結腸幹細胞変異の定量

Abstract

幹細胞の変異を測定する能力は、化学物質が潜在的に癌を引き起こす突然変異を誘発することができた場合、どの程度に重要な細胞集団に定量化するための強力なツールです。 X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で幹細胞変異を定量化するための酵素アッセイの使用は、以前に報告されている^。1この方法は、得られる反応混合物と切片の組織の凍結切片とのインキュベーションの準備が必要青色細胞は、機能的なグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）酵素を生成した場合。そうでない場合、細胞が白っぽく見えます。我々は、ポリビニルアルコールの代わりに、最適切削温度化合物（OCT）培地を用いて反応混合物に変更しました。これは、pH測定を容易にG6PD染色成分の可溶化を増加させ、G6PD酵素の拡散を制限します。突然変異は、幹細胞で生じたことを実証するために、全体の陰窩はG6PD酵素を欠いている必要があります活動。幹細胞が抱いている場合のみ、表現型G6PD変異は陰窩における子孫のすべては、G6PD酵素活性を欠くであろう。幹細胞変異を有する陰窩を識別するために、4つの連続した​​隣接する凍結切片（レベル）が7μmの厚さで切断しました。隣接するカットを作るこのアプローチは、同じ変異した地下室は、隣​​接するセクションで観察されるので、地下室が完全に変異させたコンホメーションを提供します。 50μmより離れた組織サンプルとスライドは、マウスあたり> 10 ⁴陰窩の合計を評価するために調製しました。突然変異頻度は、治療群では、野生型（青）陰窩の数で÷観測された変異した（白）陰窩の数です。

Introduction

大腸癌は、DNAに損傷を与えることができ、環境エージェントと食物成分への曝露を伴い、（ 例えば 、APC）の腫瘍抑制遺伝子に変異を癌遺伝子に体細胞変異を活性化（例えば、β-カテニン）または不活性化生成すると考えられています。これは、これらの重要な突然変異は結腸幹細胞において生じることが想定されます。なぜなら結腸上皮の固有の暗号アーキテクチャのために、それは、結腸発癌に関連する化学物質に動物を曝露した後に、結腸中の幹細胞の変異を測定することができます。突然変異がクリプト内の全ての細胞に存在することになるなど、いくつかのX連鎖酵素は、幹細胞で起こる突然変異のための指標としての役割を果たすことができます。

以前は、手順は、マウスにおいて結腸腫瘍を誘発する化学物質はまた、X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）遺伝子の突然変異の分析によって結腸における体性幹細胞の突然変異を生成することを実証掲載されました^。1-3この方法は、任意選択圧なしで結腸幹細胞におけるランダムな体細胞変異の発生率を定量化します。手順は、処理されたマウスおよび対照マウスからの未固定凍結された大腸セクションの生産と機能G6PD活性を産生する細胞を欠いている陰窩の同定を含みます。 、白く見えるこれらの変異した陰窩は、変異はまた、変異したG6PD遺伝子を有する子孫を生じさせた幹細胞で発生したことを示しています。酵素アッセイでは、G6PD欠損変異体の陰窩は、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）の還元のために必要とされるグルコース-6-リン酸を酸化することができません。 G6PD酵素が機能している場合には、染色用混合物中のNBT青色酵素及び「染色」は、細胞の位置に蓄積し、不溶性のホルマザン沈殿物に還元されます。 G6PDの変異体である細胞は青く染色された野生型陰窩とは対照的に白っぽいまま。この方法は、「ヌル」表現型を有する変異を測定します。 enため、zymes、例えば、G6PDとして、切片を水溶液中に置かれた場合に非固定組織切片上で細胞外に拡散することができ、それは分析されるべき組織切片中の酵素を安定化するために必要^であり、図4中の酵素の安定化組織は、G6PD酵素反応に必要な試薬の小分子の拡散を妨害してはなりません。

私たちは、元のプロシージャに大幅な変更の数を行いました。重要な酵素染色培地は、pH制御およびアッセイにおいて使用される成分の可溶化を容易に最適切削温度化合物（OCT）にポリビニルアルコールから変更されています。それぞれの組織切片は、G6PD反応混合物の同じ量を受信するようにスチールワッシャからなる0.5 mlのウェル - 染色は、0.4を用いて行われます。手順がなくても、結腸組織の大規模なサンプリングを提供して撮像されたセクション内の陰窩の数を推定するために開発されましたmanually>各コロンのための10 ⁵陰窩をカウントします。隣接7μmの組織切片の分析は、潜在的な染色アーチファクトを低減する複数のスライド上の変異陰窩の視覚化を提供します。これらの変更は、手順がより効率的かつ再現可能にします。

