Abstract
Evnen til at måle stamceller mutationer er et kraftfuldt værktøj til at kvantificere i en kritisk cellepopulation, hvis og i hvilket omfang, kan en kemisk fremkalde mutationer, der potentielt føre til kræft. Anvendelsen af et enzymatisk assay til at kvantificere stamceller mutationer i X-bundet glucose-6-phosphat-dehydrogenase-genet er tidligere blevet rapporteret. 1 Denne metode kræver fremstillingen af frosne sektioner og inkubering af snit væv med en reaktionsblanding, der giver et blå farve, hvis cellerne producerer funktionelle glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PD) enzym. Hvis ikke, cellerne synes hvidlig. Vi har ændret reaktionsblandingen under anvendelse Optimal Cutting Temperatur Forbindelse (OLT) medium i stedet for polyvinylalkohol. Dette letter pH-måling, øger solubilisering af G6PD farvning komponenter og begrænser diffusion af G6PD enzymet. For at vise, at en mutation fandt sted i en stamcelle, skal hele krypten mangler G6PD enzymatiskaktivitet. Kun hvis en stamcelle huser en fænotypisk G6PD mutation vil alle afkommet i krypten mangler G6PD enzymatisk aktivitet. At identificere krypter med en stamcelle mutation blev fire på hinanden følgende tilstødende frosne sektioner (A-niveau) skåret på 7 um tykkelser. Denne fremgangsmåde til fremstilling af tilstødende udskæringer giver konformation, at en krypt var fuldt muteret eftersom den samme muterede krypt vil blive observeret i tilstødende sektioner. Dias med vævsprøver, der var mere end 50 um fra hinanden var rede til at vurdere alt> 10 4 krypter pr mus. Mutationsfrekvensen er antallet af observerede muterede (hvid) krypter ÷ antallet af vildtype (blå) krypter i en behandlingsgruppe.
Introduction
Colon cancer menes at involvere udsættelse for miljømæssige midler og kostkomponenter, der kan beskadige DNA og producere aktiverende mutationer i somatiske onkogener (f.eks ß-catenin) eller inaktiverende mutationer i tumorsuppressorgener (f.eks APC). Det antages, at disse kritiske mutationer forekommer i colon stamceller. På grund af den unikke krypt arkitektur tyktarmsepitelet, er det muligt at måle stamceller mutationer i tyktarmen efter eksponering dyr for kemikalier er forbundet med colon carcinogenese. Flere X-bundet enzymer kan tjene som indikatorer for mutationer, der forekommer i stamceller, som mutationerne vil være til stede i alle celler inden for en krypt.
Tidligere blev en procedure offentliggjort påviser, at kemikalier, der fremkalder colontumorer i mus også genereret somatiske stamceller mutationer i colon via analyse af mutationer i X-bundet glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PD) genet. 1-3Fremgangsmåden kvantificerer forekomsten af tilfældige mutationer i somatiske colon stamceller uden selektionstryk. Denne procedure indebærer produktionen af ufikserede frosne kolon afsnit fra behandlede og kontrol mus og identificering af krypter blottet for celler, der producerer funktionelle G6PD aktivitet. Disse muterede krypter, som synes hvid, viser, at mutationen opstod i en stamcelle, der gav anledning til afkom også huser en muteret G6PD-gen. I den enzymatiske assay kan G6PD muterede krypter ikke oxidere glucose-6-phosphat, som er nødvendig til reduktion af nitro blue tetrazolium (NBT). Når G6PD enzymet er funktionelt, er NBT i farvningen blandingen reduceret til uopløseligt formazan bundfald og, akkumulering ved placeringen af enzymet og "farvning" celler blå. Celler, som er G6PD mutanter forbliver hvidlig i modsætning til blåfarvet vildtype krypter. Denne metode måler mutationer, der har en "nul" fænotype. Fordi enzymes, såsom G6PD, kan diffundere ud af cellerne på en ikke-fikserede vævssnit om sektionerne anbringes i en vandig opløsning, er det nødvendigt at stabilisere enzymet i vævssnittene, der skal analyseres. 4 Stabiliseringen af enzymet i Vævet må ikke interferere med diffusionen af små molekyler, der er nødvendige reagens for G6PD enzymatiske reaktion.
