Kvantifiering av Kolon Stem Cell Mutationer

Abstract

Möjligheten att mäta stamcells mutationer är ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera i en kritisk cellpopulation om och i vilken utsträckning kan en kemikalie framkalla mutationer som potentiellt leda till cancer. Användningen av en enzymatisk analys för att kvantifiera stamcells mutationer i X-bunden glukos-6-fosfatdehydrogenas-gen har rapporterats tidigare. ¹ Denna metod kräver framställningen av frysta snitt och inkubering av den sektionerade vävnaden med en reaktionsblandning som ger en blå färg om cellerna producerar funktionell glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD) enzym. Om inte, cellerna förefaller vitaktig. Vi har modifierat reaktionsblandningen med användning av Optimal Cutting Temperature Förening (oktober) mediet istället för polyvinylalkohol. Detta underlättar pH-mätning ökar solubilisering av G6PD färgnings komponenter och begränsar diffusion av G6PD enzymet. För att visa att en mutation inträffade i en stamcell, måste hela kryptan saknar G6PD enzymatiskaktivitet. Endast om en stamcell hyser en fenotypisk G6PD mutation kommer alla avkomman i kryptan saknar G6PD enzymatisk aktivitet. För att identifiera kryptor med stamcells mutation, var fyra på varandra följande intilliggande frysta snitt (en nivå) skärs vid 7 pm tjocklekar. Detta tillvägagångssätt för att göra angränsande snitt ger konformation som en krypta var helt muterad eftersom samma muterade kryptan kommer att observeras i angränsande sektioner. Diabilder med vävnadsprover som var mer än 50 um isär var beredda att bedöma totalt> 10 ⁴ kryptor per mus. Mutationsfrekvensen är antalet observerade muterade (vit) kryptor ÷ av antalet vilda typ (blå) kryptor i en behandlingsgrupp.

Introduction

Tjocktarmscancer är tänkt att innebära exponering för miljöfarliga ämnen och kostkomponenter som kan skada DNA och producera aktivera somatiska mutationer i onkogener (t.ex. ß-catenin) eller inaktivera mutationer i tumörsuppressorgener (t ex, APC). Det antas att dessa kritiska mutationer sker i kolon stamceller. På grund av den unika krypta arkitektur av kolon epitel, är det möjligt att mäta stamcells mutationer i kolon efter exponering djur mot kemikalier associerade med kolon karcinogenes. Flera X bundna enzymer kan fungera som indikatorer för mutationer som sker i stamceller, eftersom mutationerna kommer att vara närvarande i alla celler inom en krypta.

Tidigare har ett förfarande publicerades visar att kemikalier som inducerar kolontumörer i möss gav också somatiska stamcells mutationer i tjocktarmen via analys av mutationer i X-bunden glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD) genen. ^1-3Metoden kvantifierar förekomsten av slumpmässiga somatiska mutationer i kolon stamceller utan selektionstryck. Förfarandet innebär produktion av ofixerade frysta kolon sektioner från behandlade och kontrollmöss och identifieringen av kryptor saknar celler som producerar funktionell G6PD aktivitet. Dessa muterade kryptor, som visas vitt, tyder på att mutationen inträffade i en stamcell som gav upphov till avkomma också hyser en muterad G6PD gen. I enzymatisk analys, kan G6PD brist mutanta kryptor inte oxidera glukos-6-fosfat, som krävs för reduktion av nitroblått-tetrazolium (NBT). När G6PD enzymet är funktionell, är NBT i färgning blandningen reduceras till olösligt formazan och fällningar, ackumulera vid stället för enzymet och "färgnings" celler blue. Celler som är G6PD mutanter förblir vitaktig i motsats till blåfärgade vild typ kryptor. Denna metod mäter mutationer som har en "noll" fenotyp. Eftersom svZymes, såsom G6PD, kan diffundera ut från cellerna på en ofixerade vävnadssnitt om sektionerna placeras i en vattenhaltig lösning, är det nödvändigt att stabilisera enzymet i vävnadssnitt som skall analyseras. ⁴ Stabiliseringen av enzymet i vävnad får inte påverka spridningen av små reagensmolekyler som är nödvändiga för G6PD enzymatiska reaktionen.

