300> से 20 के रूप में तहखाने से मनाया तहखाने की संख्या में अलग अलग होंगे।
- प्रत्येक पेट के लिए G6PD उत्परिवर्ती तहखाने के लिए जांच स्तरों की संख्या से प्रत्येक माउस के लिए चयनित स्तर (चित्रा 1 सी) से तहखाने की कुल संख्या गुणा करें। उदाहरण के लिए, की कुल गिनतीउत्परिवर्ती तहखाने के लिए जांच की 8 स्तरों से गुणा चयनित स्तर प्रति 1,250 तहखाने 10,000 तहखाने की कुल गिनती के बराबर होती है। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक पेट के लिए 10,000 तहखाने की एक न्यूनतम मूल्यांकन।
- प्रत्येक उपचार के लिए म्यूचुअल फंड की गणना करने के लिए जांच की तहखाने की कुल संख्या से पशुओं के सभी में मनाया म्यूटेंट की संख्या का मिश्रण। अनुपचारित चूहों में पृष्ठभूमि स्टेम सेल एमएफ स्तर <0.1x10 -4 पहले C57BL / 6 चूहों में सूचना दी कि जो करीब है (तालिका 1),। 11 है
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Representative Results
पशुओं में colonic स्टेम सेल म्यूटेशन को मापने की क्षमता कैंसर प्रेरण म्यूटेशन सहसंबंधी के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है। आम तौर पर, यह कैंसरजनन में महत्वपूर्ण कदम ओंकोजीन में म्यूटेशन को सक्रिय करने और / या ट्यूमर शमन जीन में म्यूटेशन निष्क्रिय करना शामिल है कि माना जाता है। हम पीबीएस के 200 μl या पीबीएस के 200 μl में 10 मिलीग्राम / किग्रा AOM साथ C57BL / 6 चूहों इंजेक्शन। AOM एक ज्ञात पेट के कैसरजन है। कॉलन स्टेम सेल म्यूटेशन के लिए विश्लेषण किया गया 90 दिन में 5-7। इस बार स्टेम कोशिकाओं को पूरी तरह से एक तहखाना आबाद करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है, और G6PD उत्पादन नहीं करता है एक पूरे तहखाना एक स्टेम सेल उत्परिवर्ती के रूप में पहचान एक तहखाना होने पर ही। पूरी तरह से उत्परिवर्ती तहखाने के उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। आंकड़ा जमे हुए वर्गों की तैयारी में होते हैं कि तहखाने के (ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज) दो अलग झुकाव से पता चलता है। क्षैतिज एक पक्ष के दृश्य प्रदान करता है, जबकि खड़ी दृश्य तहखाना की लंबी अक्ष नीचे देख रहा है। रोनाजाम कोशिकाओं से श्लेष्मा उत्पादन की वजह से है कि कुछ सफेद रंग के साथ नीले G6PD दाग के लिए जंगली प्रकार हैं कि अंक। एक स्लाइड (चित्रा 1) और उत्परिवर्तित तहखाने की संख्या पर तहखाने की कुल संख्या की गिनती करके, उत्परिवर्तित तहखाने के लिए म्यूचुअल फंड की गणना की जा सकती है। कोई उत्परिवर्तित तहखाने नियंत्रण में निरीक्षण> लाख जंगली प्रकार तहखाने में से किसी में मनाया गया चूहों (पीबीएस इलाज)। हम <0.1x10 -4, C57BL / 6 चूहों के लिए पहले से सूचना दी कि के करीब है जो होना करने के लिए चूहों पर नियंत्रण के लिए म्यूचुअल फंड की स्थापना की। 1
G6PD धुंधला अभिकर्मक के लिए स्लाइड के 1. तैयारी चित्रा। (ए) दो 1.5 सेमी x 0.15 सेमी स्टील वाशर (आंतरिक व्यास x ऊँचाई) सिलिकॉन तेल का उपयोग कर एक साथ सील कर रहे हैं। Parafilm तो केंद्र के साथ अच्छी तरह से आधार फिट काट काट बाहर और स्विस पर पेट के ऊतक वर्गों लुढ़का अधिक अच्छी तरह से रखा गया हैस्लाइड। (बी) के आसन्न 7 माइक्रोन कटौती से दो ऊतक वर्गों को एक ही समय में एक ही स्लाइड पर रखा गया है और दाग रहे हैं। स्केल पट्टी: 1.0 सेमी। (सी) धारा में तहखाने की संख्या 10x बढ़ाई ऊतक को देखकर निर्धारित किया जाता है। (बक्से के रूप में दिखाया गया है) क्षेत्रों की संख्या प्रत्येक अनुभाग के साथ बदलता रहता है। प्रत्येक क्षेत्र में तहखाने की संख्या दृश्य गणना के द्वारा निर्धारित और उस स्तर के लिए तहखाने की कुल संख्या देने के लिए कहा है। (डी) एक स्तर लगातार चार 7 माइक्रोन ऊतक वर्गों के रूप