Abstract
此处所描述的社会空间测定可用于定量的果蝇melanogasteř社会互动-或其它小昆虫-以直接的方式。如我们以前表明图1，在一个二维室，我们首先迫使苍蝇形成紧密基，随后使它们采取彼此其优选距离。之后苍蝇纷纷落户，我们测量到最近的邻居（或社会空间）的距离，处理静态图片，免费在线软件（ImageJ的）。到最近的邻居的距离的分析，使研究人员能够确定遗传和环境因素对社会互动的效果，同时控制了潜在的混杂因素。不同的因素，例如爬坡能力，天，性别的时间，和苍蝇的数目，可以修改蝇社会间距。因此，我们提出了一系列的实验控制，以减轻这些混杂影响。此法可用于至少两个目的。首先，研究人员能够确定自己喜欢的环境转变（如隔离，温度，压力或毒素）会影响社会的间距1,2。其次，研究人员可以剖析社会行为1,3这种基本形式的遗传和神经基础。具体而言，我们用它作为诊断工具，研究认为参与在其他生物，如候选基因孤独症在人中4社会行为直系同源基因的作用。
Introduction
社会互动是至关重要的一个组内的整体正常发展的个人和健康，并能在众多的品种可以观察到，从人类（ 智人 ），以简单的有机体，例如果蝇（ 果蝇 ）5,6。单个果蝇或人共享共同方式处理过程中这些互动的感觉信息，它是否是：听觉，视觉，嗅觉，触觉，味觉或。我们和其他人推测可能有是一种潜在的共享neurocircuitry底层行为反应社会互动和神经元细胞和参与可能是进化保守的基因7。一旦初始相互作用已经发生，相互作用的个人之间的社会空间要么增加（社交回避8）或减小（组形成/聚合5）。更复杂的相互作用，如侵略或求爱，就可以成行。
果蝇的稳定基团，如在以下的研究1-4,9使用。社会空间是指一种苍蝇和其最接近的邻居10之间的距离的量度。社会空间是D的一个特定人群一致当实验条件将被保留（平均约1-2个体的长度），并且改变相对于所述蝇社会经验，如果个体已经被保持在隔离1增加果蝇 。正确的目标是要维持正常的社会距离，而不是传统的添味剂或CVA感知1。因此，衡量社会空间可作为诊断工具来分析社会交往和量化D.社会行为黑1，我们在这里描述的细节如何执行此量化，并共同实验变量的影响程度如何这种行为。
我们表明，在该试验进行腔室，以及蝇的数目的取向 - 在一定程度上 - 做影响社会的空间。这是以前表明腔的几何形状影响的苍蝇11,12自发探索性运动，这种现象可能会最终影响他们决定定居。然而，只要在蝇密度（飞/厘米2）和腔室方向保持相同，苍蝇的社会空间也保持不变。该测定的鲁棒性的事实，使用不同的腔室的尺寸，形状独立实验室，和取向可以复制由WH的突变体所显示的结果示出ITE基因（影响眼部色素沉着），这是一个增加社会空间（1个垂直三角形或横向循环，用气流在3水平平方）。
我们的结果还表明，保持在该社会空间实验进行时间是至关重要的结果的一致性，因为我们表明，男性，但不是雌性，进一步分开，在晚上。然而，看到白天和晚上的时间之间的差异不是由于苍蝇的活动不同，和大家讨论的论点，表示不与社会空间相关的活动水平。
最后，有遗传基础的社会空间的测定，由白突变体所指示已经描述的1,3，和苍蝇，我们在这里介绍的各种近交系和捕获的野生株之间的差异。
因此，这个实验使一个很好的工具˚F或研究的遗传效应以及环境因素。
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Protocol
1.设备和试剂创造了内部（材料为他人见列表）
- 制备果蝇冷麻醉装置如前所述8。
- 准备一个飞吸气如前所述13。
- 准备社会空间室和持有人。
- 命令或使玻璃板和丙烯酸垫片，以创造社会空间室。每个社会空间室由两个方形玻璃板（17.6厘米×17.6厘米，厚度为0.3厘米），两个直角三角形丙烯酸间隔物（16.5厘米，8.9厘米的碱基的高度，厚度为0.3厘米），并且两个矩形的空间（9厘米×1.5厘米，厚度为0.3厘米）（ 图1A）。
- 装配玻璃和丙烯酸类社会空间室，使得其与 图1B中的腔室。为此，通过将在玻璃上的一个方形窗格顶部的一个三角形垫片平面，使得启动直角三角形垫片的对准的平方窗格的一个角。下一步，放置在广场上窗格顶部的第二个三角形隔板持平，反映的第一个三角垫片。
注意：请一定要戴上手套，以免污染与你的手油和香料的作品。 - 将两个小矩形隔板平放在方形面板的顶部，以及未涉及窗格的一面。广场上飞机前的丙烯酸垫片，现在应该形成一个三角形的舞台。
- 放置玻璃的第二方形窗格上的丙烯酸系衬垫使得其上面低于玻璃原窗格对齐的顶部。
- 使用四种长尾夹来固定窗格和隔板一起以形成社会空间室。将一个剪辑邻近的拐角处，在每个三角间隔物的长边，将它们固定在玻璃板内部。在这些相同侧，放置一个夹在相邻的拐角处，在每个矩形隔板，将它们固定在另一边的玻璃板。
- 装配一个支座和一个烧瓶钳使得钳将保持在直立位置的社会空间室，作为社会空间室搁置在其上的工作表面的上边缘。
