Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties

Abstract

De mogelijkheid om stamcellen mutaties te meten, is een krachtig hulpmiddel om te kwantificeren in een kritische cel populatie of, en in welke mate, kan een chemische mutaties die kunnen leiden tot kanker veroorzaken. De toepassing van een enzymatische bepaling om stamcellen mutaties kwantificeren in de X-gebonden glucose-6-fosfaat-dehydrogenase gen is eerder gemeld. ¹ Deze methode vereist de bereiding van ingevroren secties en incubatie van het doorgesneden weefsel met een reactiemengsel dat een oplevert blauw wanneer de cellen functioneel glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) enzym. Indien niet, de cellen lijken witachtig. We hebben het reactiemengsel met behulp van optimale Cutting Temperatuur Verbinding (oktober) medium in plaats van polyvinyl alcohol gewijzigd. Dit vergemakkelijkt pH meting verhoogt oplosbaarheid van de G6PD kleuring componenten en beperkt diffusie van de G6PD enzym. Om aan te tonen dat een mutatie zich in een stamcel, moet de gehele crypt G6PD enzymatische missenactiviteit. Alleen als een stamcel herbergt een fenotypische G6PD mutatie zullen de nakomelingen in de crypte gebrek G6PD enzymatische activiteit. Om crypten met een stamcel mutatie te identificeren, werden vier opeenvolgende aangrenzende vriescoupes (niveau) gesneden op 7 urn dikte. Deze benadering van het maken aangrenzende sneden worden conformatie die een crypte volledig gemuteerd aangezien dezelfde gemuteerde crypte zal worden waargenomen in aangrenzende secties. Slides met weefselmonsters die meer dan 50 urn uit elkaar waren bereid waren totaal> 10 ⁴ crypten per muis evalueren. De mutatie-frequentie is het aantal waargenomen gemuteerde (wit) crypten ÷ door het aantal wild type (blauw) crypten in een behandelgroep.

Introduction

Darmkanker wordt gedacht dat blootstelling aan milieu-agenten en voedingscomponenten dat DNA kan beschadigen betrekken en produceren van activerende somatische mutaties in oncogenen (bijvoorbeeld ß-catenine) of inactiveren mutaties in tumorsuppressorgenen (bijvoorbeeld APC). Aangenomen wordt dat deze kritische mutaties optreden in colon stamcellen. Vanwege de unieke architectuur crypte van het colonepitheel is het mogelijk om stamcellen mutaties in het colon te meten na blootstelling van dieren aan chemicaliën geassocieerd met darmkanker. Verscheidene X-gebonden enzymen kunnen dienen als indicatoren voor de mutaties die voorkomen in stamcellen, de mutaties in alle cellen binnen een crypte zal zijn.

Voorheen werd een procedure gepubliceerd waaruit blijkt dat chemische stoffen die darmtumoren induceren in muizen ook gegenereerd somatische stamcellen mutaties in het colon via de analyse van mutaties in het X-gebonden glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) gen. ^1-3De werkwijze kwantificeert het optreden van willekeurige mutaties in somatische stamcellen colon zonder selectiedruk. De procedure heeft betrekking op de productie van niet-gefixeerde bevroren dikke delen van behandelde en controle muizen en de identificatie van de crypten verstoken van cellen die functionele G6PD activiteit te produceren. Deze gemuteerde crypten, die wit verschijnen aan dat de mutatie zich in een stamcel die tot nageslacht gaf ook herbergt een gemuteerd gen G6PD. In de enzymatische assay, kan G6PD deficiënte mutant crypten niet oxideren glucose-6-fosfaat, die nodig is voor de reductie van nitro blue tetrazolium (NBT). Wanneer de G6PD enzym functioneel, de NBT de kleuring mengsel wordt gereduceerd tot oplosbare formazan en neerslagen accumuleren op de plaats van het enzym en "kleuring" blue cellen. Cellen die G6PD mutanten zijn blijven witachtig in tegenstelling tot blauw gekleurde wild type crypten. Deze methode meet mutaties die een "nul" fenotype hebben. Omdat nlZymes zoals G6PD kunnen diffunderen uit de cellen op een niet vastgelegde weefselsectie wanneer de secties in een waterige oplossing worden gebracht, is het noodzakelijk het enzym te stabiliseren in de weefselcoupes te analyseren. ⁴ De stabilisering van het enzym in het weefsel moet niet belemmeren diffusie van kleine moleculen reagentia voor de enzymatische reactie G6PD.

