Abstract
または他の小昆虫- -簡単な方法で、ここで説明する社会空間アッセイは、 ショウジョウバエmelanogaste rの社会的相互作用を定量化するために使用することができます。我々は以前に1を示されているように、二次元のチャンバ内で、我々は最初に、タイトなグループを形成するためにハエを強制その後、それらを互いに、その好適な距離を取ることを可能にします。ハエが確定した後、我々は無料のオンラインソフト（ImageJの）と静止画を加工する、最も近い隣人（または社会空間）までの距離を測定します。潜在的な交絡因子を制御しながら、最も近い隣人への距離の分析は、研究者は社会的相互作用の遺伝的要因と環境要因の影響を決定することを可能にします。そのような能力が、一日の時間、性別、ハエの数を、登山などの多様な要因がハエの社会的な間隔を変更することができます。そこで我々は、これらの交絡影響を緩和するために実験的な一連の制御を提案します。このアッセイすることができます少なくとも2つの目的のために使用されます。まず、研究者は、（例えば、分離、温度、ストレスや毒素など）自分の好きな環境のシフトは、社会的間隔1,2にどのような影響を与えるかを決定することができます。第二に、研究者は、社会的行動1,3のこの基本的な形の遺伝的および神経基盤を分析することができます。具体的には、例えば、ヒト4における自閉症の候補遺伝子のような他の生物、社会的行動に関与すると考えオルソロガス遺伝子の役割を研究するための診断ツールとしてそれを使用していました。
Introduction
社会的相互作用は、全体として、グループ内の個人の適切な発達と健康に不可欠であり、そのようなミバエ（ キイロショウジョウバエ ）5,6などの単純な生物に人間（ ホモ・サピエンス ）から、多数の種を越えて観察することができます。聴覚、視覚、嗅覚、触覚、または味覚：個々の果実はそれがいるかどうか、これらの相互作用の間に感覚情報を処理するための一般的な手段を飛ぶか、人間のシェア。我々と他の人がそこに社会的相互作用に行動反応の基礎となる可能性の共有neurocircuitryであり、関係する神経細胞や遺伝子が7を進化的に保存される可能性があることと仮定しました。最初の相互作用が発生した後は、相互作用の個人間の社会的空間が増加（社会回避8）または減少（グループ形成/アグリゲーション5）のいずれかになります。より複雑な相互作用は、侵略や求愛のように、その後、場所を取ることができます。
1-4,9で使用されるように、 キイロショウジョウバエの安定したグループで社会的相互作用を評価するために、間飛距離を定量化する簡単なプロトコル、または社会的な空間を説明します。社会空間は、フライとその最も近い隣人10との間の距離の尺度を指します。社会空間は、Dの所定の集団のために一致していますショウジョウバエの実験条件は、（1-2本体の長さの中におよそ平均）に保存し、個人が分離1に保持されている場合に増加し、ハエの社会的経験に関して変化しているとき。適切なビジョンは、通常の社会的距離を維持するために必要であるが、臭気物質またはCVA知覚1古典ません。社会空間の測定は、このようにすることができます社会的相互作用を分析し、Dに社会的行動を定量化するための診断ツールとして使用メラノ1。我々は、この定量化を実行する方法を詳細にここで説明し、どの程度まで共通実験変数は、この動作に影響を与えます。
程度の - - 行う社会空間に影響を与え、我々は、アッセイが行われるチャンバー、ならびにハエの数の向きがあることを示します。これは、以前にチャンバー形状はハエ11,12の自発的な探索の動きに影響を与え、彼らが定住することを決定したところ、この現象は、最終的に影響を与える可能性があることが示されました。しかし、限りフライ密度（フライ/ cm 2）を、チャンバの向きと同じに保たれ、ハエの社会的なスペースも一定です。このアッセイのロバスト性は、異なるチャンバのサイズ、形状、および配向を用いて独立した研究所がWHの変異体によって表示された結果を再現することができるという事実によって示されます増加社会空間であるITE遺伝子（目の色素沈着に影響する）、（1垂直三角形や水平の円を、3の気流水平正方形）。
我々の結果はまた、我々は男性ではなく女性は、夜にはさらに離れていることを示しているように、社会的宇宙実験が行われた時刻を維持することは、結果の一貫性に不可欠であることを示しています。しかし、昼と夜の時間の間に見られる違いはハエの活動の違いによるものではない、と私たちは活動レベルが社会空間と相関されていないことを示す引数を議論します。
白変異体によって示されるように最後に、社会空間の決意に対する遺伝的基盤が存在する既に1,3を説明し、我々はここに提示するハエの様々な近交系と野生キャッチ株との違い。