- 对于实验中的每个重复，组建一个社会空间室，并支持立场。
- 准备攀登试验反应装置检查苍蝇测试的爬坡能力。
- 使用逆流装置，如前所述14,15。
- 通过执行实验上覆盖着白色的长椅盖在白色背景前一个作业面确保均匀的照明条件。
2.准备蝇实验前
- 维护苍蝇含标准果蝇的瓶子飞的食物。它们保存在一个孵育室在25℃在12小时光照/黑暗循环。
- 一到两天之前，电子商务xperiment，收集并在冷麻醉性苍蝇，如前所述8。
- 寒意冷麻醉机在-4℃。将飞入50ml塑料管。完全淹没塑料管含在保温冰桶苍蝇成冰，等待至少5分钟，苍蝇变得动弹不得。
- 将苍蝇在冰冷的麻醉设备的聚乙烯薄膜。在RT，使用立体显微镜来的男性从女性分开。保持苍蝇成群，含标准果蝇瓶飞的食物，不超过40苍蝇每小瓶。
- 在实验开始前两小时，确保在试验时将执行的房间的温度为24-25℃，湿度大约为50％。
- 转移苍蝇到含有食品新的小瓶，并将它们放置2小时在哪里的实验将要执行的工作表面上。
注：对于这些experimenTS，所使用的蝇株果蝇品系：广-特殊或广-S（CS）， 瓦特1118铯10（或W - 瓦特1118异型杂交的10倍到广-S），俄勒冈州和萨马尔罕苍蝇都从我们的实验室库存16;埃尔伍德苍蝇被收集在2011年秋季在亨廷顿的埃尔伍德附近，长岛，纽约，美国8。除了当指定，否则，给出的结果，得到与广东-S蝇（在红色色调）。
3.执行实验
- （ - 以小时为单位的时间光发病后 - 时间授时ZT 4〜7）进行实验12点和下午3点之间。
- 准备的社会空间，室内苍蝇的转移。
- 放置一个社会空间室平放在工作台上，用含有最接近你的身体矩形隔板一侧。
- 删除ØNE夹最近你的身体，并向外滑动一个长方形的间隔，产生的矩形隔板之间大约为1厘米的差距。
- 使用磁带和标记，标号社会空间室与性别，应变和重复次数的上角。注意确保磁带不包括在内三角舞台的一部分。
- 转移苍蝇进入社会空间室。
- 转让航班从含有食物进入一个新的空药瓶的瓶。吸苍蝇从空药瓶，并将其转移到社会空间室。
- 吸入吸引苍蝇入抽吸器的尖端。头放入的社会空间室的矩形隔板之间1厘米的差距，并在呼气一致的速度，迫使苍蝇进入内三角的舞台。
- 立即矩形隔板滑回原位，关闭内三角竞技场的基部，然后将粘合剂剪辑重新打开。
- 上的冲击垫，它位于不同长凳比在该实验工作发生时，保持社会空间室直立，使得矩形隔板是在底侧。英镑三次，以确保所有的苍蝇已经下降到了舞台的底部。
注：由于亚克力间隔伸出最小室尺寸（ 图1D）中，砰的肘部在工作表面上，同时保持一个安全的扶住设备，以确保苍蝇已经跌到了谷底。 - 启动计时器。
- 放置在工作表面上的社会空间室和使用的支持立场，瓶夹，以保持直立。将尺子或已知长度的平贴在社会空间室的贴纸，但不涉及任何部位的内三角舞台。
- 对于水平放置的实验中，不要放在支撑支架上的社会空间室;而不是躺在工作台上的社会空间室持平。
- 当苍蝇纷纷落户，一般经过大约30分钟，以社会空间室的照片。确保帧包含整个内三角舞台上，统治者和标签。
- 重复实验每个基因型和条件（最好3个内部重复和3个独立的重复）。
4.分析的社会空间数据
- 在导入ImageJ的17以下宏
- ImageJ的可以在这里找到：http://rsbweb.nih.gov/ij/。
- 您可以通过保存在下面的宏在中的ImageJ / plugins文件夹命名为“Measure_Distances.txt”文件，在宏子文件夹中，并使用帮助>更新菜单命令创建的插件菜单中“测量距离”命令。“
- 在一个.txt复制文件中提供补充数据，并最初发表在3宏。
- 上传照片到电脑，并开立一个图像重新使用ImageJ。
- 在图片中的标尺上画线从0厘米〜1厘米的标记创建一个规模，并分析选项卡下，选择设置缩放功能可以设置一个比例为1厘米的距离（同样的方法进行的贴纸已知长度）。选择应用规模的图片前，在全局选项。
- 使用图像选项卡，使得它包括所有的苍蝇下的裁剪功能裁剪图片，同时消除尽可能多的画面尽可能的休息。
- 使画面的黑白从图片选项卡下的类型选项中选择8位。
- 在图像选项卡的调节选项下将阈值特征取下图像中的所有的背景噪音。拖动滑块以增强或删除的对比度，使得每个蝇的本体可以清楚地看到，而不在图像中的任何其他标记。如果有斑纹是不是苍蝇，捕捉它们与矩形工具，并将其删除。
- 摆好测量通过分析选项卡下的设置测量工具。选择面积，质量，质心的中心，并显示标签。接下来，选择分析颗粒分析选项卡下的功能来创建所有的黑点代表苍蝇编号列表。
- 当使用分析颗粒;集大小0.01-0.1（不选择像素单元）;圆0.00-1.00;显示轮廓;显示结果，并加入到经理。
- 确保每个黑点（每个粒子）是在原始图片，通过编号的列表进行比较，以原始图象的苍蝇的精确表示。