में परिभाषित किया गया है। स्तरों पहले से मूल्यांकन तहखाने के साथ ओवरलैप से बचने के लिए अलग> 50 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. प्रतिनिधि उदाहरणAOM में मनाया उत्परिवर्तित तहखाने की। कार्यात्मक G6PD की उपज नहीं है कि C57BL / 6 नर चूहों का इलाज किया G6PD उत्परिवर्ती तहखाने में अच्छी तरह से परिभाषित किया लेकिन नीले दाग के लगभग रहित हैं कर रहे हैं। क्षेत्र में तहखाने का सबसे शामिल है कि जंगली प्रकार तहखाने नीला / बैंगनी का संकेत G6PD enzymatic गतिविधि कर रहे हैं। स्केल:। 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| इलाज | उत्परिवर्ती तहखाने की घटनाओं | उत्परिवर्ती तहखाने एक | कुल तहखाने का विश्लेषण किया | म्यूचुअल फंड (एक्स 10 -4) |
| विलायक | 0/6 चूहों | 0 | > 10 5 | <0.10 |
| AOM | 10/12 चूहों | 43 | 96,821 | 60; 4.44 |
C57BL / 6 चूहों में इलाज इलाज और azoxymethane में तालिका 1. उत्परिवर्तन आवृत्ति। 12
90 दिन में 10 मिलीग्राम / किग्रा azoxymethane (AOM) या विलायक नियंत्रण से संपर्क के बाद गुम्मट C57BL / 6 चूहों में colonic स्टेम सेल म्यूटेशन।
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Discussion
अक्सर एक यौगिक के जेनोटोक्सिक प्रभाव डीएनए को संशोधित करने के लिए अपनी क्षमता से निर्धारित होता है। यह सामान्य रूप से ऊतक को अलग-थलग करने और डीएनए adducts की वैश्विक स्तर मापने के द्वारा किया जाता है। AOM के लिए, यह पेट में हे 6 -methylguanine adducts बढ़ाता शामिल होगा। ऐसे स्टेम सेल आला में के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के भीतर नुकसान पर इस दृष्टिकोण के बारे में जानकारी का उपयोग करना, खो दिया है। Adducts के केवल एक छोटे सबसेट अंततः तय म्यूटेशन में परिवर्तित कर रहे हैं, क्योंकि इसके अलावा, एक डीएनए अभिवर्तन एक उत्परिवर्तन के रूप में ही नहीं है। 12 हम reproducibly ग्रीफिथ द्वारा वर्णित प्रारंभिक पद्धति पर आधारित पेट में स्टेम सेल म्यूटेशन यों को इस के साथ साथ जानकारी प्रदान करते हैं एट अल। 1 और VanNorden द्वारा विकसित G6PD धुंधला पर आधारित है। 4,8,9,13,14
एक quantifiable परिणाम का उत्पादन करने के लिए इस एंजाइम ऊतकरसायनशास्त्र विधि के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। एक ऊतकों की सेक्शनिंग में है। गौरतलब है कि अधिक ऊतक संप्रदायआयनों उत्पन्न होता है और आम तौर पर एच ई ऊतकीय विश्लेषण के साथ किया जा होगा की तुलना में विश्लेषण किया जाना चाहिए। हम 7 माइक्रोन वर्गों 5, 6, 7, 8 और 10 माइक्रोन मोटी वर्गों के मूल्यांकन के बाद सबसे अच्छा G6PD धुंधला afforded कि निर्धारित।
दूसरे, मूल्यवान ऊतक वर्गों की आवश्यक संख्या में धुंधला हो जाना एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रिया मिश्रण की आवश्यकता है। हम इसे से G6PD एंजाइम के प्रसार को रोकने, जबकि एंजाइम ऊतकरसायनशास्त्र प्रतिक्रिया की सुविधा के लिए समाधान प्रतिशत (18% और अधिक से अधिक) के लिए आवश्यक में काफी चिपचिपा है क्योंकि मूल प्रोटोकॉल में इस्तेमाल polyvinyl शराब (PVA) के उपयोग समस्याग्रस्त हो पाया ऊतक। अभिकर्मकों और पीएच के नियंत्रण के बेहतर solubilization के 10% PVA होता है, जो अक्टूबर मध्यम, साथ PVA जगह से पूरा किया गया। पीएच सही रूप में पीएच पेपर के साथ निर्धारित किया जा सकता है और 7.4 पीएच के पास नहीं है, तो समाधान कीमती ऊतक के नमूने लिए और समय बर्बाद कर के बिना खारिज कर दिया है। यह बदलाव बेहतर और मीटर करने के लिए नेतृत्वऊतक वर्गों में लगातार धुंधला अयस्क। G6PD गतिविधि को मापने के लिए आवश्यक पीएच (7.2-7.4) में पूरा प्रतिक्रिया मिश्रण धीरे से बैंगनी के लिए बदल जाएगा जो एक विशेषता स्पष्ट गहरे नारंगी-लाल रंग