We hebben een aantal belangrijke wijzigingen in de oorspronkelijke procedure gemaakt. Het medium voor de kritische enzymatische kleuring is gewijzigd van polyvinyl alcohol Optimaal snijtemperatuur Verbinding (oktober), waarbij de pH controle en oplossen van de bestanddelen die in de test vergemakkelijkt. De kleuring wordt uitgevoerd met 0,4-0,5 ml wells van staal ringen zodat elke weefselsectie ontvangen hetzelfde volume van de G6PD reactiemengsel. Een procedure werd ontwikkeld voor het schatten van het aantal crypten per afgebeeld sectie die een grote bemonstering van het colon weefsel verschaft zonderhandmatig tellen> 10 ⁵ crypten per colon. De analyse van aangrenzende 7 urn weefselcoupes verschaft visualisatie van een mutant crypte op meer sledes, die potentiële kleuring artefacten verminderd. Deze wijzigingen maken de procedure efficiënter en reproduceerbaar.

Met deze herziene protocol, hebben we de mutatiefrequentie in colon stamcellen gekwantificeerd na blootstelling van C57BL / 6 muizen azoxymethane, een bekend carcinogeen colon bij knaagdieren. ^5-7

Protocol

De experimentele procedures en de ethische behandeling van dieren werd goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh IACUC (protocol # 1.104.674).

1. Bereiding van G6PD kleuring Mixture

OPMERKING: Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elke reagentia is als volgt; 5 mM glucose-6-fosfaat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM _MgCl2, 0,35 mM 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfaat (MMPMS) en 0,8 mM NBT. ^1,8,9 Voor elk reagens de aanvankelijke concentratie die voor een 40 ml eindvolume. Oplossingen werden vers bereid en toegepast per dag.

1. Voeg 2 ml van 200 mM pH 7,4 fosfaatbuffer (PB) tot 35 ml oktober medium in een 50 ml buis en schud krachtig. Bevestig met pH-papier dat de oplossing ~ pH 7,4. Zo niet de oplossing weggooien.
2. Voeg 61 mg G6P opgelost in 0,94 ml van 200 mM PB, 61 mg NADP opgelost in 0,94 ml van 200 mM PB en 41 mg MgCl _2, opgelost in 0,96 ml van 100 mM PB. Herbevestigen dat de pH ~ 7.4 with pH-papier. Zo niet ~ 7.4, gooi de oplossing.
3. Voeg 5 mg MMPMS opgelost in 0,25 ml van 200 mM PB (pH 7,4). Schud het verkregen reaktiemengsel een heldere donkerrode homogenaat genereren. Als de oplossing troebel, moet het mengsel worden weggegooid. De buis die het reactiemengsel wordt verpakt in folie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Bewaar het reactiemengsel bij kamertemperatuur, terwijl de uiteindelijke component, NBT, bereid.
4. Bereid afzonderlijk een 5 mM NBT door toevoeging van 0,4 ml watervrij dimethylformamide (DMF) en 0,4 ml watervrije ethanol 164 mg NBT in een 2 ml buisje met een O-ring deksel. Sluit het deksel los (niet afgedicht) en breng de oplossing van een krachtige kook in een oliebad totdat de NBT in oplossing. ⁸
5. Laat het opgeloste NBT afkoelen tot kamertemperatuur en voeg alle oplossing aan het reactiemengsel oktober en schud krachtig tot een heldere oplossing te verkrijgen. Let op de oplossing kleurverandering van de eerste oranje-rood tot een donker-rode of purple kleur na verloop van tijd. Dit is normaal.
6. Plaats de uiteindelijke G6PD kleuring mengsel in een 37 ° C warme kamer voor 1 uur vóór gebruik.

