La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

Abstract

La capacidad de medir las mutaciones de células madre es una poderosa herramienta para cuantificar en una población celular crítico si, y en qué medida, un producto químico puede inducir mutaciones que potencialmente conducen al cáncer. El uso de un ensayo enzimático para cuantificar mutaciones de células madre en el gen de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X se ha informado anteriormente. ¹ Este método requiere la preparación de secciones congeladas y la incubación del tejido seccionado con una mezcla de reacción que produce una el color azul si las células producen la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) enzima funcional. Si no, las células aparecen de color blanquecino. Hemos modificado la mezcla de reacción usando Compuesto de corte óptimo de temperatura (OCT) medio en lugar de alcohol de polivinilo. Esto facilita la medición del pH, aumenta la solubilización de los componentes de tinción de G6PD y restringe la difusión de la enzima G6PD. Para demostrar que se produjo una mutación en una célula madre, toda la cripta debe carecer de G6PD enzimáticaactividad. Sólo si una célula madre alberga una mutación G6PD fenotípica será toda la progenie en la cripta carecen de actividad enzimática de G6PD. Para identificar las criptas con una mutación de células madre, cuatro secciones congeladas adyacentes consecutivos (un nivel) se redujeron a 7 micras espesores. Este enfoque de hacer cortes adyacentes ofrece conformación que una cripta estaba completamente mutado ya se observó la misma cripta mutado en las secciones adyacentes. Diapositivas con muestras de tejidos que fueron más de 50 micras, aparte estaban preparados para evaluar un total de> 10 ⁴ criptas por ratón. La frecuencia de mutación es el número de mutados (blanco) ÷ criptas observados por el número de tipo salvaje (azul) criptas en un grupo de tratamiento.

Introduction

Se cree que el cáncer de colon de involucrar a la exposición a los agentes ambientales y componentes de la dieta que pueden dañar el ADN y producir la activación de mutaciones somáticas en oncogenes (por ejemplo, ß-catenina) o inactivación de las mutaciones en los genes supresores de tumores (por ejemplo, APC). Se supone que estas mutaciones se producen críticos en las células madre del colon. Debido a la arquitectura única de la cripta epitelio del colon, es posible medir las mutaciones de células madre en el colon después de exponer a los animales a los productos químicos asociados con la carcinogénesis de colon. Varias enzimas ligadas al cromosoma X pueden servir como indicadores para las mutaciones que se producen en las células madre, ya que las mutaciones estarán presentes en todas las células dentro de una cripta.

Anteriormente, un procedimiento se publicó que demuestra que los productos químicos que inducen tumores de colon en ratones también generaron mutaciones de células madre somáticas en el colon a través de análisis de mutaciones en el nivel de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X gen (G6PD) ^1-3.El método cuantifica la incidencia de mutaciones somáticas aleatorias en las células madre del colon sin ninguna presión de selección. El procedimiento implica la producción de secciones de colon no fijadas congelados procedentes de ratones tratados y de control y la identificación de criptas desprovistas de células que producen la actividad G6PD funcional. Estas criptas mutados, que aparecen blanco, indican que la mutación se produjo en una célula madre que dio origen a la progenie también alberga un gen G6PD mutado. En el ensayo enzimático, criptas G6PD mutante deficiente no pueden oxidar la glucosa-6-fosfato, que se requiere para la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT). Cuando la enzima G6PD es funcional, el NBT en la mezcla de tinción se reduce a formazán insoluble y precipita, acumulando en la ubicación de la enzima y células "de tinción" azules. Las células que son mutantes de G6PD permanecen blanquecino en contraste con azul manchadas criptas de tipo salvaje. Este método mide mutaciones que tienen un fenotipo "nulo". Debido a que enenzimas, tales como G6PD, puede difundirse fuera de las células en una sección de tejido no fijado si las secciones se colocan en una solución acuosa, es necesario para estabilizar la enzima en las secciones de tejido a analizar. ⁴ La estabilización de la enzima en el tejido no debe interferir con la difusión de pequeñas moléculas de reactivo necesario para la reacción enzimática G6PD.