したがって、このアッセイは、優れたツールFを作りますまたは遺伝や環境要因の影響を研究します。
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Protocol
社内作成1.機器および試薬（その他の資料の一覧を参照してください）
- 以前8に記載されているように 、ショウジョウバエ冷たい麻酔装置を準備します。
- 以前に13を説明したようにフライアスピレーターを準備します。
- 社会空間室とホルダーを準備します。
- 注文や社会空間室を作成するために、ガラス板やアクリルスペーサーを作ります。各社会空間室は、0.3センチ厚さで16.5センチ、8.9センチメートルのベースの高さと、右側の2つの三角形のアクリルスペーサー（（0.2センチ厚さで、17.6センチメートル17.6 cm）の2つの方形の窓ガラスで構成されてい）、および2つの矩形のスペース（0.2センチ厚さの1.5cmで9センチ）（ 図1A）。
- それは、図1Bのチャンバーと同じになるように、ガラスやアクリル社会空間室を組み立てます。これを行うには、そのような直角そのガラスの1平方ペインの上に平らな1三角形のスペーサを配置することによって開始します三角形スペーサーの四角枠のコーナーの一つと整列しています。次に、最初の三角形のスペーサーをミラーリング、正方形の枠の上に第二の三角形のスペーサを平らに置きます。
注：あなたの手からの油や香りで作品を汚染しないように手袋を着用していることを確認します。 - カバーされていないウィンドウの側面に沿って、正方形の枠の上に平らな二つの小さな長方形のスペーサーを配置します。正方形の平面の上にアクリルスペーサーは現在、三角形のアリーナを形成すべきです。
- それは以下のガラスの元ペインの上に整列されるように、アクリルスペーサーの上にガラスの第二の正方形のウィンドウを配置します。
- 社会空間室を形成するために一緒にペインとスペーサを確保するために4つのバインダークリップを使用してください。ガラス板の内側にそれらを確保し、三角形の各スペーサの長辺の上に、隅1つのクリップを配置します。これらの同じ側面には、それらを固定し、長方形の各スペーサを介して、隣接する角にクリップを配置しますガラス板をサイド。
- 支持スタンドと社会空間室は作業面の上に、そのエッジ上に載っているようクランプが、直立位置に社会空間室を維持するようにフラスコクランプを組み立てます。
- 実験における各繰り返しのために、社会空間室と支持スタンドを組み立てます。
- テストしたハエの登坂能力を確認するためにクライミングアッセイ応答装置を準備します。
- 以前に14,15に記載されているように 、向装置を使用してください。
- 白いベンチカバーで、白い背景の前に覆われた作業台の上に実験を行うことにより、均質な照明条件を確認してください。
2.実験の前にハエの準備
- 標準ショウジョウバエ食品フライを含むボトルでハエを維持します。 12時間の明/暗サイクルで25℃でのインキュベーション室に保管してください。
- Eの前に1〜2日xperiment、以前8に記載されているように 、冷たい麻酔下で収集し、セックスのハエ。
- で-4℃の冷たい麻酔装置を冷やします。場所を50mlプラスチックチューブに飛びます。完全に不動になるためのハエのために、少なくとも5分待って、絶縁アイスバケット内の氷にハエを含むプラスチックチューブを沈めます。
- 冷たい麻酔装置のポリエチレンシートの上にハエを置きます。 RTで、女性から男性を分離するために実体顕微鏡を使用しています。標準のショウジョウバエを含むバイアル中で、グループで、ハエを維持するには、1バイアル当たり40ハエを超えない、食べ物を飛びます。
- 二時間実験の開始前に、実験が行われる部屋の温度が24〜25℃の間で、湿度は約50％であることを確認してください。
- 食品を含む新しいバイアルにハエを移し、実験が実行される作業面に2時間のためにそれらを配置します。
注：これらのexperimenについてTS、使用ハエ株はキイロショウジョウバエ株であった：カントン特別またはカントン-S（CS）、1118 wのCsの10（またはW - 1118ワットはカントン-Sに10回を外部交配）、オレゴン州とサマルカンドハエは、私たちの研究室からのすべてでした株式16; Elwoodのハエはロングアイランド、ニューヨーク、米国8に、ハンチントンのエルウッド周辺に2011年秋に採取しました。特に指定時離れて、提示された結果は、カントン-Sは、（赤の色合いで）飛んで得られました。
3.実験の実行
- （ - 光の発症後数時間の時間 - Zeitgeber時間ZT 4の7に）午後12時と午後3時間の実験を行います。