Vi har gjort ett antal betydande ändringar i den ursprungliga proceduren. Mediet för det kritiska enzymatiska färgning har ändrats från polyvinylalkohol att Optimal Cutting Temperature Förening (oktober), vilket underlättar pH-reglering och solubilisering av de komponenter som används i analysen. Färgningen utförs med användning av 0,4 - 0,5 ml brunnar gjorda av stålbrickor så att varje vävnadssektion erhöll samma volym av G6PD reaktionsblandningen. Ett förfarande utvecklades för att uppskatta antalet kryptor i ett avbildat avsnitt som tillhandahåller en stor provtagning av kolonvävnad utan att haatt manuellt räkna> 10 ⁵ kryptor för varje kolon. Analysen av intilliggande 7 pm vävnadssnitt ger visualisering av en mutant krypta på mer än en bild, vilket minskar potentiella färgningsartefakter. Dessa förändringar gör förfarandet mer effektivt och reproducerbart.

Genom att använda denna reviderade protokoll, har vi kvantifierat mutationsfrekvensen i colon stamceller efter exponering av C57BL / 6-möss att azoximetan, en välkänd koloncancerframkallande hos gnagare. ^5-7

Protocol

De experimentella förfaranden och etisk behandling av djur godkändes av University of Pittsburgh IACUC (protokoll # 1104674).

1. Framställning av G6PD Färgning Blandning

OBS: Se till att den slutliga koncentrationen av varje reagens är följande; 5 mM glukos-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 _mM MgCl2, 0,35 mM 1-metoxi-5-methylphenazinium metylsulfat (MMPMS) och 0,8 mM NBT. ^1,8,9 För varje reagens den initiala koncentrationen härleddes för en 40 ml slutlig volym. Lösningar nylagad och används varje dag.

1. Tillsätt 2 ml av 200 mM pH 7,4 fosfatbuffert (PB) till 35 ml av oktober medium i en 50 ml röret och skaka kraftigt. Bekräfta med pH-papper att lösningen är ~ pH 7,4. Om inte kassera lösningen.
2. Lägg till 61 mg G6P löst i 0,94 ml 200 mM PB, 61 mg NADP löses i 0,94 ml 200 mM PB, och 41 mg _MgCl2 upplöst i 0,96 ml 100 mM PB. Bekräfta att pH är ~ 7,4 with pH-papper. Om inte ~ 7.4, kassera lösningen.
3. Lägg 5 mg MMPMS upplöst i 0,25 ml av 200 mM PB (pH 7,4). Skaka den erhållna reaktionsblandningen för att generera en klar mörkröd homogenat. Om lösningen är grumlig, bör blandningen kasseras. Röret innehållande reaktionsblandningen slås in i folie för att minimera exponeringen för ljus. Förvara reaktionsblandningen vid RT under det att slutliga komponenten, NBT, framställes.
4. Bered separat en 5 mM NBT-lösning genom att tillsätta 0,4 ml vattenfri dimetylformamid (DMF) och 0,4 ml vattenfri etanol till 164 mg NBT i en 2 ml rör med en O-ring lock. Stäng locket löst (inte tätt tillsluten) och bringa lösningen till en kraftfull koka i ett oljebad tills NBT är i lösning. ⁸
5. Låt lösta NBT svalna till RT och sedan lägga all lösning till oktober reaktionsblandningen och skaka kraftigt för att erhålla en klar lösning. Observera lösningen färgändring från initiala orange-röd till en mörk-röd eller purple färg med tiden. Detta är normalt.
6. Placera den slutliga G6PD färgnings blandningen i en 37 ° C varmt rum för en timme före användning.

