Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

Abstract

A capacidade de medir mutações de células-tronco é uma ferramenta poderosa para quantificar em uma população de células crítico se, e em que medida, um produto químico pode induzir mutações que potencialmente levam ao câncer. O uso de um ensaio enzimático para a determinação de mutações de células estaminais no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato ligado ao X foi previamente relatada. ¹ Este método requer a preparação de secções congeladas e incubação do tecido seccionado com uma mistura de reacção que produz um cor azul, se as células de produzir uma enzima funcional da desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PD). Se não, as células parecem esbranquiçado. Modificou-se a mistura de reacção óptima utilizando o Composto Temperatura de corte (OCT) forma em lugar de álcool de polivinilo. Isto facilita a medição de pH, aumenta a solubilização dos componentes de coloração G6PD e restringe a difusão da enzima G6PD. Para demonstrar que a mutação ocorreu em uma célula estaminal, toda a cripta tem falta de G6PD enzimáticaactividade. Somente se uma célula-tronco abriga uma mutação G6PD fenotípica serão todos da descendência na cripta falta atividade enzimática da G6PD. Para identificar criptas com uma mutação de células-tronco, quatro cortes congelados adjacentes consecutivos (um nível) foram cortados em 7 mm espessura. Esta abordagem de fazer cortes adjacentes conformação que proporciona uma cripta foi completamente mutado desde o mesmo cripta mutado será observado nas secções adjacentes. As lâminas com amostras de tecido que eram mais do que 50 mm de intervalo, foram preparados para avaliar um total de> 10 ⁴ criptas por rato. A frequência de mutação é o número de mutantes (branco) criptas ÷ observados pelo número de tipo selvagem (azul) criptas em um grupo de tratamento.

Introduction

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem em células estaminais, como as mutações vão estar presentes em todas as células dentro de um cripta.

Anteriormente, foi publicado um procedimento demonstrando que os produtos químicos que induzem tumores do cólon em ratos também gerado mutações somáticas de células estaminais no cólon através de análise de mutações em glicose-6-fosfato desidrogenase ligada ao cromossoma X do gene (G6PD) ^1-3.O método quantifica a incidência de mutações somáticas aleatórios em células estaminais do cólon sem qualquer pressão selectiva. O procedimento envolve a produção de secções de cólon congelados não corrigidos de camundongos tratados e de controlo ea identificação das criptas desprovidas de células que produzem atividade G6PD funcional. Estes criptas mutadas, que aparecem branco, indicam que a mutação ocorreu em uma célula estaminal que deu origem a progénie também albergar um gene G6PD mutado. No ensaio enzimático, G6PD criptas mutante deficiente não pode oxidar a glicose-6-fosfato, o qual é necessário para a redução de nitro azul de tetrazólio (NBT). Quando a enzima é funcional em G6PD, o NBT na mistura corante é reduzida a formazano insolúvel e precipitados, acumulando no local da enzima e células "azuis" de coloração. As células que são mutantes G6PD permanecem esbranquiçada em contraste com corados com Azul criptas do tipo selvagem. Este método mede a mutações que têm um fenótipo "nulo". Porque enZymes, tais como G6PD, pode difundir para fora das células sobre uma secção de tecido não fixado se as secções são colocadas numa solução aquosa, que é necessário para estabilizar a enzima nas secções de tecido a serem analisadas. ⁴ A estabilização da enzima na tecido não deve interferir com a difusão de moléculas pequenas de reagentes necessários para a reacção enzimática de G6PD.

Fizemos uma série de mudanças significativas para o processo inicial. O meio para a coloração enzimática crítico foi alterado de álcool polivinílico óptima para o Composto Temperatura de corte (OCT), o que facilita o controlo do pH e a solubilização dos componentes utilizados no ensaio. A coloração é realizada usando 0,4 - 0,5 ml poços feitas de anilhas de aço de modo a que cada secção de tecido recebeu o mesmo volume da mistura de reacção de G6PD. Um procedimento foi desenvolvido para estimar o número de criptas em uma secção trabalhada que fornece uma grande amostragem de tecido do cólon sem terpara contar manualmente> 10 ⁵ para cada criptas do cólon. A análise de 7 uM secções de tecido adjacentes proporciona a visualização de uma cripta mutante em mais de uma corrediça, o que reduz os potenciais artefactos de coloração. Estas alterações tornam o procedimento mais eficiente e reprodutível.