注意：如果一些苍蝇非常接近一起被算作一次粒子，手动绘制白线分离两个蝇二进制图像上。
- 虽然列表中选择，使用最近邻 - 列出的距离宏插件标签第二个宏选项下创建一个包含距离一个新的列表，在厘米，从EACH飞到离他们最近的邻居。
- 从复制ImageJ的最近邻距离并粘贴到一个电子表格程序的一列。
- 编译所有从每个重复数据到同一个电子表格，并组织由基因型和条件。
- 使用统计软件进行数据分析。在这个实验中，图垫棱镜（6版本的MacOSX，格拉夫派得软件圣地亚哥加利福尼亚美国，www.graphpad.com）被用来进行单向ANOVA和秩和检验测试，Tukey的和邓尼特的事后检验。
- 的距离的分布遵循非参数分布1，和数据被表示为框和Tukey的晶须（消除异常值）。
5.登山分析（控制行为）
- 使用登山法作为控制测试蝇攀爬能力14,15,18。
- 使用逆流装置，使得三个试验Ç一个可并行运行。
- 转移50到100天真果蝇（果蝇尚未前测试）在三个不同的测试小瓶，并且它们卡入第 1次，3次和最后时隙在逆流装置的底部，以在相反的位置新鲜空小瓶中。
- 放置在空槽新鲜空小瓶在装置的底部。
- 挖掘下来的装置三次，以使得所有的苍蝇都在每个管的底部，以启动试验。
- 启动定时器，持续15秒（时间足以为3-7天老广-S〜100％，达到了顶级小瓶-见图3F）。
- 滑动逆流装置的上部，由一个槽来置换顶小瓶中。
- 通过点击设备下来，把所有的苍蝇在底部瓶收集苍蝇。
- 1次和第2次管（或3次和第4次， 第 5次次 ），分别对应于没有达到顶部苍蝇和爬到山顶小瓶苍蝇。
- 计算性能指数（PI）。
- 算蝇每个小瓶的数目。
- 该PI是苍蝇能攀上上管的百分比。
- 在PI的装置遵循正态分布1，和数据被表示为平均值加或减标准误差的平均值（SEM）的柱形图。
注意：可替换地，在PI可被计算为苍蝇能达到较低小瓶（老年人苍蝇的上部的百分比，5秒的足够的时间以量化的差在感染与非爬坡能力感染12个天龄广-S从静止图像量化：看到的结果）。而其他人使用的惊吓引起的负趋地表现不同的措施，同时也是适当的量化爬坡能力19-22。
- 转让航班从含有食物进入一个新的空药瓶的瓶。吸苍蝇从空药瓶，并将其转移到社会空间室。
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Representative Results
社会空间室可以作为一种工具，以量化果蝇的社会行为。丙烯酸垫片和玻璃板被夹在一起以形成内三角竞技场，提供了一个在其中苍蝇能形成稳定的基团没有许多潜在的混杂线索的存在二维区域。当苍蝇被转移到垂直领域，它们是由被窃听下来吓了一跳，他们通过逃逸行为作出回应：负趋地。他们爬到直立的三角形的顶点，强行纳入一个紧密的组，然后提供时间，以进一步将形成彼此，并探讨了赛场。后20至40分钟，他们停止移动，并形成稳定的基团。每个飞和其最近的邻居之间的距离可以从一个图象进行测量，以提供他们喜欢的社会空间量化。蝇被认为是更社会它们是更接近他们的邻居。
苍蝇密度不发挥社会空间中的作用，在室内，直到下容量的地步。对于一个大组20〜70苍蝇在做大垂直取向的腔室的，社会空间是独立的基团密度（图2A，B）的 。只有10或15苍蝇在社会空间室，则很可能是不足够的个体，以形成一个稳定的社会组，从而导致增加的社会空间（图2A，B）。然而，测试大量苍蝇并不总是方便的 - 在某些情况下，其中的突变的个体的数目是有限的，研究人员可能不能够收集苍蝇为社会空间室的标准尺寸足够大的基团。为了便于定量使用小群体苍蝇社会空间，研究人员可以操纵社会空间室，使得二维竞技场的面积小，但每飞面积保持不变。 图 1C所示，D是两种类型的社会的修改为小团体的空间室，但维持相同的密度较大的室。以这种方式，保持蝇密度，并降低了腔室尺寸允许获得类似的社交间隔（图2C）。
相同的整体趋势仍然适用于放置在水平位置（ 图2D）的社会空间室。然而，我们可以观察到的苍蝇倾向于在这样的水平设置为进一步分开，并且它们不会沉淀轻易1。有15只和20苍蝇组表现出更大的社会空间比40苍蝇（F igure 2D）组。
为了确认拥挤是不负责的较小的距离至最接近的邻居见于较大苍蝇组，从每个距离飞到所有其他蝇进行测定，如在9。量化到所有的苍蝇最近的邻居的距离，与距离，让评估组behavi代替个人组内的行为，或者，。正如预期的那样，对所有的苍蝇增加苍蝇的组中的量的距离更大，反射个体苍蝇不组本身的，。观察到垂直和水平定位社会空间室（ 图2E，F），这种趋势。因此，苍蝇较大的群体不是被迫让自己的邻居更近的距离，由于空间的限制。相反，苍蝇形成更紧的社会群体，当有超过15苍蝇在腔室。