Vi har lavet en række væsentlige ændringer i den oprindelige procedure. Mediet til den kritiske enzymatiske farvning er ændret fra polyvinylalkohol til Optimal Cutting Temperatur Forbindelse (OLT), hvilket letter pH kontrol og solubilisering af de komponenter, der anvendes i assayet. Farvningen udføres under anvendelse af 0,4 - 0,5 ml brønde fremstillet af stål skiver, således at hver vævssnit fik det samme volumen af G6PD reaktionsblandingen. En procedure blev udviklet for at estimere antallet af krypter i en sektion, der afbildes giver en stor prøveudtagning af colonvæv uden atmanuelt ud> 10 5 krypter for hver colon. Analysen af tilstødende 7 um vævssnit giver visualisering af en mutant krypt på mere end én slide, hvilket reducerer potentielle farvning artefakter. Disse ændringer gøre proceduren mere effektiv og reproducerbar.
Ved anvendelse af denne reviderede protokol, har vi kvantificeret mutationsfrekvensen i colon stamceller efter eksponering af C57BL / 6-mus til azoxymethan, et velkendt carcinogen colon hos gnavere. 5-7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle procedurer og etisk behandling af dyr blev godkendt af University of Pittsburgh IACUC (protokol # 1104674).
1. Fremstilling af G6PD Farvning Blanding
BEMÆRK: Sørg for, at den endelige koncentration af hver reagenser er som følger; 5 mM glucose-6-phosphat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,35 mM 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfat (MMPMS) og 0,8 mM NBT. 1,8,9 For hvert reagens startkoncentrationen blev udledt for en 40 ml slutvolumen. Opløsninger blev frisk fremstillet og anvendt hver dag.
- Tilsæt 2 ml 200 mM pH 7,4 fosfatbuffer (PB) til 35 ml oktober medium i et 50 ml rør og rystes kraftigt. Bekræft med pH-papir, at løsningen er ~ pH 7,4. Hvis ikke kassere løsningen.
- Tilføj 61 mg G6P opløst i 0,94 ml 200 mM PB, 61 mg NADP opløses i 0,94 ml 200 mM PB, og 41 mg MgCl2 opløst i 0,96 ml 100 mM PB. Bekræfte, at pH er ~ 7,4 with pH-papir. Hvis ikke ~ 7.4, kasseres løsningen.
- Tilsæt 5 mg MMPMS opløst i 0,25 ml 200 mM fosfatbuffer (pH 7,4). Ryst den resulterende reaktionsblanding til at generere en klar mørkerød homogenat. Hvis opløsningen er uklar, skal blandingen kasseres. Røret indeholder reaktionsblandingen er pakket ind i folie for at minimere udsættelse for lys. Opbevar reaktionsblandingen ved stuetemperatur, mens den endelige komponent, NBT, fremstilles.
- Forbered særskilt en 5 mM NBT-opløsning ved tilsætning af 0,4 ml vandfrit dimethylformamid (DMF) og 0,4 ml vandfri ethanol til 164 mg af NBT i et 2 ml rør med en O-ring låg. Luk låget løst (ikke tæt forseglet) og bringe opløsningen til en kraftig kogning i et oliebad indtil NBT er i opløsning. 8
- Lad det opløste NBT til afkøling til stuetemperatur, og derefter tilføje alle af løsningen til OLT reaktionsblandingen og rystes kraftigt for at opnå en klar opløsning. Overhold løsningen farveændring fra indledende orange-rød til en mørk-rød eller purple farve med tiden. Dette er normalt.
- Placer endelige G6PD farvning blanding i et 37 ° C varmt rum i 1 time før brug.
2. Animal Behandling og Tissue Collection
- Behandl 6 uger gamle C57BL / 6-hanmus med DNA-ødelæggende middel, f.eks, 10 mg / kg azoxymethan (AOM) i et volumen på 200 pi PBS ved ip injektion. Behandl kontrolmus med 200 pi PBS ved IP injektion.
- På 90 dage, aflive mus ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation som godkendt af IACUC protokol.
- Kirurgisk åbne bughulen fra lige over anus til bunden af brystbenet. Flyt tyndtarmen ud af legemehulrummet, men ikke udskære det. Udskære den nederste tarmen lige under coecum til endetarmen. 10
- Skive forsigtigt langs den ene side af kolon ved hjælp af en mikro-dissektion saks og fjern afføring fra den åbnede colon ved vask med rent sterilt PBS. Swiss roll punktafgiftend kolon med den luminale side vendende udad, og sted i et væv støbeform. 10
- Helt fordybe kolon i oktober mellemstore og sted skimmel i en Dewar indeholder flydende N2. Hold formen, således at plasten base er lige i kontakt med flydende N2, indtil OLT medium frosset fast.
- Opbevar den frosne vævsblok ved -80 ° C indtil skæring frosne sektioner. Brug ikke fiksativ, hvilket ville resultere i inaktivering af G6PD enzymet.