Usando este protocolo revisto, temos quantificada a frequência de mutação em células estaminais do cólon após a exposição de ratinhos C57BL / 6 para azoximetano, um carcinogéneo cólon bem conhecido em roedores. ^5-7

Protocol

Os procedimentos experimentais e tratamento ético dos animais foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh IACUC (protocolo nº 1104674).

1. Preparação de G6PD Coloração Mistura

NOTA: Certifique-se de que a concentração final de cada um dos reagentes é a seguinte; 5 mM de glicose-6-fosfato (G6P); NADP 2 mM, 5 _mM de MgCl2, 0,35 mM de 1-metoxi-5-methylphenazinium sulfato de metilo (MMPMS) e 0,8 mM de NBT ^1,8,9 Para cada reagente a concentração inicial foi derivado para um volume final de 40 ml.. As soluções foram preparados e utilizados a cada dia.

1. Adicionar 2 ml de mM pH 7,4 tampão de fosfato 200 (PB) para 35 ml de meio de outubro em um tubo de 50 mL e agitar vigorosamente. Confirmar com papel de pH que a solução é ~ pH 7,4. Se não descartar a solução.
2. Adicionar 61 mg G6P dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg de NADP dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, e 41 mg _de MgCl2 dissolvido em 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que o pH é de ~ 7,4 sagacidadeh papel de pH. Se não ~ 7.4, rejeitar a solução.
3. Adicionam-se 5 mg de MMPMS dissolvidos em 0,25 ml de OP 200 mM (pH 7,4). Agitar vigorosamente a mistura de reacção resultante para gerar um homogeneizado claro vermelho escuro. Se a solução é turva, a mistura deve ser descartado. O tubo contendo a mistura reaccional é envolvido em folha para minimizar a exposição à luz. Armazenar a mistura de reacção à temperatura ambiente, enquanto o componente final, o NBT, é preparado.
4. Preparar separadamente uma solução de NBT 5 mM pela adição de 0,4 ml de dimetilformamida anidra (DMF) e 0,4 ml de etanol anidro a 164 mg de NBT em um tubo de 2 ml com uma tampa de O-ring. Fechar a tampa solta (não hermeticamente fechado) e levar a solução a ebulição vigorosa num banho de óleo até o NBT é em solução. ⁸
5. Permitir que o NBT solubilizado a arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar toda a solução à mistura reaccional PTU e agitar vigorosamente para se obter uma solução clara. Observar a mudança de cor da solução de vermelho-alaranjado inicial a um vermelho-escuro ou purple cor ao longo do tempo. Isto é normal.
6. Coloque a mistura final coloração de G6PD num banho a 37 ° C sala quente durante 1 h antes da utilização.

2. Tratamento Animal e Recolha de Tecidos

1. Tratar de 6 semanas de idade C57BL / 6, machos, com agente de danificação do ADN, por exemplo, 10 mg / kg de azoximetano (AOM), num volume de 200 ul de PBS por injecção ip. Tratar ratinhos de controlo com 200 mL de PBS por injecção ip.
2. Aos 90 dias, eutanásia ratos _por asfixia com CO2 seguido por deslocamento cervical aprovado pelo protocolo IACUC.
3. Cirurgicamente abrir a cavidade abdominal, desde um pouco acima do ânus para a base do esterno. Mover o intestino delgado para fora da cavidade do corpo, mas que não excisar. Extirpar o intestino grosso, logo abaixo do ceco ao reto. ¹⁰
4. Slice cuidadosamente ao longo de um lado do cólon usando uma tesoura de micro-dissecção e remover as fezes do cólon aberto limpo por lavagem com PBS estéril. Rocambole a impostos especiais de consumod colon com o lado luminal voltado para fora, e coloque em um molde de tecido ^10.
5. Mergulhe completamente o cólon em outubro médio e lugar molde em uma Dewar contendo líquido _N2. Segurar o molde de modo que a base de plástico é apenas em contacto com o líquido _de N2 até a forma OCT é congelado.
6. Armazenar o bloco de tecido congelado a -80 até o corte cortes congelados. Não utilizar qualquer fixador, o que iria resultar na inactivação da enzima G6PD.