至于其他的行为测试，一个限制使用社会空间室垂直是，它需要的苍蝇，没有趋地性或攀爬损伤。例如，广-S蝇感染一周与革兰氏阴性菌雷氏普罗威登斯菌 23具有一个攀爬缺陷和表现出不同的社会间距的结果取决于社会间隔的取向室。当垂直进行试验，感染苍蝇的社会空间大于对照的社会空间，可能是因为受感染的苍蝇不能够形成稳定的组在腔室（图3A）的顶部。当在相同条件下的苍蝇的水平定向的社会空间室然后测试，没有显著差异，表明运动能力可能是较少的一个因素在水平定位的社会空间室（图3B）的社会空间。而被感染的苍蝇是视觉少能够攀爬比控制，这可以通过使用攀登测定（ 图3C）来量化。 5秒钟后，控制苍蝇约44％爬上到下小瓶的上半部分和只有32％被感染的苍蝇。值得注意的是，所有的苍蝇在该测定中爬很差（他们很少到达顶小瓶，下部小瓶只有上半部分），其可以通过以下事实来解释，它们后12天羽化，这是当苍蝇开始表现出因老化22攀爬的缺陷。
然而，对于那些没有攀爬缺陷菌株，腔室既取向导致了同样的结果，正如我们先前已经显示1。在该实验中，在社会空间同样增加在垂直三角形或水平圆形室（ -再分析发表在1中数据的盒须图3D中的E）被看到广-S和瓦特1118铯10。有在广-S之间以及 w 1118铯10爬坡能力，指示它不是为菌株之间在任一腔室中的方向社会空间的差异的因素没有差异（15秒的选择- 图3F）。如果给定的5秒的选择17％±3.3的CS和14％±2.5 瓦特1118铯10达到上小瓶（无统计学不同，数据未显示）。
使用社会空间室研究人员还必须确保他们重复他们的实验在一天的同一时间。对于这两种广-S 和 W 1118铯10雄蝇，当天受影响的社会互动的时间。相较于白天（授时时间 - 在发病后轻小时的时间 - ZT4到ZT7），在晚上测试的苍蝇（ZT11到ZT12 - 只是前灯关）表现出更大的社会空间的两种基因型，虽然他们的相对空间差异被保留下来-例如，W 1118铯10苍蝇仍比广州-S在晚上（ 图4A）苍蝇较少的社会。有趣的是，广-S只雄性的社会空间，但试验时女性帽子增大到了晚上，虽然有对社会空间的雌蝇晚上（ 图4B）大的变化的趋势。之前我们已经独立提出了同样的意见24。
正如我们先前报道的用俄勒冈-R线，研究双酚A（BPA）2的效果，社会空间室也是果蝇的遗传背景的敏感。在这里，我们表明，埃尔伍德，最近抓到野生型线，也比广州-S和撒马尔罕但不俄勒冈州（ 图5）增加了社会空间。撒马尔罕州和俄勒冈州的社会空间并没有显著彼此不同，但均高于广东-S（ 图5）的社会空间更大。这些数据表明，在给定的环境，不同的近交系和野生型菌株具有一个不同的社会空间，指示一个遗传成分到的行为。这也预示着SE本次测试的nsitivity因此要求苍蝇被远交到合适的遗传背景进行试验之前。这将有助于确保的差异，或相反地相似之处，见于社会空间是由于因子被测试。
图1。社会空间室部件和安排。 （A）的各种尺寸的社会空间室可使用同一玻璃板（17.6厘米×17.6厘米×0.3厘米）和丙烯酸衬垫在直角三角形的形状来构造（16.5厘米的高度，为8.9厘米碱和一厚度为0.3厘米-由一个小字母a）和矩形（9厘米×1.5厘米×0.3厘米表示-由一个小的字母B表示）（B）中的最大的社会空间室，如在1中记载的适于30-40苍蝇。它有内在的朦胧16.5厘米×16.5厘米ensions 14.5厘米，给出86.45厘米2的面积 ，并导致2.16厘米2每飞40苍蝇的区域。（C）的甲腔室大小最佳为20苍蝇。它具有16.5厘米×14.5厘米5.96厘米内尺寸，得到43.25厘米2的区域，并且导致2.16厘米2每飞的区域。（D）的更小的腔室，最佳为15苍蝇。它有10.2厘米8.9厘米8.9厘米内部尺寸，给人一种32.45厘米2的面积，并导致2.16 平方厘米每飞一个领域。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。室和组的大小，而不是密度的方向，影响到社会空间，数据表示在一个盒子并到最接近的邻居在腔室的距离，与表示第 1次四分位（ 第 25％）的箱子和第 3四分位数（ 第 75个百分比），该行中的框代表中位数，以及Tukey的晶须的晶须情节（AB）的有代表性的数据表明，增加了相同大小的一个腔室中的苍蝇的数量导致稳定的社会空间测量。 10〜70届-S雄蝇的群体被放在更大的垂直社会空间室，并静置30分钟;每个蝇的近邻的距离记录下来。有少于15苍蝇集团也不必在大室20多苍蝇组显著更多的社会空间。（A）组，每组10 N = 9，20，N = 9，30，N = 8，40，N = 8，秩-Wallis 检验 P <0.0001，邓恩的多重对比测试：每个字母表示组统计学差异一·B P <0.0001（B）<。/ 15 N = 6，40，N = 8，50，N = 5，60，N = 6，70 N = 5，秩和检验检验 P <0.0001，一·B P <0.001 STRONG>组。（三）当腔室的尺寸被调整以维持蝇密度（分别在大室15中的小，20在介质或40，在2.16厘米2每蝇的密度每一次，垂直测试时无显著差异是观察。