この修正されたプロトコルを使用して、我々は、げっ歯類においてよく知られている結腸の発癌物質のアゾキシメタンをC57BL / 6マウスの曝露後の結腸幹細胞の突然変異頻度を定量化している^。5-7

Protocol

実験手順や動物の倫理的な治療は、ピッツバーグ大学IACUC（プロトコル＃1104674）によって承認されました。

G6PDの染色用混合物の調製

注：次のように各試薬の最終濃度であることを確認してください。 5mMのグルコース-6-リン酸（G6P）。 2mMのNADP、5mMのMgCl _2、0.35 mMの1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート（MMPMS）及び0.8mMのNBTの初期濃度は40 mlの最終容積のために導出された各試薬については^1,8,9。溶液を、新たに調製し、毎日使用しました。

1. 50mlのチューブに10月培地35 mlに200mMのpH7.4のリン酸緩衝液（PB）の2ミリリットルを加え、激しく振ります。ソリューションは、pH約7.4であるpH試験紙で確認してください。そうでない場合は、解決策を捨てます。
2. 61ミリグラムG6Pが200mm PBの0.94ミリリットルに溶かし追加、61ミリグラムNADPは、200mMのPBの0.94ミリリットルに溶解し、41mgの_塩化マグネシウム_は 0.96ミリリットルの100mMのPBに溶解しました。 pHがあることを再確認〜7.4ウィット時間pH試験紙。ない〜7.4場合は、ソリューションを破棄します。
3. 200mMのPB（pH7.4）での0.25ミリリットルに溶かしMMPMS 5mgを追加します。精力的に透明な暗赤色のホモジネートを生成するために、得られた反応混合物を振ります。解決策が濁っている場合、混合物は捨ててください。反応混合物を含むチューブは、光への暴露を最小限に抑えるためにホイルで包まれています。最後のコンポーネント、NBTは、用意されている間、室温で反応混合物を保管してください。
4. Oリングと蓋2 mlチューブにNBTの164 mgの0.4 mlの無水ジメチルホルムアミド（DMF）と0.4 mlの無水エタノールを添加することにより、別々に5mMのNBT溶液を調製します。 loosely蓋を閉じます（しっかりと密封されていない）と、NBTが溶液になるまでオイルバスで活発な沸騰の解決策をもたらす^。8
5. 可溶化されたNBTを室温まで冷却した後、10月の反応混合物へのソリューションのすべてを追加し、透明な溶液を得るために、積極的に振るようにします。暗赤色またはパープに最初の橙赤色から溶液の色の変化を観察経時ル色。これは正常です。
6. 使用前に1時間37℃の暖かい部屋で、最終的なG6PD染色混合物を置きます。

2.動物の治療や組織採取

1. DNA損傷剤 、例えばで6週齢のC57BL / 6雄マウスを治療、腹腔内注射により200μlのPBSの容量で10mg / kgのアゾキシメタン（AOM）。腹腔内注射により200μlのPBS対照マウスを扱います。
2. IACUCプロトコルによって承認され、90日には、頸椎脱臼に続いてCO ₂窒息によりマウスを安楽死させます。
3. 外科的胸骨のベースにちょうど肛門上から腹腔を開きます。体腔から小腸に移動し、それを切除しないでください。ちょうど直腸に盲腸以下の低い腸を切除^。10
4. 慎重にマイクロ解剖ハサミを使用して、コロンの一辺に沿ってスライスし、きれいな滅菌PBSで洗浄することによって開かれたコロンから糞便を削除します。物品税スイスロールDの外側に向け腔側とコロン、および組織型内の場所^。10
5. 完全に10月の媒体にコロンを浸すと、液体N _2を含むデュワーに金型を配置します。プラスチックベースはちょうど10月の媒体が固体凍結されるまで液体N ₂と接触するように金型を持ちます。
6. 凍結切片を切断するまで-80で凍結組織ブロックを格納します。 G6PD酵素の不活性化をもたらす任意の固定液を、使用しないでください。