2. Animal Behandling och Tissue Collection

1. Behandla sex veckor gamla C57BL / 6 möss av hankön med DNA-skadande medel, t ex 10 mg / kg azoximetan (AOM) i en volym av 200 | il PBS genom ip-injektion. Behandla kontrollmöss med 200 l PBS genom ip-injektion.
2. Vid 90 dagar, euthanize möss genom CO ₂ kvävning följt av halsdislokation som har godkänts av lACUC protokollet.
3. Kirurgiskt öppna bukhålan från strax över anus till basen av bröstbenet. Flytta tunntarmen ut ur kroppshåligheten men inte skära den. Skära den nedre tarmen nedanför blindtarmen till rektum. ¹⁰
4. Försiktigt skära längs en sida av kolon med användning av en mikro-dissektion sax och ta bort avföring från den öppnade kolon genom tvättning med ren steril PBS. Rulltårta punktskattend kolon med den luminala sidan vänd utåt, och lägg i en vävnadsform. ¹⁰
5. Helt fördjupa kolon i oktober medium och plats mögel i en Dewar innehållande _flytande N2. Håll formen så att plasten basen är bara i kontakt med _flytande N2 tills oktober mediet fryst fast.
6. Förvara frysta vävnadsblock vid -80 fram till styckningen frysta snitt. Använd inte fixerings, vilket skulle resultera i inaktivering av G6PD enzymet.

3. Framställning av frysta snitt

1. Skär frysta vävnadssnitt med en tjocklek av 7 pm med hjälp av en kryostat vid -25 ° C. Klipp 4 konsekutiva 7 pm sektioner och placera två av dem på samma glas (figur 1). Förbered 2 diabilder eller fyra konsekutiva 7 pm sektioner för att representera en nivå i tjocktarmen (Figur 1).
2. Upprepa för nästa nivå med ett avstånd på minst> 50 pm från sista delen av previous nivå. Detta avstånd säkerställas att kryptor bedömas för varje nivå inte kopiera varandra.
3. Torka ofta kryostat blad med 100% etanol för att avlägsna oktober rester som ackumuleras under skärning. Före sektione återupptages den torra bladet torkas med ett antistatiskt hårtork blad för att avleda ackumulerade statiska laddningen. Förvara glider med frysta snitt på -80 ^o C.

4. Färgning av Frozen avsnitt Tissue

1. Utför enzym histokemi reaktionen i ett 37 ° C varmt rum med hög luftfuktighet.
   OBS: Försök den enzymatiska reaktionen i en inkubationstid ugn eller på en bild varmare lett till dålig och inkonsekvent G6PD färgning.
2. Bygg brunnar för vävnadsfärgning med två 1,5 cm x 0,15 cm brickor stål (inre diameter x höjd) som är sammanbundna med hjälp av silikonfett (Figur 1). Skär parafilm för att passa basen av brunnen med centrum skars ut och brunnen platsd över vävnadssnitt på bilden.
   OBS: parafilm på undersidan av brickan skapar en tätning mellan sliden och brickan som upprätthåller den viskösa G6PD färgningsblandning på vävnadssnittet. Denna konstruktion ger en brunn med en 0,4-0,5 ml volym, så att varje sektion vävnad i studien får samma volym av G6PD reaktionsfärgningsblandningen.
3. Inkubera frusna vävnadsobjektglasen vid 37 ^{° C} i ett varmt rum under 10 min. Vid 37 ° C, tillsätt G6PD färgningsreaktionsblandningen till varje vävnadssnitt brunn (2 sektioner per bild) för 45-50 minuter. Ta bort diabilder från varmt rum, och lyft försiktigt brunnarna rostfritt stål utanför bilderna.
4. Ställ glider på deras långsidan för att göra det möjligt för reaktionsmediet rinna. Placera objektglasen i 100 mM PB (pH 7,4) under 30-60 min för avlägsnande av G6PD färgningsreaktionsblandningen från vävnaden utan att störa vävnadsfärgning. Sänk objektglasen i destillerat vatten under 5-10 min för att avlägsna Pb-salter
5. Täta vävnaden genom adding fluor-gel från en pipett på vävnaden och väntar ~ 30 min för att torka. Undvik bubblor som kan förbrylla identifieringen av muterade kryptor.
   OBS: Om det bildas bubblor, kan förfarandet upprepas efter avlägsnande av fluor-gelén genom blötläggning i destillerat vatten. Använd inte täckglas eftersom de tenderar att fälla luftbubblor.