2. Animal Behandeling en Tissue Collection

1. Behandel 6 weken oude C57BL / 6 mannelijke muizen met DNA beschadigende middel, bijvoorbeeld 10 mg / kg azoxymethaan (AOM) in een volume van 200 pl PBS door ip injectie. Behandel controlemuizen met 200 pl PBS door ip injectie.
2. Op 90 dagen, euthanaseren muizen door CO ₂ stikken, gevolgd door cervicale dislocatie zoals goedgekeurd door IACUC protocol.
3. Operatief open de buikholte van net boven de anus naar de basis van het borstbeen. Verplaats de dunne darm uit de lichaamsholte, maar niet te snijden is. Uitsnijden de dikke darm net onder de blindedarm het rectum. ¹⁰
4. Zorgvuldig snijden langs één zijde van het colon met een micro-dissectie schaar en verwijder uitwerpselen uit de geopende colon door wassen met schoon steriel PBS. Swiss roll de accijnzend dikke darm met de luminale zijde naar buiten gericht, en plaats in een tissue mal. ¹⁰
5. Volledig onder te dompelen de dikke darm in oktober medium en plaats schimmel in een Dewar met vloeibare _N2. Houd de mal zodat het plastic base alleen in contact met het vloeibare _N2 tot oktober medium wordt vast bevroren.
6. Bewaar de ingevroren weefsel blok bij -80 tot snijden van bevroren secties. Gebruik geen fixatief, die zou resulteren in de inactivering van het enzym G6PD gebruiken.

3. Voorbereiding van bevroren secties

1. Knip ingevroren weefselsecties bij een dikte van 7 urn met behulp van een cryostaat bij -25 ° C. Snij 4 opeenvolgende 7 urn secties en plaats twee van hen op dezelfde dia (figuur 1). Bereid 2 glijbanen of vier opeenvolgende 7 urn secties om een niveau van de dikke darm (Figuur 1) te vertegenwoordigen.
2. Herhaal dit voor het volgende niveau met een minimale afstand van> 50 um van het laatste deel van de previous niveau. Deze afstand zorgde ervoor dat de crypten beoordeeld voor elk niveau niet dupliceren elkaar.
3. Vaak veeg de cryostaat mes met 100% ethanol om de oktober residu dat zich ophoopt tijdens het snijden te verwijderen. Voordat snijden wordt hervat, is de droge mes afgeveegd met een antistatische droger blad aan opgebouwde statische lading af te voeren. Store dia's met de bevroren secties bij -80 ^o C

4. kleuring van Frozen afdeling Tissue

1. Voeren het enzym histochemie reactie in een 37 ° C warme ruimte met een hoge luchtvochtigheid.
   OPMERKING: Proberen de enzymatische reactie in een incubatie oven of op een dia warmer leidde tot slecht en inconsistent G6PD vlekken.
2. Bouw putjes weefsel kleuring met twee 1,5 cm x 0,15 cm stalen ringen (inwendige diameter x hoogte) die aan elkaar gehecht siliconenvet gebruikt (figuur 1). Snijd de parafilm aan de basis van de put met het midden fit uitgesneden en de put placed over de sectie weefsel op de dia.
   Opmerking: De parafilm op de bodem van de ring zorgt voor een afdichting tussen de slede en de ring die het viskeuze G6PD kleuring mengsel op weefselsectie handhaaft. Dit construct geeft een put met 0,4 - 0,5 ml volume, zodat elke sectie weefsel in de studie hetzelfde volume van het reactiemengsel G6PD kleuring mengsel ontvangt.
3. Incubate ingevroren weefsel dia bij 37 ^o C in een warme kamer gedurende 10 minuten. Bij 37 ° C, voeg de G6PD kleuring reactiemengsel aan elk weefselsectie put (2 delen per slide) gedurende 45-50 min. Verwijder dia's uit warme kamer, en til de RVS putten uit de dia's.
4. Set dia's op de lange zijde om de reactie medium uitlekken. Plaats de glaasjes in 100 mM PB (pH 7,4) gedurende 30-60 min met de G6PD kleuring reactiemengsel uit het weefsel te verwijderen zonder de weefselkleuring. Dompel dia's in gedestilleerd water gedurende 5-10 min naar PB zouten te verwijderen
5. Verzegelen het weefsel van adding fluor-gel van een druppelaar op het weefsel en wachten ~ 30 min tot het droog is. Vermijd bellen dat de identificatie van gemuteerde crypten kan verwarren.
   LET OP: Als er bellen te vormen, kan de procedure na het verwijderen van de fluor-gel worden herhaald door het weken in gedestilleerd water. Gebruik geen dekglaasjes als ze de neiging om val luchtbellen.