3. Udarbejdelse af frosne snit
- Skær frosne vævssnit ved en tykkelse på 7 um under anvendelse af en kryostat ved -25 ° C. Skær 4 på hinanden følgende 7 um sektioner og placere to af dem på samme glas (figur 1). Forbered 2 dias eller fire på hinanden følgende 7 um snit til at repræsentere et niveau af colon (figur 1).
- Gentag for det næste niveau med en afstand på mindst> 50 um fra den sidste del af PRevious plan. Denne afstand sikrede, at krypter vurderede for hvert niveau ikke duplikere hinanden.
- Ofte tørre kryostat klinge med 100% ethanol for at fjerne OLT rester, der akkumuleres under skæring. Før sektionering genoptages, er den tørre klinge aftørres med en antistatisk tørretumbler ark til at sprede akkumuleret statisk ladning. Opbevar dias med de frosne sektioner på -80 o C.
4. Farvning af Frozen Sektion Tissue
- Udfør enzymet histokemi reaktion i et 37 ° C varmt rum med høj luftfugtighed.
BEMÆRK: Forsøg den enzymatiske reaktion i en inkubationstid ovn eller på et dias varmere førte til dårlig og inkonsekvent G6PD farvning. - Byg brønde til vævsfarvning anvendelse af to 1,5 cm x 0,15 cm stålskiver (indvendig diameter x højde), der er bundet sammen ved hjælp af silikonefedt (figur 1). Skær parafilm at passe bunden af brønden med centrum skåret ud og godt stedd over vævssnittet på diaset.
BEMÆRK: parafilm på bunden af skiven skaber en tætning mellem glideren og skiven, der fastholder den viskose G6PD farvning blandingen på vævssnittet. Denne konstruktion giver en brønd med en 0,4 - 0,5 ml volumen, således at hver vævssnittet i undersøgelsen modtager det samme volumen af G6PD reaktionen farvning blanding. - Inkuber frosne væv slides ved 37 ° C i et varmt rum i 10 min. Ved 37 ° C, tilsæt G6PD farvning reaktionsblandingen til hvert vævssnit brønd (2 sektioner pr slide) for 45-50 min. Fjern slides fra varme stue, og løft forsigtigt i rustfrit stål brønde off dias.
- Set glider på deres lange kant for at gøre det muligt for reaktionsmediet at dræne. Anbring objektglassene i 100 mM fosfatbuffer (pH 7,4) i 30-60 minutter for at fjerne G6PD farvning reaktionsblandingen fra vævet uden at forstyrre vævsfarvning. Nedsænk objektglassene i destilleret vand i 5-10 minutter for at fjerne salte PB
- Seal vævet ved adding fluor-gel fra en pipette ind i vævet og venter ~ 30 min til at tørre. Undgå bobler, der kan forvirre identifikationen af muterede krypter.
BEMÆRK: Hvis bobler dannes, kan proceduren gentages efter fjernelse af fluor-gel ved opblødning i destilleret vand. Brug ikke dækglas, da de har tendens til at fælde luftbobler.
5. Bestemmelse af G6PD Mutant Crypts og Mutation Frekvens
- Analyser dias for G6PD mutant krypter under et lysmikroskop.
BEMÆRK: De kriterier, der anvendes til at identificere en fuldt mutant krypt var: (i) hele krypt var blottet for blå farve; (ii) den ydre struktur af krypten var intakt, (iii) mutanten krypt blev observeret på tilstødende 7 um snit og (iv) to observatører skulle identificere samme krypt som mutant. Mutanter observeret på tilstødende 7 um sektioner tælles som én mutant. - Billede hver G6PD mutant krypt på 40x forstørrelse og katalogisere billederne ved hjælp af et 5,0 megapixel kamera medimaging software.
- Kvantificere det samlede antal krypter undersøgt i en mus ved at vælge et repræsentativt udsnit for hver mus fra niveau med mindste overfladeareal og billedet det på 10x forstørrelse (figur 1C).
BEMÆRK: En niveau repræsenterer fire på hinanden følgende 7 um sektioner (Figur 1D), som på grund af deres nærhed ofte viser muterede krypter på mere end én sektion. Niveauerne er adskilt af> 50 um for at visualisere krypter fra forskellige områder af tyktarmen. - Åbn hver billedfil og visuelt tælle antallet af krypter på niveau ved at analysere de filer (vist som kasser i figur 1C). Billedfiler vil variere i antallet af krypter observeret fra så lavt som 20 til> 300 krypter i én fil.