5. Prövning av G6PD Mutant Crypts och mutationsfrekvens

1. Analysera bilder för G6PD muterade kryptor under ett ljusmikroskop.
   OBS: De kriterier som används för att identifiera en helt mutant krypta var: (i) hela kryptan saknade blå färg; (ii) den yttre strukturen i kryptan var intakt, (iii) mutanten kryptan observerades på intilliggande 7 pm sektioner och (iv) två observatörer fick identifiera samma krypta som en mutant. Mutanter som observerats på intilliggande 7 pm sektioner räknas som en mutant.
2. Bild varje G6PD mutant krypta vid 40x förstoring och katalogisera bilderna med hjälp av en 5,0 megapixel kamera medbildprogram.
3. Kvantifiera det totala antalet kryptor undersöktes i en mus genom att välja en representativ sektion för varje mus från nivån med den minsta ytarean och image det vid 10x förstoring (Figur 1C).
   OBS: En nivå representerar fyra konsekutiva 7 pm sektioner (figur 1D), som på grund av sin närhet ofta visar muterade kryptor på mer än en sektion. Nivåerna är åtskilda av> 50 | im för att visualisera kryptor från olika delar av kolon.
4. Öppna varje bildfil och visuellt räkna antalet kryptor på en nivå genom att analysera filerna (visas som rutor i figur 1C). Bildfiler kommer att variera i antalet kryptor observerade från så lite som 20 till> 300 kryptor i en fil.
5. Multiplicera det totala antalet kryptor från den valda nivån (Figur 1C) för varje mus med antalet nivåer screened för G6PD mutanta kryptor för varje kolon. Till exempel kan en total räkning av1250 kryptor per vald nivå multiplicerat med 8 nivåer screenas för muterade kryptor motsvarar en totalsumma på 10.000 kryptor. Utvärdera ett minimum av 10.000 kryptor för varje kolon för statistisk analys.
6. Kombinera antalet mutanter som observerats i alla djur med det totala antalet kryptor screenas för att beräkna MF för varje behandling. Bakgrunden stamcells MF nivå i obehandlade möss är <0.1x10 ^-4 (tabell 1), vilket ligger nära den tidigare rapporterats i C57BL / 6-möss. ¹¹

Representative Results

Möjligheten att mäta kolon stamcells mutationer hos djur ger ett unikt sätt att korrelera mutationer till cancerinduktion. Normalt antas det att det kritiska steget i karcinogenes involverar aktiverande mutationer i onkogener och / eller inaktiverande mutationer i tumörsuppressorgener. Vi injicerade C57BL / 6-möss med 200 pl PBS eller 10 mg / kg AOM i 200 fil PBS. AOM är en känd kolon cancerframkallande. ^5-7 Vid 90 dagar kolon analyserades med avseende stamcells mutationer. Denna tid krävs för att göra det möjligt stamceller till fullo fylla en krypta, och endast när ett helt crypt inte producerar G6PD är en krypta identifieras som en stamcells mutant. Exempel på helt muterade kryptor visas i figur 2. Figuren visar två olika riktningar (vertikala och horisontella) av de kryptor som uppstår vid framställning av de frysta snitt. Den vertikala vyn ser ned den långa axeln i kryptan och den horisontella ger en sidovy. Ropetpts som är vild typ för G6PD fläck blå med några vita som beror på slemproduktion från bägarceller. Genom att räkna det totala antalet kryptor på ett objektglas (fig 1) och antalet av muterade kryptor, kan MF för muterade kryptor beräknas. Inga muterade kryptor observerades i någon av> 100.000 vildtyp kryptor inspekteras i kontrollen (PBS-behandlade) möss. Vi sätter MF för kontrollmössen vara <0.1x10 ^-4, som ligger nära den tidigare rapporterats för C57Bl / 6-möss. ¹