Hemos hecho una serie de cambios significativos en el procedimiento original. El medio para la tinción enzimática crítica ha sido cambiado de alcohol de polivinilo a Optimal Compuesto Temperatura de corte (OCT), lo que facilita el control del pH y la solubilización de los componentes utilizados en el ensayo. La tinción se realiza usando 0,4 - 0,5 ml pozos hechos de arandelas de acero de manera que cada sección de tejido recibió el mismo volumen de la mezcla de reacción G6PD. Se desarrolló un procedimiento para estimar el número de criptas en una sección fotografiado que proporciona una gran toma de muestras del tejido del colon sin tenerpara contar manualmente> 10 ⁵ criptas para cada colon. El análisis de los adyacentes 7 micras secciones de tejido permite la visualización de una cripta mutante en más de una diapositiva, lo que reduce los posibles artefactos de tinción. Estos cambios hacen que el procedimiento sea más eficiente y reproducible.

El uso de este protocolo revisado, hemos cuantificado la frecuencia de mutación en las células madre del colon después de la exposición de ratones C57BL / 6 a azoximetano, un carcinógeno bien conocido de colon en roedores ^5-7.

Protocol

Los procedimientos experimentales y el tratamiento ético de los animales fue aprobado por la Universidad de Pittsburgh IACUC (protocolo # 1104674).

1. Preparación de G6PD tinción Mezcla

NOTA: Asegúrese de que la concentración final de cada uno de los reactivos es el siguiente; 5 mM de glucosa-6-fosfato (G6P); 2 mM NADP, 5 mM de MgCl _2, NBT 0,35 mM mM 1-metoxi-5-metilfenazinio sulfato de metilo (MMPMS) y 0.8. ^1,8,9 Para cada reactivo de la concentración inicial fue derivada por unos 40 ml de volumen final. Soluciones estaban recién preparados y utilizados cada día.

1. Añadir 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampón fosfato (PB) a 35 ml de medio de octubre en un tubo de 50 ml y agitar vigorosamente. Confirmar con papel de pH que la solución es ~ pH 7,4. Si no descarta la solución.
2. Añadir 61 mg G6P disolvió en 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg NADP disolvió en 0,94 ml de PB 200 mM, y 41 mg de MgCl ₂ disolvió en 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que el pH es de ~ 7.4 ingenioh papel pH. Si no ~ 7.4, deseche la solución.
3. Añadir 5 mg de MMPMS disueltos en 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agite la mezcla de reacción resultante para generar una clara homogeneizado rojo oscuro. Si la solución es turbia, la mezcla debe ser desechada. El tubo que contiene la mezcla de reacción se envuelve en papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Almacenar la mezcla de reacción a RT mientras que el componente final, NBT, se prepara.
4. Preparar separadamente una solución 5 mM NBT mediante la adición de 0,4 ml de formamida de dimetilo anhidra (DMF) y 0,4 ml de etanol anhidro a 164 mg de NBT en un tubo de 2 ml con una tapa de junta tórica. Cierre la tapa sin apretar (no cerrado herméticamente) y llevar la solución a ebullición vigorosa en un baño de aceite hasta que el NBT está en solución. ⁸
5. Deje que el solubilizado NBT se enfríe a temperatura ambiente y luego poner todo de la solución a la mezcla de reacción octubre y agitar enérgicamente hasta obtener una solución clara. Observe el cambio de color de la solución de color naranja-rojo inicial a un color rojo oscuro o purpde color le paso del tiempo. Esto es normal.
6. Coloque la mezcla final tinción G6PD en un 37 ° C cálido ambiente durante 1 hora antes de su uso.