（D ）但是，当这些社会空间室被水平放置其中有15或20个蝇不得不相比具有40蝇（15 n组= 3，20 n = 4时，40 n = 4时，采用Kruskal团体最近邻更大的距离基-Wallis 检验 P <0.0001，邓恩的多重比较测试·B P <0.01）。（E-F），以所有飞行的距离被测量的15组，20和40只雄性广-S果蝇放置在垂直和水平取向的腔室。苍蝇在腔室的较大的量，以所有的距离越远苍蝇（（E）：组15 N = 6，20，N = 6，40，N = 3，秩和检验检验 P <0.0001，邓恩的多重比较测试·B P <0.01;（F）：组15 N = 6，20，N = 6，40，N = 3，秩和检验检验 P <0.0001，邓恩的多重比较测试＃B＃ 中 c p <0.0001）。注：在3个不同地理区域，因此不同的实验室环境得到（A，B和CF）的数据显示（A）区1：加州大学洛杉矶分校，洛杉矶，加州;（B）区2：纽约大学，NY，NY; （CF）区域3：西方大学，伦敦， 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.定位Øf显示社会空间室可用于控制混杂趋地性问题（A - C）：40只雄性广-S苍蝇群组不是被感染了P.雷氏普罗威登斯菌七天或注射作为对照放入一个社会空间室要么垂直（A）或水平方向（B）的位置，并使其沉降30分钟的介质。每个蝇的最近邻的距离记录下来。的数据被表示在至最接近的邻居在腔室的距离的盒须图，与表示第 1次四分位（ 第 25％）的箱子和第 3四分位数（ 第 75个百分比），在框中线代表中位数，和杜克胡须。（A）有代表性的数据显示增加的社会空间苍蝇感染P.雷氏普罗威登斯菌 ，并放置在一个垂直放置的社会空间室，相比注射介质（秩秩试验：每个字母表示组统计学差异P <0.0001，每组6）（B）的代表性数据显示社会空间不受P.。 （：P> 0.1中，n = 5的Wilcoxon秩检验）（C）的甲逆流装置是用来评估二者感染，并且媒体控制苍蝇攀爬行为。当苍蝇被放置在一个水平放置的社会空间室雷氏普罗威登斯菌感染。受感染的苍蝇爬更差比他们的媒体控制（蝇〜12个日龄，图形表示平均性能指数±SEM：％苍蝇在小瓶的上半部分，在5秒的选择;二尾t检验与韦尔奇的纠错;每组6 60苍蝇〜，每个字母表示组统计学差异P = 0.08）（D - F）：垂直和水平放置室，无论是三角形或圆形，被用来比较的广-S（CS的社会空间）与W¯¯1118铯10（W）这一点。的数据被表示在至最接近的邻居在腔室的距离的盒须图，与表示第 1次四分位（ 第 25％）的箱子和第 3四分位数（ 第 75个百分比），在框中线代表中位数，以及Tukey的晶须。在这两个社会空间室的方向和形状，W 1118铯10 有比广州-S（（D），纵三角更大的社会空间：秩和检验测试，每个字母表示组统计学差异P <0.0001，（E），水平度盘：秩和检验测试，每个字母表示组统计学差异P <0.01）。（F））一个逆流装置是用来评估既广-S 和 Cs 10 W的1118攀爬行为株（飞行3-5天的时候，图中表示平均值性能指标±SEM：％苍蝇在上面小瓶在15秒的选择）。有在任广-S之间或 W 1118铯10的能力没有什么区别。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。男性的社会空间，在晚上增加。（A）有代表性的数据显示了在傍晚时分男性之间增加了社会空间飞行相比，中午小时（“黄昏”ZT 11-12，前灯熄灭）（“天“ZT 4-7）。 40广-S苍蝇和 W 1118 Cs的10组在任一小时白天或晚上的时间蝇放入一个社会空间室并使其沉降30分钟。每个蝇的最近邻的距离记录下来。对于这两种基因型，苍蝇在晚上增加了社会空间和株之间的差异，保持了不管白天的时间（n = 6-7，秩和检验检验P <0.0001，邓恩的多重对比测试：每个字母表示组统计学差异P < 0.01）。（B）当广州-S苍蝇按性别只有男性分开显示，在晚上（T P <0.01）增加社会空间，尽管对于更大的内部变化的非显著的趋势被认为是女性（秩-Wallis测试中，每个字母表示组统计学差异P <0.0002）。的数据被表示在至最接近的邻居在腔室的距离的盒须图，与表示第 1次四分位数（25％的次 ）的框和3第三四分位数（ 第 75个百分比），在代表中位数箱线，和杜克的胡须。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5。苍蝇的遗传背景会影响社会空间。40届-S，撒马尔罕，俄勒冈组和埃尔伍德苍蝇被放在一个社会空间室，并静置30分钟。每飞的近邻的距离记录。的基团的分布是不同的（Kruskal-Wallis检验，P <0.0001），组不共享公共信是显著不同。