Figur 1. Beredning av diabilder för G6PD färgning reagens. (A) brickor Två 1,5 cm x 0,15 cm stål (inre diameter x höjd) är förseglade ihop med silikonfett. Parafilm skärs sedan för att passa basen av brunnen med centrum skars ut och den väl placeras över den schweiziska valsade kolonvävnadssektioner påbilden. (B) Två vävnadssnitt från intilliggande 7 pm styckningsdelarna placeras på samma glas och färgas samtidigt. Skala bar: 1,0 cm. (C) Antalet kryptor i avsnittet bestäms genom att titta på vävnaden vid 10x förstoring. Antalet fält (visas som rutor) varierar med varje sektion. Antalet kryptor i varje fält bestäms genom visuell räkning och sattes för att ge det totala antalet kryptor för den nivån. (D) En nivå definieras som fyra på varandra följande 7 pm vävnadssnitt. Nivåerna är> 50 um isär för att undvika överlappning med tidigare bedömts kryptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Representativa exempelav muterade kryptor observerats i AOM behandlade C57BL / 6 hanmöss som inte producerar funktionell G6PD. Den kryptor G6PD mutanta är väl definierad men är praktiskt taget saknar blå fläck. Vildtyp kryptor som omfattar de flesta av de kryptor inom området är blå / lila indikerar G6PD enzymatisk aktivitet. Skala:. 10 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

behandling	incidens av mutanta kryptor	mutanta kryptor en	totala kryptor analyseras	MF (x 10 -4)
lösningsmedel	0/6 möss	0	> 10 5	<0,10
AOM	10/12 möss	43	96.821	60; 4,44

Tabell 1. Mutation frekvens i obehandlade och azoximetan behandlade C57BL / 6-möss. ¹²
Colonic stamcells mutationer i WT C57BL / 6-möss 90 dagar efter exponering för 10 mg / kg azoximetan (AOM) eller lösningsmedelskontroll.

Discussion

Ofta den genotoxiska effekten av en förening bestäms av dess förmåga att modifiera DNA. Detta sker normalt genom att isolera vävnaden och mäta den totala nivån på DNA-addukter. För AOM, skulle detta innebära att kvantifiera O ⁶ -methylguanine addukter i tjocktarmen. Med användning av detta tillvägagångssätt information om skador inom specifika celltyper, såsom i stamcellsnischen, går förlorad. Dessutom är en DNA-addukt inte samma sak som en mutation eftersom endast en liten delmängd av addukter så småningom omvandlas till fasta mutationer. ¹² Vi tillhandahåller häri detaljerna att reproducerbart kvantifiera stamcells mutationer i tjocktarmen baserat på den initiala metoden beskriven av Griffiths al. et ¹ och bygger på G6PD färgning utvecklats av VanNorden. ^4,8,9,13,14

Det finns flera viktiga steg för detta enzym histokemi metod för att producera ett kvantifierbart resultat. En är i sektionering av vävnaderna. Betydligt mer vävnad sektmåste genereras joner och analyseras än vad som skulle normalt göras med H & E histologisk analys. Vi bestämde att 7 pm sektioner gav bästa G6PD färgning efter utvärdering av 5, 6, 7, 8 och 10 pm tjocka sektioner.