2. Tratamiento de Animales y Tejidos Colección

1. Tratar a 6 semanas de edad C57BL / 6 ratones machos con el agente que daña el ADN, por ejemplo, 10 mg / kg azoximetano (AOM) en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección ip. Tratar a los ratones de control con 200 l de PBS por inyección ip.
2. A los 90 días, la eutanasia a los ratones por _asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical aprobadas por protocolo de IACUC.
3. Abrir quirúrgicamente la cavidad abdominal desde justo por encima del ano a la base del esternón. Mueva el intestino delgado de la cavidad del cuerpo, pero no extirparlo. Extirpar el intestino inferior justo por debajo del ciego hasta el recto. ¹⁰
4. Cortar cuidadosamente a lo largo de un lado del colon utilizando una tijera micro-disección y eliminar las heces en el colon abierto por lavado con PBS estéril limpio. Rodillo suizo del impuesto especiald colon con el lado luminal hacia afuera, y colocar en un molde de tejido. ¹⁰
5. Sumerja completamente los dos puntos en octubre medio y lugar molde en un Dewar que contiene líquido N _2. Mantenga el molde de manera que la base de plástico es sólo en contacto con el líquido ₂ N hasta que el medio PTU sólido congelado.
6. Guarde el bloque de tejido congelado a -80ºC hasta cortar secciones congeladas. No utilice ningún fijador, que daría lugar a la inactivación de la enzima G6PD.

3. Preparación de las secciones congeladas

1. Los cortes de secciones de tejido congelado en un espesor de 7 micras usando un criostato a -25 ° C. Cortar 4 consecutivos 7 micras secciones y colocar dos de ellos en la misma diapositiva (Figura 1). Prepare 2 toboganes, o cuatro consecutivos 7 micras secciones para representar un nivel del colon (Figura 1).
2. Repita para el siguiente nivel con una distancia mínima de> 50 m desde el último tramo de la prnivel evious. Esta distancia se aseguró de que las criptas evaluados para cada nivel no se duplican entre sí.
3. Limpie con frecuencia la cuchilla criostato con etanol 100% para eliminar el residuo OCT se acumula durante el corte. Antes de seccionamiento se reanuda, la hoja seca se limpia con una hoja de pelo antiestático para disipar la carga estática acumulada. Diapositivas de las tiendas con las secciones congeladas a -80 ^{° C}

4. La tinción de cortes congelados de tejido

1. Realice la reacción de la enzima histoquímica en un 37 ° C ambiente cálido, con alta humedad.
   NOTA: Si se intenta la reacción enzimática en un horno de incubación o en un calentador de diapositivas llevó a las manchas G6PD pobre e inconsistente.
2. Construir pozos para tinción de tejidos utilizando dos 1.5 cm x arandelas de acero de 0,15 cm (interior de diámetro x altura) que están unidos entre sí mediante grasa de silicona (Figura 1). Cortar la parafina para adaptarse a la base del pozo con el centro cortado y bien el lugard sobre la sección de tejido en la diapositiva.
   NOTA: El Parafilm en la parte inferior de la arandela crea un sello entre la corredera y la arandela que mantiene la mezcla viscosa tinción G6PD en la sección de tejido. Esta construcción da un pozo con una 0,4 - 0,5 ml de volumen de modo que cada sección de tejido en el estudio recibe el mismo volumen de la mezcla de reacción de tinción G6PD.
3. Incubar los portaobjetos de tejido congelado ^a 37 ° C en una habitación caliente durante 10 minutos. A los 37 ° C, añadir la mezcla de reacción de tinción G6PD a cada sección de tejido bien (2 secciones por diapositiva) de 45 a 50 min. Retire los portaobjetos de la habitación caliente, y levante con cuidado los pozos de acero inoxidable fuera de las diapositivas.
4. Diapositivas Set en su borde largo para permitir que el medio de reacción se drene. Colocar los portaobjetos en mM PB 100 (pH 7,4) durante 30-60 min para eliminar la mezcla de reacción de tinción G6PD del tejido sin perturbar la tinción de tejidos. Sumergir los portaobjetos en agua destilada durante 5 a 10 minutos para eliminar las sales PB
5. Sellar el tejido mediante adding fluoro-gel a partir de un cuentagotas sobre el tejido y esperando ~ 30 min para que se seque. Evite las burbujas que pueden confundir la identificación de las criptas mutados.
   NOTA: Si se forman burbujas, el procedimiento se puede repetir después de la eliminación de la fluoro-gel por inmersión en agua destilada. No utilice cubreobjetos ya que tienden a atrapar burbujas de aire.