凍結切片の調製

1. -25℃でクライオスタットを用いて、7ミクロンの厚さで凍結組織切片をカットします。 4連続した7μmのセクションをカットし、同じスライド（ 図1）上でそれらのうちの2つを配置します。コロン（ 図1）の1つのレベルを表すために2スライド、または4つの連続した7μmの切片を作製。
2. PRの最後のセクションから>50μmの最小距離と次のレベルのために繰り返しeviousレベル。この距離は、各レベルについて評価陰窩が互いに重複していないことを確実にしました。
3. よく切断中に蓄積する10月の残留物を除去するために、100％エタノールでクライオスタットブレードを拭きます。切片が再開される前に、乾燥したブレードは、蓄積された静電荷を消散させる帯電防止ドライヤーシートで拭きます。 C. ^O -80で凍結切片と店舗スライド

凍結切片の組織の4染色

1. 湿度の高い37℃の暖かい部屋で、酵素組織化学反応を実行します。
   注：インキュベーションオーブン内またはスライドウォーマー上の酵素反応をしようとは、貧しい人々や一貫性のないG6PD染色につながりました。
2. シリコーングリース（ 図1）を使用して一緒に結合された2つの1.5センチメートルのx 0.15センチメートル鋼ワッシャー（内径×高さ）を使用して、組織染色用の井戸を構築します。中心とウェルのベースに合わせてパラフィルムをカット切り取り、井戸の場所スライド上の組織切片の上にD。
   注：洗濯機の底部にパラフィルムは、スライドし、組織切片上の粘性G6PD染色混合物を維持して座金との間にシールを作成します。研究では、各組織切片は、G6PD反応染色混合物の同じ体積を受信するように、0.5ミリリットル容量 - この構築物は0.4とよくを与えます。
3. 10分間、暖かい部屋で^37°Cの時に凍結した組織スライドをインキュベートします。 37℃で、45〜50分間、各組織切片ウェル（ス​​ライドあたり2つのセクション）にG6PD染色反応混合物を追加します。暖かい部屋からスライドを取り外し、慎重にスライドオフステンレス製の井戸を持ち上げます。
4. 反応媒体を排出できるようにするために彼らの長いエッジでスライドを設定します。組織染色を乱すことなく組織からG6PD染色反応混合物を除去するために30〜60分間、100mMのPB（pH7.4）中置きスライド。 PB塩を除去するために5〜10分間蒸留水中でスライドを沈めます
5. 追加することによって、組織をシール組織上にスポイトからフルオロゲルをると、それが乾燥するために〜30分を待っています。変異した陰窩の識別を混乱させるできる気泡を避けてください。
   注：気泡が形成した場合は、手順は、蒸留水に浸漬してフルオロゲルを除去した後に繰り返すことができます。彼らはトラップ気泡に傾向があるように、カバースリップを使用しないでください。

5. G6PD変異陰窩の決意と変異頻度

1. 光学顕微鏡下でG6PD変異陰窩のためのスライドを分析します。
   注：完全に変異クリプトを識別するために使用される基準は、（ⅰ）全体陰窩は青色を欠いていました。 （ii）の陰窩の外部構造（iii）は、変異体のcryptは、（iv）の二人の観察者は、変異体と同じ地下室を識別しなければならなかった、隣接する7μmの切片で観察した、無傷でした。隣接7μmの切片で観察された変異体は、1つの変異体としてカウントされます。
2. 画像各G6PD変異40倍の倍率でcryptと5.0メガピクセルのカメラとを使用して画像をカタログイメージングソフトウェア。
3. 10倍の倍率（図1C）で最小の表面積とイメージを持つレベルから各マウスについての代表的な部分を選択してマウスで調べた陰窩の合計数を定量化します。
   注：レベルは、その近接にしばしば複数のセクションに陰窩変異SHOW 4つの連続7μmの切片（ 図1D）を表します。レベルは、コロンの異なる領域から陰窩を可視化するためにミクロン50>で分離されています。
4. 各画像ファイルを開いて、視覚的に（ 図1Cにボックスとして示されている）ファイルを解析することにより、レベルに陰窩の数を数えます。画像ファイルは、一つのファイルに20〜300>に陰窩ような低いから観察陰窩の数が異なります。
5. 各コロンのためのG6PD変異陰窩についてスクリーニングレベルの数によって各マウスのために選択されたレベル（ 図1C）から陰窩の合計数を掛けます。例えば、の総数変異陰窩についてスクリーニング8レベルを乗じ選択されたレベルごとに1,250陰窩10,000陰窩の合計数に等しいです。統計分析のために各コロン10,000陰窩の最小値を評価します。
6. 各治療のため、MFを計算するためにスクリーニング陰窩の総数ですべての動物で観察された変異体の数を組み合わせます。未処理マウスにおける背景幹細胞MFレベルが<0.1x10 ^-4以前にC57BL / 6マウスで報告されているものに近い（ 表^1）、。11であります