- Multiplicer det samlede antal krypter fra det valgte niveau (figur 1C) for hver mus på antallet af niveauer screenet for G6PD mutant krypter for hver colon. For eksempel kan en total optælling af1.250 krypter pr valgte niveau ganget med 8 niveauer screenet for mutant krypter er lig med en samlet optælling af 10.000 krypter. Vurdere et minimum af 10.000 krypter for hver colon til statistisk analyse.
- Kombiner antallet af mutanter observeret i alle dyrene med det samlede antal krypter screenet beregne MF for hver behandling. Baggrunden stamcelle MF plan ubehandlede mus er <0.1x10 -4 (tabel 1), hvilket er tæt på, som tidligere rapporteret i C57BL / 6-mus. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til at måle colon stamceller mutationer hos dyr giver en unik måde at korrelere mutationer til kræft induktion. Normalt er det antaget, at den kritiske trin i carcinogenese involverer aktiverende mutationer i onkogener og / eller inaktivering af mutationer i tumorsuppressorgener. Vi injicerede C57BL / 6-mus med 200 pi PBS eller 10 mg / kg AOM i 200 pi PBS. AOM er en kendt colon kræftfremkaldende. 5-7 til 90 dage koloner blev analyseret for stamcelle mutationer. Denne gang er forpligtet til at tillade stamceller til at udfylde en krypt, og kun når en hel krypt ikke producerer G6PD er en krypt identificeret som en stamcelle mutant. Eksempler på fuldt mutant krypter er vist i figur 2. Figuren viser to forskellige orienteringer (lodrette og vandrette), i krypterne, der opstår ved fremstillingen af de frosne snit. Den lodrette visning ser ned lange akse krypten, mens den vandrette giver et sidebillede. Råbetpts, der er vildtype for G6PD pletten blå med nogle hvide, der skyldes slim produktion fra slimceller. Ved at tælle det samlede antal krypter på et objektglas (figur 1), og antallet af muterede krypter, kan MF for muterede krypter beregnes. Nr muterede krypter blev observeret i nogen af de> 100.000 vildtype krypter inspiceret i kontrolgruppen (PBS-behandlede) mus. Vi sætter MF for kontrolmusene at være <0.1x10 -4, hvilket er tæt på, der er rapporteret tidligere for C57BL / 6-mus. 1
Figur 1. Forberedelse af dias for G6PD farvningsreagens. (A) To 1,5 cm x 0,15 cm stålskiver (indvendig diameter x højde) er forseglet sammen ved hjælp af silikone fedt. Parafilm skæres derefter til at passe til brøndens bund med centrum skåret ud og godt placeret over den schweiziske rullet kolon vævssnit pådiaset. (B) To vævssnit fra tilstødende 7 um snit er placeret på samme objektglas og farves samtidig. Målestok: 1,0 cm. (C) Antallet af krypter i afsnittet bestemmes ved at kigge på vævet ved 10x forstørrelse. Antallet af felter (vist som kasser) varierer med hver sektion. Antallet af krypter i hvert felt bestemmes ved visuel optælling og tilsat for at give det samlede antal krypter til dette niveau. (D) Ved et niveau defineres som fire på hinanden følgende 7 um vævssnit. Niveauerne er> 50 um fra hinanden for at undgå overlapning med tidligere vurderede krypter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative eksempleraf muterede krypter observeret i AOM behandlet C57BL / 6-hanmus, der ikke producerer funktionel G6PD. De G6PD mutante krypter er veldefinerede, men er næsten blottet for blåsplint. Vildtype krypter, der omfatter de fleste af krypterne på området er blå / lilla angiver G6PD enzymatisk aktivitet. Skala:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.
| behandling | forekomsten af mutant krypter | mutant krypter en | samlede krypter analyseret | MF (x 10 -4) |
| opløsningsmiddel | 0/6 mus | 0 | > 10 5 | <0,10 |
| AOM | 10/12 mus | 43 | 96.821 | 60; 4.44 |
Tabel 1. mutationsfrekvens i ubehandlet og behandlet azoxymethan C57BL / 6-mus. 12
Colon stamceller mutationer i WT C57BL / 6-mus 90 dage efter udsættelse for 10 mg / kg azoxymethan (AOM) eller opløsningsmiddel kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ofte genotoksisk virkning af en forbindelse bestemmes af dets evne til at modificere DNA. Dette gøres normalt ved at isolere vævet og måle det globale niveau af DNA-addukter. For AOM, vil det indebære kvantificering O 6 -methylguanine addukter i tyktarmen. Ved hjælp af denne metode på skader inden for specifikke celletyper, såsom i stamceller niche, er tabt. Desuden er en DNA-adduktet er ikke det samme som en mutation idet kun en lille delmængde af addukter sidst omdannes til faste mutationer. 12 Vi giver heri detaljer til reproducerbart at kvantificere stamceller mutationer i tyktarmen baseret på den oprindelige metode beskrevet af Griffiths et al. 1, og på grundlag af G6PD farvning udviklet af VanNorden. 4,8,9,13,14
Der er flere kritiske trin for dette enzym histokemi metode til at producere et målbart resultat. Den ene er i sektionering af væv. Betydeligt mere væv sektioner skal genereres og analyseret, end hvad der ville være typisk gøres med H & E histologisk analyse. Vi konstateret, at 7 um snit gav den bedste G6PD farvning efter en evaluering af 5, 6, 7, 8 og 10 um tykke snit.