- ハエを転送するための社会空間室を準備します。
- あなたの体に最も近い長方形のスペーサを含む側で、作業台の上に平らな社会空間室を置きます。
- O削除あなたの体の最も近いNEクリップと長方形のスペーサ間約1cmの隙間を作成し、外側に1つの矩形のスペーサーをスライドさせます。
- テープとマーカーを使用して、性別、ひずみ、および繰り返し数と上隅に社会空間室にラベルを付けます。インナー三角アリーナの一部をカバーしていないテープを確実にするために注意してください。
- 社会空間室にハエを転送します。
- 転送は、新しい空のバイアルに、そのバイアル含む食品から飛びます。吸引し、空のバイアルからハエや社会空間室にそれらを転送します。
- 吸引器の先端にハエを描画するために吸い込みます。社会空間室の長方形のスペーサ間1cmの隙間に先端を配置し、内側の三角形の場にハエを強制的に一貫性のあるレートで息を吐きます。
- すぐ内側の三角形のアリーナのベースを閉じて、元の位置に戻し、長方形のスペーサーをスライドさせ、背面にバインダークリップを配置します。
- 実験作業が行われる場所とは別のベンチの上に位置してドキドキパッド、に、長方形のスペーサが下側にあるように直立社会空間室を開催しています。すべてのハエを確保するためにポンドを3回アリーナの底に落ちています。
注：ハエが下に落ちていることを確認するために装置上で、安全なホールドを維持しながら、最小のチャンバーサイズ（ 図1D）から突き出アクリルスペーサーに、作業台の上に肘を強打によるものです。 - タイマーを開始します。
- 作業台の上に社会空間室を置き、直立それを維持する支持台と、フラスコクランプを使用しています。定規や社会空間室に対して平らに既知の長さのステッカーを置きますが、内側の三角形のアリーナのどの部分をカバーしていません。
- 水平に配置実験のために、支持スタンドにおける社会空間室を置かないでください。代わりに社会空間室は、作業面に平らに横たわっていました。
- ハエが落ち着いているときは、通常約30分後、社会空間室の写真を撮ります。フレーム全体の内側三角アリーナ、定規、ラベルが含まれていることを確認してください。
- 各遺伝子型および条件（理想的には3つの内部反復と3つの独立した反復配列）のための実験を繰り返します。
4.社会空間データの分析
- ImageJの17で、次のマクロをインポート
- ImageJがここにあります：http://rsbweb.nih.gov/ij/。
- あなたは>更新メニューコマンドをマクロサブフォルダに、ImageJの/ pluginsフォルダに「Measure_Distances.txt 'という名前のファイルに以下のマクロを保存することにより、プラグインメニューの「測定距離」コマンドを作成し、ヘルプを使用することができます。」
- .txtファイルでコピー補足データで提供され、当初は3に掲載されたマクロ。
- 画像をコンピュータにアップロードし、1影を開きますImageJのを使用して再。
- のステッカーのために（同じアプローチを写真の定規に1cmのマーク0 CMから線を描くことで、スケールを作成し、[分析]タブの下で、その距離では1センチスケールを設定するには、Setスケール機能を選択既知の長さ）。画像にスケールを適用する前に、グローバルオプションを選択します。
- 可能な限り、画像の残りの多くを除去しながら、それはハエのすべてを含むように[画像]タブの下にトリミング機能を使用して画像をトリミング。
- [画像]タブの下のTypeオプションから8ビットを選択して、画像が白黒にします。
- [画像]タブの調整オプションでしきい値の機能に行くことによって、画像からすべてのバックグラウンドノイズを除去します。各ハエの体は明らかに、画像内の他のマーキングせずに見ることができるように、コントラストを向上させるか、削除するには、スライダをドラッグします。ハエではないマーキングがある場合は、長方形ツールでそれらをキャプチャし、それらを削除。
- 設定[分析]タブで設定測定ツールを使用して測定。エリア、質量、重心のセンター、表示ラベルを選択します。次に、分析粒子はハエを表現するすべての黒点の番号付きリストを作成するには[分析]タブの下に備えて選択します。
- 使用している場合、粒子を分析します。セットサイズ0.01〜0.1（ピクセル単位を選択しないでください）。真円度0.00から1.00;ショーアウトライン。結果を表示し、マネージャに追加します。
- 各黒点（各粒子が）元の画像に番号付きリストを比較することにより、元の画像であるハエの正確な表現であることを確認してください。
注：非常に接近しているいくつかのハエが一緒に一つの粒子としてカウントされている場合は、手動で二値画像上の2つのハエを分離するために白の線を引きます。