5. Determinación de G6PD mutante Criptas y Mutación Frecuencia

1. Analizar toboganes para G6PD criptas mutantes bajo un microscopio óptico.
   NOTA: Los criterios utilizados para identificar una cripta completamente mutante fueron: (i) toda la cripta carecía del color azul; (ii) la estructura exterior de la cripta estaba intacta, (iii) la cripta mutante fue observado en secciones adyacentes 7 micras y, (iv) dos observadores tenían que identificar la misma cripta como un mutante. Los mutantes observados en adyacentes 7 micras secciones se cuentan como un mutante.
2. Imagen cada cripta mutante G6PD a 40 aumentos y catalogar las imágenes mediante una cámara de 5,0 megapíxeles consoftware de imágenes.
3. Cuantificar el número total de criptas examinados en un ratón mediante la selección de una sección representativa para cada ratón desde el nivel con el área de superficie más pequeña y la imagen es un aumento de 10x (Figura 1C).
   NOTA: Un nivel representa cuatro consecutivos 7 micras secciones (Figura 1D), que debido a su proximidad a menudo muestran mutados criptas en más de una sección. Los niveles están separados por> 50 micras para visualizar criptas de diferentes áreas de los dos puntos.
4. Abra cada archivo de imagen y contar visualmente el número de criptas en un nivel mediante el análisis de los archivos (que se muestran como cuadros en la Figura 1C). Imágenes archivos varían en el número de criptas observados desde un mínimo de 20 a> 300 criptas en un solo archivo.
5. Multiplicar el número total de criptas desde el nivel seleccionado (Figura 1C) para cada ratón por el número de niveles seleccionados para criptas mutantes G6PD para cada colon. Por ejemplo, un recuento total de1,250 criptas por nivel seleccionado multiplicado por 8 niveles seleccionados para criptas mutantes es igual a un recuento total de 10.000 criptas. Evaluar un mínimo de 10.000 criptas por cada dos puntos para el análisis estadístico.
6. Combinar el número de mutantes observados en todos los animales por el número total de criptas seleccionados para calcular la MF para cada tratamiento. El nivel de MF de células madre de fondo en los ratones no tratados es <0.1x10 ^-4 (Tabla 1), que es similar a la reportada previamente en ratones C57BL / 6. ¹¹

Representative Results

La capacidad de medir las mutaciones de células madre de colon en animales ofrece una manera única de correlacionar las mutaciones a la inducción de cáncer. Normalmente, se supone que el paso crítico en la carcinogénesis implica la activación de mutaciones en oncogenes y / o inactivación de mutaciones en genes supresores de tumores. Hemos inyectado C57BL / 6 ratones con 200 l de PBS o 10 mg / kg AOM en 200 l de PBS. OMA es un carcinógeno conocido de colon. ^5.7 A los 90 días se analizaron los dos puntos para las mutaciones de células madre. Este tiempo es necesario para permitir que las células madre para poblar completamente una cripta, y sólo cuando toda una cripta no produce G6PD es una cripta identificado como un mutante de células madre. Ejemplos de criptas totalmente mutantes se muestran en la Figura 2. La figura muestra dos orientaciones diferentes (verticales y horizontales) de las criptas que se producen en la preparación de las secciones congeladas. La visión vertical está mirando hacia abajo el eje largo de la cripta, mientras que la horizontal ofrece una vista lateral. El gritopuntos que son de tipo salvaje de la mancha de G6PD azul con algo de blanco que se debe a la producción de moco de las células caliciformes. Contando el número total de criptas en un portaobjetos (Figura 1) y el número de criptas mutados, la MF para criptas mutadas se puede calcular. No criptas mutados se observaron en ninguno de los> 100.000 criptas de tipo salvaje inspeccionados en el control (tratados con PBS) ratones. Hemos establecido el MF para los ratones de control para ser <0.1x10 ^-4, que es similar a la reportada previamente para ratones C57BL / 6. ¹