Representative Results

動物に結腸幹細胞変異を測定する能力は、癌誘発に変異を相関させるユニークな方法を提供します。通常、これは、発癌における重要な段階は、癌遺伝子における突然変異を活性化および/または腫瘍抑制遺伝子における変異を不活性化することを含むものとします。私たちは、200μlのPBSまたはPBS200μl中10mg / kgのAOMとC57BL / 6マウスに注射。 AOMは、既知の大腸発がん性物質である。コロンは、幹細胞の変異について分析した90 ​​日目で^5-7。この時間は、幹細胞は完全に地下室を移入できるようにするために必要とされ、G6PDを生成しません全体の陰窩は、幹細胞の変異体として同定された地下室がある場合のみ。完全変異陰窩の例は、 図2に示されている。この図は、凍結切片の調製に生じる陰窩の垂直方向と水平方向の二つの異なる方向を示しています。水平側面図を提供しながら、垂直ビューは、陰窩の長軸を見下ろしています。叫び杯細胞からの粘液産生に起因しているいくつかの白と青のG6PD染色のために、野生型であり、PTS。スライド上の陰窩の数（ 図1）および変異陰窩の数をカウントすることにより、変異陰窩ためMFを計算することができます。いいえ変異した陰窩は、コントロールで検査>10万野生型陰窩（PBS処理）マウスのいずれにおいても観察されませんでした。私たちは<0.1x10 ^-4、C57BL / 6マウスのために、以前に報告されているものに近いどのように対照マウス用のMFを設定します^。1

G6PD染色試薬用スライドの調製図。 （A）2 1.5 cmでX 0.15センチメートルの鋼ワッシャー（内径×高さ）のシリコーングリースを使用して一緒に封止されています。パラフィルムは、その後、中心とウェルのベースに合わせてカット切り出し、スイスの大腸組織切片をロールの上にも配置されていますスライド。 （B）隣接7ミクロンのカットからの2つの組織切片を、同時に同じスライド上に配置され、染色されます。スケールバー：1.0 cmでした。 （C）項における陰窩の数を10倍の倍率で組織を調べることによって決定されます。 （ボックスとして示される）フィールドの数は、各部分に応じて変化します。各分野の陰窩の数は、視覚的な計数によって決定され、そのレベルの陰窩の合計数を算出するために追加されます。 （D）レベルを4つの連続した7ミクロンの組織切片として定義されます。レベルは以前に評価陰窩との重複を避けるために、離れて> 50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.代表的な例AOMで観察された変異した陰窩の。機能G6PDを生成しないC57BL / 6雄マウスを治療G6PD変異体の陰窩は、明確に定義されたが、ブルー染色の事実上欠いているされています。フィールドの陰窩のほとんどを含み、野生型陰窩は、青/紫示すG6PD酵素活性です。スケール：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

治療	変異型陰窩の発生率	変異陰窩	分析総陰窩	MF（×10 -4）
溶剤	0/6マウス	0	> 10 5	<0.10
AOM	10/12マウス	43	96821	60; 4.44

C57BL / 6マウス未処置及びアゾキシメタン表1.突然変異頻度^。12
90日10mg / kgのアゾキシメタン（AOM）または溶媒対照への曝露後、WT C57BL / 6マウスにおける結腸幹細胞の突然変異。

Discussion

多くの場合、化合物の遺伝毒性作用はDNAを改変する能力によって決定されます。これは通常、組織を単離し、DNA付加体の全体的なレベルを測定することによって行われます。 AOMの場合、これはOを結腸⁶ -メチルグアニン付加物を定量伴います。そのような幹細胞ニッチのような特定の細胞型内の損傷に対するこのアプローチの情報を使用して、失われます。付加体の小さなサブセットのみが最終的に固定された変異に変換されているのでまた、DNA付加体は、変異と同じではありません^{。12私たち}は再現可能グリフィスによって記述最初の方式に基づいて、結腸中の幹細胞変異を定量化するために、本 ​​明細書に詳細を提供ら ¹とVanNordenによって開発されたG6PD染色に基づく^{。4,8,9,13,14}