5. Vaststelling van G6PD Mutant crypten en mutatiefrequentie

1. Analyseer glijbanen voor G6PD mutant crypten onder een lichtmicroscoop.
   LET OP: Het wordt gebruikt om een ​​volledig mutant crypte identificeren criteria waren: (i) het hele crypte was verstoken van blauwe kleur; (ii) de buitenkant van de crypte intact was, (iii) de mutant crypte waargenomen op aangrenzende secties 7 urn en, (iv) twee waarnemers moest hetzelfde crypte identificeren als een mutant. Mutanten waargenomen op aangrenzende 7 urn secties zijn als één mutant.
2. Afbeelding elke G6PD mutant crypte op 40x vergroting en de catalogus van de beelden met behulp van een 5,0 megapixel camera metimaging software.
3. Kwantificeren van het totale aantal crypten in een muis onderzocht met een representatief deel van elke muis van de hoogte van de kleinste oppervlakte stippellijn beeld in bij 10x vergroting (figuur 1C) selecteren.
   LET OP: Een niveau vertegenwoordigt vier opeenvolgende 7 micrometer secties (figuur 1D), die vanwege hun nabijheid vaak tonen gemuteerd crypten op meer dan één sectie. De niveaus worden gescheiden door> 50 urn tot crypten uit verschillende gebieden van de colon te visualiseren.
4. Open elke beeldbestand en visueel tellen het aantal crypten op een niveau analyse betreft (weergegeven als boxen in figuur 1C). Beeldbestanden zullen variëren van het aantal crypten waargenomen van zo laag als 20 tot> 300 crypten in één bestand.
5. Vermenigvuldig het aantal crypten van het gekozen niveau (figuur 1C) voor elke muis het aantal niveaus gescreend G6PD mutant crypten per colon. Bijvoorbeeld, een totaal aantal van1250 crypten per geselecteerde niveau vermenigvuldigd met 8 niveaus gescreend mutant crypten gelijk aan een totaal aantal van 10.000 crypten. Evalueer minste 10.000 crypten per colon voor statistische analyse.
6. Combineer het aantal mutanten in alle dieren waargenomen door het totale aantal crypten gescreend om de MF te berekenen voor elke behandeling. De achtergrond stamcellen MF niveau onbehandelde muizen <0.1x10 ^-4 (tabel 1), wat dicht bij die voorheen in C57BL / 6 muizen. ¹¹

Representative Results

Het vermogen om colon stamcellen mutaties meten bij dieren biedt een unieke manier om mutaties kankerinductie correleren. Gewoonlijk wordt aangenomen dat de kritische stap in carcinogenese omvat activerende mutaties in oncogenen en / of inactiverende mutaties in tumorsuppressorgenen. Geïnjecteerd C57BL / 6 muizen met 200 ul PBS of 10 mg / kg AOM in 200 pl PBS. AOM is een bekend colon kankerverwekkend. ^07/05 Bij 90 dagen werden de dubbele punten geanalyseerd voor stamceltransplantatie mutaties. Deze tijd nodig om stamcellen volledig vullen een crypte en slechts als een gehele crypt veroorzaakt geen G6PD een crypte geïdentificeerd als een stamcel mutant. Voorbeelden van volledig mutant crypten zijn weergegeven in figuur 2. De figuur toont twee verschillende oriëntaties (verticaal en horizontaal) van de crypten die optreden bij het ​​bereiden van de bevroren secties. De verticale weergave is op zoek naar beneden de lange as van de crypte, terwijl de horizontale biedt een zijaanzicht. De schreeuwpts dat zijn wild type voor G6PD blauwe vlek met wat wit, dat is te wijten aan de slijmvliezen productie van slijmbekercellen. Door het tellen van het totaal aantal crypten op een slede (figuur 1) en het aantal gemuteerde crypten, kan het MF voor gemuteerde crypten berekend. Nr gemuteerde crypten werden waargenomen in één van> 100.000 wildtype crypten geïnspecteerd in de controle (PBS behandelde) muizen. Wij stellen de MF de controlemuizen worden <0.1x10 ^-4, dat dicht bij die eerder gerapporteerd voor C57BL / 6-muizen. ¹