- EAから、CMで、距離を含む新しいリストを作成するプラグイン]タブにある第二のマクロオプションの下の一覧の距離マクロ - リストが選択されているが、最近傍を使用CH彼らの最近傍に飛びます。
- ImageJのから最近傍距離をコピーし、スプレッドシートプログラムの欄に貼り付けます。
- 同じスプレッドシート上に各繰り返しからのデータのすべてをコンパイルし、遺伝子型および条件によって整理。
- 統計ソフトウェアを用いてデータ解析を行います。この実験では、グラフパッドプリズム（MacOSXのためのバージョン6、グラフパッドソフトウェア、サンディエゴカリフォルニア州、www.graphpad.com）は、一方向ANOVAおよびクラスカル・ワリス検定、Tukeyのとダネットポストホックテストを実施するために使用されました。
- 距離の分布は、非パラメトリックな分布1に従う 、データをボックスとTukeyのウィスカー（外れ値を排除する）として表されます。
5.クライミングアッセイ（コントロール動作）
- 能力14,15,18を登るテストハエのコントロールとしてクライミングアッセイを使用してください。
- 向装置を使用するように、3つの試験のC並列に実行されます。
- 三つの異なる試験バイアル中の転送50〜100ナイーブハエ（前にテストされていないハエ）と、反対の場所で新鮮な空のバイアルで、向装置の下部にある1番目、3番目と最後のスロットにそれらをスナップ。
- 装置の下部にある空のスロットに新鮮な、空のバイアルを置きます。
- 実験を開始するために、すべてのハエを各チューブの底にあるように、装置を3回ダウンタップ。
- 15秒のタイマーを起動（トップバイアルに到達するために3-7日の古いカントン-Sの〜100％のための十分な時間を- 図3Fを参照してください ）。
- 一つのスロットによってトップバイアルを変位させるために、向流装置の上部をスライドさせます。
- 底バイアル内のすべてのハエをもたらすために、ダウン装置をタップしてハエを収集します。
- 1 番目と2 番目のチューブ（または3番目と4 番目 、5 番目 番目 ）までトップに達しなかったハエやトップバイアルに達したハエにそれぞれ対応します。
- パフォーマンス指数（PI）を計算します。
- 各バイアル中のハエの数をカウントします。
- PIはアッパーチューブに登ることができるハエの割合です。
- PIの手段は、正規分布1に従うと、データは平均値（SEM）の平均値プラスまたはマイナス標準誤差の列グラフとして表現されています。
注：また、PIは低いバイアルの上部に到達することができるハエの割合として計算することができます（古いハエのために、5秒は、感染と非能力を登るの違いを定量化するのに十分な時間が古い12日に感染しています静止画像から定量化カントン-S：結果を参照してください）。その他にも、能力19-22を登る定量化することが適切である驚愕誘発性の負の走地性、中性能の異なる尺度を使用してきました。
- 転送は、新しい空のバイアルに、そのバイアル含む食品から飛びます。吸引し、空のバイアルからハエや社会空間室にそれらを転送します。
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Representative Results
ソーシャルスペースチャンバは、 キイロショウジョウバエの社会的行動を定量化するためのツールとして使用することができます。アクリルスペーサーとガラス板は、多くの潜在的な交絡手がかりが存在せずに安定したグループを形成することができるハエた2次元エリアを提供する内側三角アリーナを形成するために一緒にクリップされます。ハエが垂直アリーナに転送されると、それらはタップダウンさせて驚いている、と彼らは逃避行動することによって応答：負の走地性を。彼らはタイトなグループに強制的に、直立三角形の頂点に登るし、各他を形成し、アリーナを探索するために、さらに移動する時間が設けられています。 20〜40分後に、それらは移動を停止し、安定したグループが形成されています。各フライとその最近傍との間の距離は、それらの好適な社会空間の定量化を提供するために、画像から測定することができます。ハエは近い彼らは彼らの隣人に、より社会的であると考えられています。