定量化の結果を生成するには、この酵素の組織化学法のためのいくつかの重要なステップがあります。一つは、組織の切片です。かなり多くの組織派イオンが生成され、典型的には、H＆E組織学的分析で行われるであろうものよりも分析する必要があります。我々は、7ミクロンのセクションでは、5、6、7、8、10ミクロンの厚さの切片を評価した後、最高のG6PD染色が得られたと判断しました。

第二に、貴重な組織切片の必要数を染色すると、再現性の反応混合物を必要としました。我々はそれからG6PD酵素の拡散を防止しつつ、酵素組織化学反応を促進するために溶液の割合（18％以上）必要に非常に粘性であるため、元のプロトコルで使用されるポリビニルアルコール（PVA）の使用は問題があることがわかっ組織。試薬およびpHの制御をより良く可溶化は、10％のPVAを含んでいるのOCT培地でPVAを置換することにより達成されました。 pHが正確にpH試験紙を用いて決定することができ、pHが7.4に近くない場合、解決策は、貴重な組織サンプルと時間を無駄にすることなく廃棄されます。この変更は、より良い、そしてmにつながりました組織切片で一貫性のある染色を鉱石。 G6PD活性を測定するために必要なpH（7.2-7.4）で、完全な反応混合物をゆっくりと紫色に変わります特徴明確な深い橙赤色の色を持っています。関係なく色の、反応染色液は、それが良い染色を買う余裕はないので、それは廃棄されるべき混濁されている場合。我々は、10月の媒体へのPB（7.4）を添加してpHを測定することによって多くをテストすることをお勧めしますので、10月の媒体のいくつかの多くは、必要なpH範囲外の混合物をしていることが分かりました。以前に示唆されているように我々はまた、MMPMSを使用し、むしろG6PD染色反応混合物の光感度を排除するために、元の紙^{1で使用した} 5-methylphenazeniumメチル硫酸塩よりも^8,9。

最後に、MFを導出するための方法は、以前に使用される他の方法に比べて新規である^。1,2染色アーチファクトが偽G6PD変異陰窩の潜在的な識別につながることができます。トンのトラブルシューティングを行うには彼の問題は、我々は、複数の組織切片（ 図4D）で同じ変異した地下室の可視化を可能にする4連続した7ミクロンの組織切片を分析しました。この検証は、MFの分析に影響を与える成果物を染色する可能性を低減します。また、私たちの方法は、MFを計算するときに分析陰窩の合計数を推定するためにカウント合計陰窩の実際の値を使用しています。

なぜなら、小腸および大腸に見られる独特の陰窩構造は、各陰窩のための幹細胞の位置及び細胞系統を決定することができます。アプローチの主要な制限は、他の組織の形態が同様にコロンのように定義されていないため、それが腸に限定されていることです。したがって、癌の影響を受けやすい他のほとんどの組織における幹細胞MFを決定することは不可能です。アッセイは、表現型アッセイはG6PD酵素活性の喪失に基づいているので、幹細胞集団の実際のMFは、意志私たちが原因で大幅酵素活性に影響を及ぼさないゆらぎ塩基での変異および点変異にG6PDのレポートよりも高くなります。

限界や課題は体性幹細胞変異を定量化するために結腸組織でG6PD活性について染色にありますが、大幅な変更は、この方法を利用する可能性を高めるために、本論文で紹介されました。我々は、これらの変更は、G6PD染色試薬を生成し、MFを定量化の再現性を増強することを見出しました。また、体性幹細胞の突然変異のためのマーカーとしてG6PD酵素活性のために染色することはメタロチオネイン^、15体性幹細胞の突然変異の別の潜在的なマーカーの発現のためのテストと同じように、免疫組織化学染色の専門知識を必要としません。

今後は、環境の化合物で処置したマウスにおいて結腸幹細胞突然変異を分析し、例えば2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b〕ピリジン（PHIPとして）およびヒト結腸癌と関連しているグリルの肉に見られる他の芳香族アミン。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room