3. Preparação de secções congeladas

1. Os cortes de tecido congelado com uma espessura de 7 uM utilizando um criostato a -25 ° C. Corte 4 consecutivos 7 mm seções e colocar dois deles na mesma lâmina (Figura 1). Preparar 2 corrediças, ou quatro secções consecutivas 7 uM para representar um nível do cólon (Figura 1).
2. Repita o procedimento para o próximo nível com uma distância mínima de> 50 mm a partir da última seção do prnível evious. Esta distância assegurado que as criptas avaliada para cada nível não duplicar um ao outro.
3. Frequentemente limpar a lâmina de criostato com etanol a 100% para remover o resíduo OCT que se acumula durante o corte. Antes de seccionamento seja retomada, a lâmina seca é limpa com uma folha de secador antiestática para dissipar a carga estática acumulada. Loja slides com as secções congeladas a -80 ^{o C.}

4. Coloração de congelação do tecido

1. Realizar a reação histoquímica da enzima em um 37 ° C sala quente com humidade elevada.
   NOTA: A tentativa da reação enzimática em um forno de incubação ou sobre um aquecedor de slides levou a coloração G6PD pobre e inconsistente.
2. Construção de poços para a coloração de tecidos usando dois 1,5 cm x 0,15 cm anilhas de aço (diâmetro interior x altura) que estão ligadas em conjunto com massa de silicone (Figura 1). Cortar o parafilme para encaixar a base do poço com o centro cortado e o bem lugard através da secção de tecido no slide.
   NOTA: O parafilme na parte inferior da máquina de lavar cria uma vedação entre a corrediça e a anilha que mantém a mistura de coloração de G6PD viscoso sobre a secção de tecido. Esta construção proporciona um poço com um 0,4 - 0,5 ml de volume de modo a que cada secção de tecido no estudo recebem o mesmo volume da mistura de reacção de coloração de G6PD.
3. Incubar as lâminas de tecido congelado a 37 ^{o C} em uma sala quente por 10 min. A 37 ° C, adiciona-se a mistura reaccional de coloração de G6PD a cada poço secção de tecido (2 secções por diapositivo) para 45-50 min. Remover as lâminas da sala quente, e retire cuidadosamente os poços de aço inoxidável fora dos slides.
4. Definir slides em sua borda longa para permitir que o meio de reação para drenar. Colocar as lâminas em PB 100 mM (pH 7,4) durante 30-60 minutos para remover a mistura de reacção de G6PD coloração do tecido, sem perturbar a coloração de tecidos. Mergulhe as lâminas em água destilada por 5-10 min para remover os sais PB
5. Selar o tecido por adding fluoro-gel a partir de um conta-gotas sobre o tecido e espera ~ 30 minutos para secar. Evitar bolhas que podem confundir a identificação de criptas mutados.
   NOTA: Se se formem bolhas, o procedimento pode ser repetido depois da remoção da f luoro-gel por imersão em água destilada. Não use lamelas como eles tendem a bolhas de ar armadilha.

5. Determinação da G6PD Mutant criptas e Mutação Freqüência

1. Analisar escorregas para G6PD criptas mutantes sob um microscópio de luz.
   NOTA: Os critérios utilizados para identificar uma cripta totalmente mutante foram: (i) toda a cripta era desprovido de cor azul; (ii) a estrutura externa da cripta estava intacto, (iii) o mutante cripta foi observada em secções adjacentes 7 uM e, (iv) tinha dois observadores para identificar o mesmo cripta como um mutante. Mutantes observadas em adjacentes 7 mm seções são contados como um mutante.
2. Imagem cada cripta mutante G6PD em 40x e catalogar as imagens usando uma câmera de 5.0 megapixel comsoftware de imagem.
3. Quantificar o número total de criptas examinados num murganho, seleccionando uma secção representativa para cada rato a partir do nível com a área de superfície menor que a imagem e ampliação de 10x (Figura 1C).
   NOTA: A nível representa quatro consecutivos 7 mm seções (Figura 1D), que devido à sua proximidade muitas vezes mostram criptas mutantes em mais de uma seção. Os níveis são separados por> 50 fim de visualizar a partir de diferentes áreas de criptas do cólon.
4. Abrir cada ficheiro de imagem visual e contagem do número de criptas em um nível através da análise dos arquivos (mostrados como caixas na Figura 1C). Arquivos de imagens irão variar no número de criptas observados a partir de tão baixo quanto 20 a> 300 criptas em um arquivo.
5. Multiplicar o número total de criptas do nível seleccionado (Figura 1C) para cada rato ao número de níveis rastreados para criptas G6PD mutantes para cada um dos dois pontos. Por exemplo, uma contagem total de1.250 criptas por nível selecionado, multiplicado por 8 níveis selecionados para criptas mutantes é igual a uma contagem total de 10.000 criptas. Avaliar um mínimo de 10.000 criptas para cada cólon para análise estatística.
6. Combinar o número de mutantes observadas em todos os animais pelo número total de criptas rastreados para calcular o MF para cada tratamento. O nível MF células-tronco em ratos não tratados fundo é <0.1x10 ^-4 (Tabela 1), que é próximo ao relatado anteriormente em camundongos C57BL / 6. ¹¹