Figuur 1. Voorbereiding van de dia's voor G6PD kleuring reagens. (A) Twee 1,5 cm x 0,15 cm stalen ringen (inwendige diameter x hoogte) samen afgedicht met siliconen vet. Parafilm wordt vervolgens gesneden met de basis van de put met het midden fit uitgesneden en de put geplaatst over de Zwitserse gewalste colon weefselcoupes opde dia. (B) twee aangrenzende coupes van 7 urn sneden op hetzelfde glas tegelijkertijd gelegd en gekleurd. Schaal bar: 1,0 cm. (C) Het aantal crypten in de sectie wordt bepaald door te kijken naar de weefsel bij 10x vergroting. Het aantal velden (weergegeven als boxen) verschilt per sectie. Het aantal crypten in elk veld wordt bepaald door visueel tellen en toegevoegd aan het totale aantal crypten voor dat niveau geven. (D) A wordt gedefinieerd als vier opeenvolgende 7 urn weefselcoupes. De levels zijn> 50 urn uit elkaar om overlap met eerder geëvalueerd crypten te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Representatieve voorbeeldenvan gemuteerde crypten waargenomen in AOM behandeld C57Bl / 6 mannelijke muizen die niet produceren functionele G6PD. De G6PD mutant crypten zijn goed gedefinieerd, maar zijn vrijwel verstoken van blauwe vlek. Wildtype crypten dat de meeste crypten in het perceel zijn blauw / paarse aangeeft G6PD enzymatische activiteit. Schaal. 10 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

behandeling	incidentie van mutant crypten	mutant crypten een	totale crypten geanalyseerd	MF (x 10 -4)
solvent	0/6 muizen	0	> 10 5	<0,10
AOM	10/12 muizen	43	96.821	60; 4.44

Tabel 1. mutatiefrequentie bij onbehandelde en behandelde azoxymethane C57BL / 6 muizen. ¹²
Colonic stamcellen mutaties in WT C57BL / 6-muizen 90 dagen na blootstelling aan 10 mg / kg azoxymethaan (AOM) of oplosmiddelcontrole.

Discussion

Vaak genotoxische effect van een verbinding wordt bepaald door zijn vermogen om DNA te wijzigen. Dit gebeurt normaal gesproken door het isoleren van het weefsel en het meten van het globale niveau van DNA adducten. Voor AOM, zou dit inhouden kwantificeren O ⁶ methylguanine adducten in de colon. Met deze aanpak gegevens over schade in specifieke celtypen, zoals in de stamcelniche, verloren. Verder een DNA adduct is niet hetzelfde als een mutatie aangezien slechts een klein deel van adducten uiteindelijk worden omgezet in vaste mutaties. ¹² We geven hier de gegevens reproduceerbaar kwantificeren stamcellen mutaties in het colon basis van de eerste beschreven door Griffiths et al. ¹ en gebaseerd op G6PD kleuring ontwikkeld door VanNorden. ^4,8,9,13,14

Er zijn verschillende kritische stappen van dit enzym histochemie methode om een ​​meetbare resultaat. Men is in het snijden van het weefsel. Significant meer weefsel sekteionen worden gegenereerd en geanalyseerd dan doorgaans gebeurt met H & E histologische analyse. We hebben vastgesteld dat 7 urn secties gaf het beste G6PD kleuring na evaluatie van 5, 6, 7, 8 en 10 urn dikke secties.