的数据被表示在一个盒须p很多最近邻中的腔室的距离，与表示第 1次四分位（ 第 25％）的箱子和第 3四分位数（ 第 75个百分比），该行中的框代表中位数，以及Tukey的晶须（邓尼特的多重比较检验 ，P <0.05 [D] P <0.001 [A，B，C]，1-2内部重复3次独立重复，使得对埃尔伍德和撒马尔罕N = 3，俄勒冈州和广东-S N = 4 ）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这个协议中，对社会空间的量化的详细过程进行了说明。一些关键步骤，以确保实验成功的是：1）清理和设置设备，以保持自己的油脂和香料关闭设备的内室，2）确保苍蝇被收集之前至少有一天，当一直使用的手套实验，以减少冷麻醉的任何潜在影响，3）在实验前2小时，提供一种含有新鲜食物，以确保苍蝇不饿死，并已清洁自己新小瓶中，4）在这些2小时，让苍蝇使其恢复到其新的环境，5）进行实验时注意温度和湿度条件;尽量保持它们之间24-25℃和50％的湿度相一致，6）确保在运行实验，以不打扰社会空间室，和7）进行实验，在一天的同一时间，优选之间授时时间ZT4和ZGT7。
社会空间只依赖于苍蝇的腔室内的密度，而不是依赖于组的大小，只要有满足最小组大小。不管该组的成员的量的苍蝇将保持在它们之间相同的社会间距。然而，距离到在腔室中的所有的苍蝇，正如所料，通过组大小，以及腔室的方向的影响。要注意的是，尽管在水平方向是具有挑战性的使用（苍蝇不那样容易沉降），并导致降低的分离基因型之间在我们手中（图3D相比3E）是很重要的，Burg等3成功地使用的水平，方室。在他们的实验中，以最近邻居的距离是最类似我们的垂直取向的社会空间的效果。然而，在他们的房间，有一个持续的气流可能已经到了果蝇的社会群体的间距是最类似我们的垂直腔，而不是我们的水平腔贡献。一个限制使用垂直室是检验果蝇具有MOBILI的能力TY损伤。社会空间室要求苍蝇是移动的，使他们能够在他们希望什么距离，他们的邻居是选择。如果苍蝇动或以某种方式有缺陷，他们可能无法正确地形成稳定的基团中的腔室。对于运动可怜的一个潜在的补救措施将是再使用横向室，或允许更多的时间为苍蝇在拍摄照片前结清。研究人员还必须评估攀爬能力和苍蝇可能geotactic损伤，以查看是否在垂直社会空间室是合适的。如果在任一这些缺陷，水平定位腔室可用来避免。
值得注意的是，如果攀登飞活动或整体的体力和健康会影响到社会空间的测量，我们表明活动或运动水平不与社会空间密切相关。在另一项研究中，我们表明，治疗是减少运动，（喂食BPA）也减少了社会空间 2。但皱纹的突变体（孤独症候选基因neurobeachin的果蝇直系同源基因）显示多动症和增加社会空间 4。最后， 白色突变果蝇显示增加的社会空间1,3，无任何运动增加或趋地18。简而言之，活动水平和社会间距的几种组合已经观察到目前为止，表明两种行为之间没有相关性。事实上，社会空间不一定与其他社会行为或者，如社交回避8,25，表明不同的潜在的神经电路。例如， 多皱/ neurobeachin显示的突变增加了社会的空间，减少社交回避4;但白方既增加了社会空间，以及非常强大的社交回避4。
随着一天中的时间会影响社会空间，至少在男性，这是critica升，研究人员是认识到一天的时间时，他们的实验中进行，并且由努力来保持恒定的时间进行所有的实验。其它考虑事项而应占包括年龄，性别，和苍蝇的配合状态。我们知道，社会距离在处女相比，增加交配的个体，无论是男性和女性1，和我们现在显示，男性比女性在晚上（ 图4B）少关闭。在单蝇白天的活动水平应变特定性别差异先前已描述的，提议在早晨和傍晚男性相比天时间可能与他们的求偶行为-26,27-更高运动活性。然而，在我们的例子中，男女是分开的，但苍蝇进行分组，并通过我们衡量他们的社会空间的时候，苍蝇纷纷落户。藤井等人 27日报道 ，在对男性的生理节奏保持同时有一个不稳定的生活节奏，没有明确的山峰，当女性对韵律表现得像是一个苍蝇。因此，男性增加的间距在晚上可能不涉及增加求偶行为或自发活动的具体增加，潜在的此行为的性别差异的原因有待进一步调查。
与此考虑，苍蝇应始终按性别为实验分离，从而在男性和女性之间的社会互动的差异可以看出。最后，我们目前还不知道的年龄如何影响果蝇的社会互动。因此，我们建议社会空间实验苍蝇不超过七天旧的进行，各种行为表现，其中包括登山活动被称为是受影响的苍蝇超过一个星期的老22。