Representative Results

A capacidade de medir mutações de células-tronco de cólon em animais oferece uma maneira única de correlacionar mutações para indução de cancro. Normalmente, presume-se que o passo crítico na carcinogénese envolve a activação de mutações em oncogenes e / ou inactivação de mutações em genes supressores de tumores. Nós injectados ratinhos C57BL / 6 com 200 ul de PBS ou 10 mg / kg OMA em 200 ul de PBS. OMA é uma substância cancerígena conhecida cólon. ^5-7 Aos 90 dias os dois pontos foram analisados ​​para mutações de células-tronco. É necessária neste momento para permitir que as células-tronco para preencher totalmente a cripta, e somente quando uma cripta inteira não produz G6PD é uma cripta identificado como um mutante com células-tronco. Exemplos de criptas totalmente mutantes estão apresentados na Figura 2. A figura mostra duas orientações diferentes (vertical e horizontal) de criptas que ocorrem na preparação de secções congeladas. A visão vertical está olhando para baixo ao longo eixo da cripta enquanto a horizontal proporciona uma vista lateral. O gritoPontos que são do tipo selvagem para G6PD azul com algum branco que é devido à produção de muco das células caliciformes mancha. Por contagem do número total de criptas em uma corrediça (Figura 1) e o número de criptas mutadas, o MF para criptas mutados pode ser calculada. Nenhuma criptas mutados foram observados em qualquer um dos> 100.000 criptas do tipo selvagem inspeccionados no controlo (tratado com PBS) em ratos. Vamos definir o MF para os ratos de controle para ser <0.1x10 ^-4, que fica próximo ao relatado anteriormente para camundongos C57BL / 6. ¹

Figura 1. Preparação de lâminas para coloração reagente G6PD. (A) arruelas Duas 1,5 centímetros x 0,15 centímetros de aço (interior diâmetro x altura) são selados juntos usando graxa de silicone. Parafilm é então cortada para se encaixar na base do poço com o centro cortado e o bem colocado sobre o suíço laminados de tecido do cólon sobreo slide. (B) Dois secções de tecido a partir de 7 uM cortes adjacentes são colocados na mesma lâmina e coradas ao mesmo tempo. Barra de escala: 1,0 cm. (C) O número de criptas na seção é determinada por olhar para o tecido na ampliação de 10x. O número de campos (mostrados como caixas) varia de acordo com cada secção. O número de criptas em cada campo é determinado por contagem visual e adicionada para se obter o número total de criptas para esse nível. (D) Um nível é definido como quatro secções consecutivas de tecido de 7 um. Os níveis são> 50 mm para além de evitar a sobreposição com criptas anteriormente avaliados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Exemplos representativosde criptas mutantes observados em OMA tratados ratos C57BL / 6 do sexo masculino que não produzem de G6PD funcional. As criptas G6PD mutantes são bem definidas, mas são praticamente desprovidos de mancha azul. Criptas tipo selvagem que compõem a maior parte das criptas no campo são indicando atividade enzimática da G6PD azul / roxo. Escala:. 10 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tratamento	incidência de criptas mutantes	criptas um mutante	Total de criptas analisadas	MF (x 10 -4)
solvente	0/6 ratos	0	> 10 5	<0,10
AOM	10/12 ratos	43	96821	60; 4.44

Tabela 1. frequência de mutação em azoximetano tratadas e não tratadas camundongos C57BL / 6. ¹²
Mutações de células estaminais de cólon em WT ratinhos C57BL / 6 90 dias após a exposição a 10 mg / kg de azoximetano (AOM) ou controlo de solvente.