Figura 1. Preparación del portaobjetos para reactivo de tinción de G6PD. (A) Dos arandelas 1,5 cm x 0,15 cm de acero (diámetro interior x altura) están selladas juntas con grasa de silicona. Parafilm se corta entonces para adaptarse a la base de la cuba con el centro cortado y el pozo coloca sobre secciones de tejido de colon rodó sobre el suizola diapositiva. Dos secciones de tejido adyacentes de 7 micras cortes (B) se colocan en el mismo portaobjetos y se tiñeron al mismo tiempo. Barra de escala: 1,0 cm. (C) El número de criptas en la sección se determina observando el tejido en un aumento de 10x. El número de campos (que se muestra como cajas) varía con cada sección. El número de criptas en cada campo se determinó por recuento visual y ha añadido para dar el número total de criptas para ese nivel. (D) Un nivel se define como cuatro secciones consecutivas de tejido 7 m. Los niveles son> 50 micras, aparte de evitar la superposición con criptas evaluados previamente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Los ejemplos representativosde criptas mutados observados en AOM tratados C57BL / 6 ratones machos que no producen G6PD funcional. Las criptas G6PD mutantes están bien definidos, pero son prácticamente desprovista de la mancha azul. Criptas de tipo salvaje que componen la mayor parte de las criptas en el campo son de color azul que indica la actividad enzimática de G6PD / púrpura. Escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tratamiento	incidencia de criptas mutantes	criptas mutantes un	criptas totales analizados	MF (x 10 -4)
solvente	0/6 ratones	0	> 10 5	<0,10
OMA	10/12 ratones	43	96821	60; 4.44

Tabla de frecuencias 1. La mutación en azoximetano sin tratar y tratada ratones C57BL / 6. ¹²
Mutaciones de células madre del colon en el documento WT C57BL / 6 ratones 90 días después de la exposición a 10 mg / kg azoximetano (AOM) o disolvente de control.

Discussion

A menudo, el efecto genotóxico de un compuesto se determina por su capacidad de modificar el ADN. Esto se hace normalmente aislando el tejido y midiendo el nivel global de aductos de ADN. Para AOM, esto implicaría la cuantificación O ⁶ metilguanina aductos en el colon. Con esta información el enfoque sobre los daños dentro de los tipos de células específicas, como en el nicho de células madre, se pierde. Además, un aducto de ADN no es lo mismo que una mutación ya que sólo un pequeño subconjunto de aductos se convirtió posteriormente en mutaciones fijos. ¹² Proporcionamos el presente documento los detalles de cuantificar de forma reproducible las mutaciones de células madre en el colon basado en el método inicial descrito por Griffiths et al. ¹ y en base a la tinción de G6PD desarrollado por VanNorden. ^4,8,9,13,14

Hay varios pasos críticos para este método enzima histoquímica para producir un resultado cuantificable. Se encuentra en el seccionamiento de los tejidos. Significativamente más secta tejidoiones deben ser generados y analizados de lo que se suele hacer con H & E análisis histológico. Se determinó que 7 micras secciones proporcionaron el mejor tinción G6PD después de la evaluación de secciones gruesas 5, 6, 7, 8 y 10 micras.