社会空间最后需要考虑的是中位数观察到的变化社会距离。社会空间测量是从不同位置，包括（洛杉矶，加利福尼亚：图2A;新-纽约，NY： 图2B，图3D，图4，图5;伦敦，ON： 图2C-F，纽约州伊萨卡：图图3A，B;位于同一广-S背景）。未知变量不是地理位置，或实验室环境之间不断，影响了平均社会距离。可能的因素包括不同的食物，海拔，本身大气压，变化在大气压28。虽然位数不是恒定位置之间，在一个位置中位数是高度恒定和可重现的;并且出现在社会空间测量的趋势和模式仍然之间的位置相同。因此，只要保持研究者内部恒定的条件下，它们将是一个竹叶提取检测社会空间的差异。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Nikon | SMZ-645 | Any other standard scope for fly handling would work |
| Small paint brushes | for pushing flies | ||
| Jazz-mix | Fisher | 33545 | any other standard drosophila food would work |
| Mini-Alarm Timer/Stopwatch | |||
| Sharpie pens | |||
| Adhesive Tape | |||
| Medium size binder clips | Staples | to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity | |
| small SupportStands | Carolina | 707161 | to hold the chambers in a vertical orientation |
| Buret clamps | Carolina | 707362 | |
| Digital Camera | Nikon | Coolpix S8000 | to take the still pictures |
| small ruler | to be able to scale the picture | ||
| trifold board and white bench cover | to provide a white background, and a homogeneous light. | ||
| pounding pad | any mouse pad works. | ||
| Prism 6 | GraphPad Software Inc. | Prism 6 for Mac OS X | Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work |
References
- Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila.: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on the behavior of Drosophila melanogaster. - Potential use of Drosophila as a model in the study of neurodevelopmental disorders. Behavioural Brain Research. , (2015).
- Burg, E. D., Langan, S. T., Nash, H. A. Drosophila social clustering is disrupted by anesthetics and in narrow abdomen ion channel mutants. Genes Brain Behav. 12, 338-347 (2013).
- Wise, A., et al. The autism candidate gene Neurobeachin (Rugose) mutants in Drosophila exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurosci. , 1-9 (2015).
- Parrish, J. K., Edelstein-Keshet, L. Complexity, pattern, and evolutionary trade-offs in animal aggregation. Science. 284, 99-101 (1999).
- Sokolowski, M. B. Social interactions in ‘‘simple’’ model systems. Neuron. 65, 780-794 (2010).
- Rittschof, C. C., Robinson, G. E. Genomics: moving behavioural ecology beyond the phenotypic gambit. Animal Behaviour. 92, 263-270 (2014).