Discussion

Muitas vezes a efeitos genotóxicos de um composto é determinada pela sua capacidade de modificar o ADN. Isso normalmente é feito pelo isolamento do tecido e medindo o nível global do adutos de DNA. Para AOM, isso envolveria quantificar O ⁶ -metilguanina adutos no cólon. Usando esta abordagem informações sobre os danos dentro tipos celulares específicos, tais como no nicho de células estaminais, é perdido. Além disso, um produto de adição de ADN não é o mesmo que uma mutação uma vez que apenas um pequeno subconjunto de aductos são finalmente convertidos em mutações fixos. ¹² Fornecemos aqui apresentados os detalhes para quantificar de forma reprodutível mutações de células estaminais no cólon com base no método inicial descrita por Griffiths et ai. ^{1 e com base} na coloração de G6PD desenvolvido por VanNorden. ^4,8,9,13,14

Há vários passos críticos para este método histoquímica da enzima para produzir um resultado quantificável. Um deles é no corte dos tecidos. Significativamente mais seita tecidoiões deve ser gerada e analisada do que o que seria tipicamente feito com análise histológica de H & E. Nós determinamos que 7 mm seções proporcionou a melhor coloração G6PD após avaliação de 5, 6, 7, 8 e 10 mm de espessura.

Em segundo lugar, o número necessário de coloração de secções de tecido valiosos necessária uma mistura de reacção reprodutível. Descobrimos a utilização de álcool de polivinilo (PVA) usado no protocolo original para ser problemático porque é bastante viscoso, nas percentagens de solução (18% e superior) necessário para facilitar a reacção histoquímica enzima, evitando a difusão da enzima G6PD do tecido. Melhor solubilização dos reagentes e controlo do pH foi conseguido através da substituição do PVA com meio OCT, que contém 10% de PVA. O pH pode ser determinado com precisão com papel de pH e se o pH não está próximo de 7,4, a solução é descartada sem desperdiçar amostra de tecido e tempo precioso. Esta mudança levou a melhor e mminério de coloração consistente nas secções de tecido. Ao pH (7,2-7,4) necessária para medir a actividade de G6PD, a mistura reaccional completa tem uma cor clara característica de profundidade de laranja-vermelha, que vai mudar lentamente para púrpura. Independentemente da cor, se a solução de coloração reação estiver turva deve ser descartada, uma vez que não irá permitir boa coloração. Descobrimos que alguns lotes de meio OCT fornecida misturas fora do intervalo de pH pretendido por isso é aconselhável para testar lotes, adicionando o PB (7,4) ao meio OCT e determinação do pH. Nós também utilizado MMPMS como sugerido anteriormente, em vez de ^8,9 o sulfato de metil 5-methylphenazenium usado no artigo original ¹ para eliminar a sensibilidade à luz da mistura reaccional de coloração de G6PD.

Finalmente, o método para derivar o MF é nova em comparação com outros métodos anteriormente empregues. ^1,2 artefactos de coloração pode levar à identificação potencial de criptas mutantes falsa G6PD. Para solucionar to seu problema, foram analisados ​​4 contíguos secções de tecido de 7 um que permite a visualização da mesma cripta mutado em mais de uma secção de tecido (Figura 4D). Esta verificação reduz as possibilidades de coloração artefactos que afectam a análise MF. Além disso, o nosso método usa um valor real de criptas total contado para estimar o número total de criptas analisadas no cálculo do MF.

Devido à estrutura única da cripta encontrada no intestino delgado e grosso, é possível determinar a localização das células estaminais e para cada linhagem de células cripta. Um grande limitação para a abordagem é que ela é restrito para os intestinos porque a morfologia de outros tecidos não está bem definida como no cólon. Portanto, não é possível determinar a células estaminais MF na maioria dos outros tecidos que são susceptíveis a cancros. Uma vez que o ensaio é um ensaio fenotípico com base na perda de actividade enzimática de G6PD, o MF real na população de células estaminaisser maior do que para relatar G6PD devido a mutações em bases incertas e mutações pontuais que não afectem significativamente a actividade enzimática.

Embora existam limitações e desafios a revelação da atividade de G6PD no tecido do cólon para quantificar mutações de células-tronco somáticas, alterações significativas foram introduzidas neste trabalho para melhorar a viabilidade de utilizar este método. Verificou-se que estas alterações melhorada a reprodutibilidade de gerar o reagente de coloração de G6PD e quantificar o MF. Além disso, a coloração para a actividade da enzima G6PD como um marcador para as mutações somáticas de células estaminais não exige uma perícia na coloração imuno-histoquímica como seria testar para a expressão de metalotioneína, um outro marcador ^{15 de} potencial de mutações somáticas de células estaminais.

No futuro, vamos analisar mutações de células estaminais de cólon em ratinhos tratados com compostos ambientais, tais como 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo [4,5-b] piridina (PhIP) E outras aminas aromáticas encontradas em carnes grelhadas, que estão associados com câncer de cólon humano.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room