Ten tweede, het kleuren van de noodzakelijke aantal waardevolle weefselsecties vereist een reproduceerbare reactiemengsel. We hebben het gebruik van polyvinylalcohol (PVA) in het oorspronkelijke protocol problematisch omdat het vrij dunner bij de oplossing percentages (18% en hoger) nodig om het enzym histochemie reactie, terwijl het voorkomen van de verspreiding van de G6PD enzym uit de vergemakkelijking weefsel. Een betere oplosbaarheid van de reagentia en controle van de pH werd bewerkstelligd door het vervangen van de PVA oktober medium, dat 10% PVA bevat. De pH kan nauwkeurig worden bepaald met pH-papier en als de pH niet dicht bij 7,4, wordt de oplossing zonder verspilling van kostbare tijd weefselmonster en weggegooid. Deze wijziging heeft geleid tot een betere en merts consistente kleuring in de weefselsecties. Aan de pH (7,2-7,4) nodig om G6PD activiteit te meten, het volledige reactiemengsel een karakteristieke duidelijke diep oranje-rode kleur, die langzaam verandert naar paars. Ongeacht de kleur, als de reactie kleuroplossing troebel moet worden weggegooid omdat deze niet veroorloven goede kleuring. We vonden dat sommige veel oktober medium ontvangen mengsels buiten het gewenste pH-traject dus is het raadzaam om veel testen door toevoeging van de PB (7,4) aan de oktober medium en het bepalen van de pH. Wij gebruikten ook MMPMS zoals eerder gesuggereerd, ^8,9 in plaats van de 5-methylphenazenium methylsulfaat gebruikt in de originele papieren ¹ om de lichtgevoeligheid van de G6PD kleuring reactiemengsel te elimineren.

Ten slotte is de werkwijze voor het afleiden van de MF nieuw is in vergelijking met andere werkwijzen eerder werkzaam. ^1,2 kleuring artefacten kan leiden tot de mogelijke identificatie van valse G6PD mutant crypten. Oplossen tzijn probleem, analyseerden we 4 aangrenzende 7 urn weefselcoupes die het mogelijk maakt visualisatie van dezelfde gemuteerde crypte in meerdere weefselsectie (figuur 4D). Deze verificatie vermindert de kans op vlekken artefacten die de MF analyse. Ook maakt gebruik van onze methode een werkelijke waarde van de totale crypten geteld te schatten het totale aantal crypten geanalyseerd bij de berekening van de MF.

Vanwege de unieke structuur crypte in de dunne en dikke darm, is het mogelijk om de locatie van stamcellen en cellijn per crypt bepalen. Een belangrijke beperking van de aanpak is dat het is beperkt tot de darm, omdat de morfologie van andere weefsels is niet zo goed gedefinieerd in het colon. Daarom is het niet mogelijk om de stamcellen MF bepalen meeste andere weefsels die vatbaar zijn voor kanker. Aangezien de test een fenotypische test gebaseerd op het verlies van G6PD enzymatische activiteit, de eigenlijke MF in de stamcelpopulatie zalhoger dan we melden voor G6PD gevolg van mutaties op wobble bases en punt mutaties die geen significante verandering van enzymatische activiteit.

Hoewel er beperkingen en uitdagingen voor kleuring voor G6PD activiteit in colon weefsel somatische stamcellen mutaties te kwantificeren, werden belangrijke wijzigingen in deze paper geïntroduceerd om de haalbaarheid van het gebruik van deze werkwijze te verbeteren. We vonden dat deze wijzigingen is de reproduceerbaarheid van het genereren van de G6PD de kleurstof en kwantificering van de MF. Bovendien kleuring voor G6PD enzymactiviteit als een marker voor somatische stamcel mutaties heeft een expertise in immunohistochemische kleuring vereisen als zou het testen van de expressie van metallothioneïne, ¹⁵ andere potentiële marker somatische stamcellen mutaties.

In de toekomst zullen we analyseren colon stamcellen mutaties bij muizen behandeld met milieu-verbindingen, zoals 2-amino-1-methyl-6-fenylimidazo [4,5-b] pyridine (PhIP) En andere aromatische amines in gegrild vlees, die worden geassocieerd met humane dikke darm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room