- Fernandez, R. W., et al. Straightforward assay for quantification of social avoidance in Drosophila melanogaster. JoVE. (94), e52011 (2014).
- Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila. social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
- Mogilner, A., Edelstein-Keshet, L., Bent, L., Spiros, A. Mutual interactions, potentials, and individual distance in a social aggregation. J Math Biol. 47, 353-389 (2003).
- Liu, L., Davis, R. L., Roman, G. Exploratory activity in Drosophila requires the kurtz nonvisual arrestin. Genetics. 175, 1197-1212 (2007).
- Soibam, B., et al. Open-field arena boundary is a primary object of exploration for Drosophila. Brain Behav. 2, 97-108 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology - A laboratory Manual., Ch. , Cold Spring Harbor Press. 475-481 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 1, 2nd, IRL Press. 265-317 (1998).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
- Rasband, W. S. ImageJ. , US National Institutes of Health. Maryland, U.S.A. (1997).
- Simon, A. F., et al. Drosophila, vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila .dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. JoVE. (74), e50339 (2013).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. JoVE. , e2504 (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster. with age. Mech Ageing Dev. 127, 647-650 (2006).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. JoVE. , (2015).
- Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, Washinton D.C., , (2013).
- Suh, G. S. B., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster.--Sex-specific differences suggest a different quality of activity. J. Biol. Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Fujii, S., Krishnan, P., Hardin, P. E., Amrein, H. Nocturnal male sex drive in Drosophila. Curr Biol. 17, 244-251 (2007).
- Pellegrino, A. C., et al. Weather forecasting by insects: modified sexual behaviour in response to atmospheric pressure changes. PLoS One. 8, e75004 (2013).