En segundo lugar, manchando el número necesario de secciones de tejido valiosas requiere una mezcla de reacción reproducible. Encontramos el uso de alcohol polivinílico (PVA) que se utiliza en el protocolo original a ser problemático porque es bastante viscoso a los porcentajes de solución (18% y mayor) necesaria para facilitar la reacción de la enzima histoquímica, mientras que la prevención de la difusión de la enzima G6PD de la tejido. Mejor solubilización de los reactivos y el control del pH se llevó a cabo mediante la sustitución del PVA con medio PTU, que contiene 10% de PVA. El pH se pudo determinar con precisión con papel de pH y si el pH no está cerca de 7,4, la solución se descarta sin perder preciosa muestra de tejido y el tiempo. Este cambio dio lugar a mejor y mmineral tinción consistente en las secciones de tejido. En el pH (7.2 a 7.4) que se requieren para medir la actividad de G6PD, la mezcla de reacción completa tiene un profundo color claro característica de color rojo anaranjado, que cambiará lentamente a púrpura. Independientemente del color, si la solución está turbia tinción de reacción debe desecharse ya que no permitirse buena tinción. Hemos encontrado que algunos lotes de medio de octubre proporcionan mezclas fuera del rango de pH requerido por lo que es aconsejable analizar lotes mediante la adición de la PB (7,4) al medio de PTU y la determinación del pH. También utilizamos MMPMS como ya se sugirió, ^8,9 más que el sulfato de metilo 5-methylphenazenium utilizado en el documento original ¹ para eliminar la sensibilidad a la luz de la mezcla de reacción de tinción de G6PD.

Por último, el método para derivar la MF es novedoso en comparación con otros métodos previamente empleado. ^1,2 artefactos de tinción puede dar lugar a la posibilidad de identificación de las criptas mutantes falsa G6PD. Para solucionar tsu problema, se analizó 4 contiguos secciones de tejido 7 micras que permite la visualización de la misma cripta mutado en más de una sección de tejido (Figura 4D). Esta verificación reduce las posibilidades de tinción artefactos que afectan el análisis MF. Además, nuestro método utiliza un valor real de criptas totales contados para estimar el número total de criptas analizadas en el cálculo del MF.

Debido a la estructura cripta único encontrado en el intestino delgado y grueso, es posible determinar la ubicación de las células madre y linaje de células para cada cripta. Una limitación importante de este enfoque es que se limita a los intestinos debido a la morfología de otros tejidos no está tan bien definida como en el colon. Por lo tanto, no es posible determinar la célula madre MF en la mayoría de otros tejidos que son susceptibles al cáncer. Dado que el ensayo es un ensayo fenotípico basado en la pérdida de actividad enzimática G6PD, el MF real en la población de células madre seser mayor que nos informe por G6PD debido a mutaciones en las bases basculantes y de mutaciones puntuales que no afectan significativamente la actividad enzimática.

Si bien existen limitaciones y desafíos de la tinción para la actividad de G6PD en el tejido del colon para cuantificar mutaciones de células madre somáticas, modificaciones significativas se introdujeron en este trabajo para mejorar la viabilidad de la utilización de este método. Hemos encontrado que estos cambios mejoran la reproducibilidad de la generación de la G6PD reactivo de tinción y cuantificación de la MF. Por otra parte, la tinción de actividad de la enzima G6PD como un marcador para las mutaciones de células madre somáticas no requiere una experiencia en la tinción inmunohistoquímica como sería probar para la expresión de metalotioneína, ¹⁵ otro marcador potencial de las mutaciones de células madre somáticas.

En el futuro, vamos a analizar mutaciones de células madre de colon en ratones tratados con compuestos ambientales, tales como 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo [4,5-b] piridina (PhIP) Y otras aminas aromáticas que se encuentran en carnes asadas, que están asociados con cáncer de colon humano.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room