For det andet, farvning det nødvendige antal værdifulde vævssnit kræves en reproducerbar reaktionsblanding. Vi fandt brugen af polyvinylalkohol (PVA), der anvendes i den oprindelige protokol for at være problematisk, fordi det er helt tyktflydende ved løsning procenter (18% og større) nødvendige for at lette enzymet histokemi reaktion samtidig forhindre udbredelsen af G6PD enzymet fra væv. Bedre solubilisering af reagenser og kontrol af pH blev opnået ved at erstatte PVA med oktober medium, der indeholder 10% PVA. PH kan bestemmes nøjagtigt med pH-papir, og hvis pH-værdien ikke er tæt på 7,4, opløsningen kasseres uden at spilde kostbar vævsprøve og tid. Denne ændring har ført til en bedre og mmalm konsistent farvning i vævssnittene. Ved pH (7,2-7,4), der kræves for at måle G6PD aktivitet, den komplette reaktionsblanding har en karakteristisk klart dyb orange-rød farve, som langsomt vil skifte til lilla. Uanset hvilken farve, hvis reaktionen farveopløsning er grumset, skal den kasseres, da det ikke vil give god farvning. Vi fandt, at nogle partier OLT medium billede blandinger uden den krævede pH-område, så det er tilrådeligt at teste partier ved at tilføje PB (7.4) til OLT-medium og bestemmelse af pH. Vi har også anvendt MMPMS som tidligere foreslået, 8,9 i stedet for 5-methylphenazenium methylsulfat anvendt i den oprindelige papir 1 at eliminere lysfølsomhed for G6PD farvning reaktionsblandingen.
Endelig omfatter fremgangsmåden til afledning af MF er hidtil ukendt i forhold til andre metoder, der tidligere anvendt. 1,2 Farvning artefakter kan føre til en potentiel identifikation af falske G6PD mutant krypter. Du kan foretage fejlfinding thans problem, analyserede vi 4 sammenhængende 7 um vævssnit der giver mulighed for visualisering af samme muterede krypt i mere end én vævssnit (figur 4D). Denne kontrol mindsker chancerne for farvning artefakter påvirker MF analyse. Også vores metode bruger en faktisk værdi af den samlede krypter tælles til at estimere det samlede antal krypter analyseret ved beregning af MF.
På grund af den unikke krypt struktur findes i tynd- og tyktarmen, er det muligt at bestemme placeringen af stamceller og celleafstamning for hver krypt. En væsentlig begrænsning for tilgang er, at den er begrænset til tarmene, fordi morfologien af andre væv ikke er så godt defineret som i colon. Derfor er det ikke muligt at bestemme stamcelle MF i de fleste andre væv, der er modtagelige for kræft. Da assayet er et fænotypisk assay baseret på tabet af G6PD enzymatisk aktivitet, den faktiske MF i stamcellepopulation vilvære højere end vi rapporterer til G6PD grundet mutationer ved wobble baser og punktmutationer, der ikke signifikant påvirker enzymatisk aktivitet.
Mens der er begrænsninger og udfordringer til farvning for G6PD aktivitet i tyktarmen væv at kvantificere somatiske stamceller mutationer blev væsentlige ændringer indført i dette papir til at forbedre mulighederne for at udnytte denne metode. Vi fandt, at disse ændringer forbedret reproducerbarhed generering af G6PD farvningsreagens og kvantificere MF. Desuden farvning for G6PD enzymaktivitet som markør for somatiske stamceller mutationer ikke kræver en ekspertise i immunhistokemi farvning som vil teste for ekspression af metallothionein, 15 anden potentiel markør for somatiske stamceller mutationer.
I fremtiden vil vi analysere colon stamcelle mutationer i mus behandlet med miljømæssige forbindelser, såsom 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4,5-b] pyridin (PhIP) Og andre aromatiske aminer findes i grillet kød, der er forbundet med human coloncancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