För det andra, färgning av nödvändig antal värdefulla vävnadssektioner krävs en reproducerbar reaktionsblandning. Vi hittade användningen av polyvinylalkohol (PVA) som används i det ursprungliga protokollet att vara problematiskt eftersom det är ganska viskös vid de procentsatser lösning (18% och större) som krävs för att underlätta enzym histokemi reaktionen samtidigt förhindra spridningen av G6PD enzymet från vävnad. Bättre solubilisering av de reagens och kontroll av pH-värdet åstadkoms genom att ersätta PVA med oktober-medium, som innehåller 10% PVA. PH kan bestämmas exakt med pH-papper och om pH-värdet inte är nära till 7,4, lösningen kasseras utan att slösa dyrbar prov och tids vävnad. Denna förändring har lett till bättre och mmalm konsekvent färgning i vävnadssnitt. Vid pH (7,2-7,4) krävs för att mäta G6PD-aktivitet, har den fullständiga reaktionsblandningen en karakteristisk klar djup orange-röd färg, som sakta kommer att ändras till lila. Oavsett färg, om reaktionsfärglösningen är grumligt bör det kasseras eftersom den inte kommer att ge bra färgning. Vi fann att vissa partier av oktober-medium under förutsättning blandningar utanför det erforderliga pH-området så det är lämpligt att testa massor genom att lägga till PB (7,4) till oktober mediet och bestämma pH. Vi har också använt MMPMS som tidigare föreslagits, ^8,9 i stället för 5-methylphenazenium metylsulfat användes i den ursprungliga papperet ¹ för att eliminera ljuskänslighet av G6PD färgningsreaktionsblandningen.

Slutligen, metoden för att härleda MF är nya jämfört med andra metoder som tidigare använts. ^1,2 Färgnings artefakter kan leda till potentiella identifiering av falska G6PD muterade kryptor. Att felsöka thans problem analyserade vi 4 sammanhängande 7 pm vävnadssnitt som möjliggör visualisering av samma muterade kryptan i mer än ett vävnadssnitt (Figur 4D). Denna kontroll minskar risken för färgning artefakter som påverkar MF analysen. Även vår metod använder ett verkligt värde av den totala kryptor räknade att uppskatta det totala antalet kryptor analyserade vid beräkningen av MF.

På grund av den unika kryptan struktur som finns i tunn- och tjocktarmen, är det möjligt att bestämma läget av stamceller och cellhärstamning för varje krypta. En viktig begränsning för tillvägagångssättet är att den är begränsad till tarmen eftersom morfologin hos andra vävnader inte lika väl definierad som i kolon. Därför är det inte möjligt att bestämma den stamcells MF i de flesta andra vävnader som är mottagliga för cancer. Eftersom analysen är en fenotypisk analys baserad på förlusten av G6PD enzymatisk aktivitet, själva MF i stamcellspopulation kommervara högre än vad vi redovisar för G6PD beror på mutationer på wobble baser och punktmutationer som inte påtagligt påverkar den enzymatiska aktiviteten.

Även om det finns begränsningar och utmaningar för färgning för G6PD aktivitet i kolonvävnad att kvantifiera somatiska stamcells mutationer har betydande ändringar som gjorts i detta dokument för att förbättra möjligheten att utnyttja denna metod. Vi fann att dessa förändringar förbättrade reproducerbarhet att generera G6PD färgningsreagens och kvantifiering av MF. Dessutom färgning för G6PD enzymaktivitet som en markör för somatiska stamcells mutationer inte kräver en kompetens inom immunohistokemi färgning som skulle testa för uttryck av metallotionein, ¹⁵ annan potentiell markör för somatiska stamcells mutationer.

I framtiden kommer vi att analysera kolon stamcells mutationer hos möss som behandlats med miljö föreningar, såsom 2-amino-1-metyl-6-fenylimidazo [4,5-b] pyridin (PhIP) Och andra aromatiska aminer som finns i grillat kött, som är associerade med human koloncancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room