की है। चाहे रंग की, प्रतिक्रिया धुंधला समाधान यह अच्छा धुंधला बर्दाश्त नहीं होगा, क्योंकि यह खारिज किया जाना चाहिए परेशान कर रहा है। हम यह अक्टूबर मध्यम करने के लिए पंजाब (7.4) को जोड़ने और पीएच के निर्धारण से बहुत सारे परीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है तो अक्टूबर मध्यम से कुछ के बहुत सारे आवश्यक पीएच सीमा के बाहर मिश्रण प्रदान की है कि पाया। पहले से सुझाव के रूप में हम भी MMPMS इस्तेमाल किया, बल्कि G6PD धुंधला प्रतिक्रिया मिश्रण के प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता को खत्म करने की मूल कागज 1 में इस्तेमाल किया 5-methylphenazenium मिथाइल सल्फेट से 8,9।
अंत में, एमएफ अन्य तरीकों की तुलना में उपन्यास है पाने के लिए विधि में पहले से कार्यरत हैं। 1,2 धुंधला कलाकृतियों झूठी G6PD उत्परिवर्ती तहखाने के संभावित पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। टी के निवारण के लिएउसकी समस्या है, हम एक से अधिक ऊतक अनुभाग (चित्रा 4D) में एक ही उत्परिवर्तित तहखाना के दृश्य के लिए अनुमति देता है कि 4 सन्निहित 7 माइक्रोन ऊतक वर्गों का विश्लेषण किया। इस सत्यापन एमएफ विश्लेषण को प्रभावित करने कलाकृतियों धुंधला करने की संभावना को कम कर देता है। इसके अलावा, हमारे विधि एमएफ की गणना करते समय विश्लेषण किया तहखाने की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए गिना कुल तहखाने का एक वास्तविक मूल्य का उपयोग करता है।
क्योंकि छोटी और बड़ी आंत में पाया अद्वितीय तहखाना संरचना की, यह प्रत्येक तहखाना के लिए स्टेम कोशिकाओं के स्थान और सेल वंश निर्धारित करने के लिए संभव है। दृष्टिकोण के लिए एक प्रमुख सीमा अन्य ऊतकों की आकृति विज्ञान के रूप में अच्छी तरह से पेट के रूप में परिभाषित नहीं है, क्योंकि यह आंतों के लिए प्रतिबंधित किया जाता है। इसलिए, यह कैंसर के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि अधिकांश अन्य ऊतकों में स्टेम सेल एमएफ निर्धारित करने के लिए संभव नहीं है। परख एक प्ररूपी परख G6PD enzymatic गतिविधि के नुकसान पर आधारित है, स्टेम सेल की आबादी में वास्तविक एमएफ होगाहम के कारण काफी enzymatic गतिविधि को प्रभावित नहीं करते कि लड़खड़ा कुर्सियां और बिंदु उत्परिवर्तन में परिवर्तन करने के लिए G6PD के लिए रिपोर्ट की तुलना में अधिक हो।
सीमाओं और चुनौतियों का दैहिक स्टेम सेल म्यूटेशन यों को पेट के ऊतकों में G6PD गतिविधि के लिए धुंधला करने के लिए कर रहे हैं, महत्वपूर्ण संशोधनों इस पद्धति का उपयोग की व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए इस पेपर में शुरू किए गए थे। हम इन परिवर्तनों G6PD धुंधला अभिकर्मक पैदा करने और म्यूचुअल फंड बढ़ाता के reproducibility बढ़ाया पाया। इसके अलावा, दैहिक स्टेम सेल म्यूटेशन के लिए एक मार्कर के रूप G6PD एंजाइम की गतिविधि के लिए धुंधला हो metallothionein, 15 दैहिक स्टेम सेल म्यूटेशन का एक और संभावित मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण होगा के रूप में इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री धुंधला में एक विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है।
भविष्य में, हम, पर्यावरण यौगिकों के साथ इलाज चूहों में colonic स्टेम सेल म्यूटेशन का विश्लेषण करेगा इस तरह के 2 अमीनो-1-मिथाइल-6-phenylimidazo [4,5-ख] पिरिडीन (PhIP के रूप में) और मानव पेट के कैंसर के साथ जुड़े रहे हैं कि ग्रील्ड मांस में पाया अन्य सुरभित amines,।
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Acknowledgments
लेखकों कोई स्वीकृतियां है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
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