飛ぶこと密度は、下の容量の点までチャンバー内の社会空間での役割を果たしていません。大きな垂直方向室で20〜70ハエの大規模なグループでは、社会空間は、基密度（ 図2A、B）とは無関係です。社会空間室でのみ10または15ハエでは、社会空間の増加につながる可能性が最も高い安定した社会集団を形成するのに十分な個人が存在しない（ 図2A、B）。しかし、ハエの大量のテストは必ずしも便利ではありません - 変異個体数が限られている特定の状況において、研究者は社会空間室の標準サイズのために十分な大きさのハエのグループを収集できない場合があります。ハエの小グループを使用して、社会的空間を定量化促進するために、研究者は、二次元の競技場の面積が小さくなるように、ソーシャルスペースチャンバを操作することができるが、フライあたりの面積は一定のままです。社会的な2つのタイプは、D、図1Cに示されていますスペースチャンバは、小さいグループのために修正されたが、大きな室と同じ密度を維持します。このようにして、ハエの密度を維持し、チャンバーの大きさを低減する同様の社会的間隔（ 図2C）を得ることができます。
同じ全体的な傾向は、水平位置（ 図2D）に配置された社会空間室当てはまります。しかし、ハエは、このような水平設定でさらに離れてする傾向があることを観察することができ、彼らは簡単に1を解決しません。唯一の15と20ハエを持っているグループは40ハエ（2D igure F）を持つグループよりも大きな社会空間を示します。
その過密はハエの大きなグループに見られる最近傍に少ない距離の責任ではありませんでした確認するために、それぞれ他のすべてのハエに飛んでからの距離は9のように、測定しました。最も近い隣人への距離に対して、すべてのハエまでの距離を定量化、グループbehaviを評価することができますまたは、代わりにグループ内の個人の行動の。予想されたように、グループ内のハエの量が大きかったように、すべてのハエまでの距離は、グループ自体のではなく、個々のハエの反射を増加させました。この傾向は、垂直方向と水平方向の両方に配置社会空間室（ 図2E、F）について観察されました。そのため、より大きなグループからのハエは、スペースの制約のために彼らの隣人に近い距離を保つことを余儀なくされていませんでした。チャンバー内の15以上のハエがある場合にその代わりに、ハエがより厳しい社会的なグループを形成。
他の行動試験に関しては、垂直方向に社会空間室を使用して1つの制限は、ありません走地性や登山障害を持つハエを必要とすることです。例えば、カントン-Sは、 プロビデンシア23はクライミング欠陥を有し、社会的な間隔の向きに応じて異なるソーシャル間隔結果を示すrettgeriグラム陰性菌で一週間感染ハエ室。テストが垂直に実行された場合には、感染したハエの社会空間は、感染したハエは、チャンバ（ 図3A）の上部に安定グループを形成することができなかったせいか、コントロールの社会空間よりも大きかったです。同じ条件下でのハエは、次に水平方向の社会空間室で試験したとき、歩行能力が水平に配置社会空間チャンバー（ 図3B）における社会空間要因おそらく以下であることを示し、有意差はなかったです。感染したハエは、対照よりも視覚的にあまり登ることが可能であるが、これは、クライミングアッセイ（ 図3C）を用いて定量することができます。 5秒後に、対照ハエの約44％がトップ下バイアルの半分と感染ハエのわずか32％まで上昇しました。それはでき、このアッセイのすべてのハエは不十分（彼らはめったにトップバイアル、下バイアルの上部のみに到達しない）に登ることは注目に値します彼らはハエが22老化による登山の欠陥を示すことが起動したときであるポスト羽化、12日であるという事実によって説明します。
我々は以前に1を示しているようしかし、登山の欠陥を持っていない株について、室内の両方の向きは、同じ結果につながりました。この実験では、社会空間内の同じ増加が縦または横の三角形円形室（ - 1で公開されたデータの箱ひげで再分析図3D、E）に セシウム10カントン-Sに見られると1118ワットました。それは、チャンバの向き（ - 図3F 15秒の選択）のいずれかでの株の間の社会的空間での違いのための因子ではなかった示すセシウム10カントン-Sとし、1118ワットの能力を登るに差はなかったです。 CSと14％±3.3±5秒の選択17％を与えた場合1118 Csと10は、上部バイアルに達しWの 2.5（統計学的に異ならない、データは示さず）。
社会空間のチャンバーを用いて研究者はまた、彼らは一日の同じ時間に彼らの実験を繰り返して確認する必要があります。 Csの両方カントン-Sの1118ワット10男性は、社会的相互作用の影響を受け、一日の時間を飛びます。昼間時間（ - 光の発症後時間の時間 - Zeitgeber時間ZT7にZT4）と比較すると、夕方にテストしたハエは（ZT12へZT11は - 直前に消灯）の両方の遺伝子型のためにはるかに大きな社会空間を示したが、それらの相対的な空間の差が保存されていたものの- すなわち、1118ワットのCs 10ハエはまだカントン-Sは夕方（ 図4A）で飛行するよりも、社会的です。興味深いことに、唯一の社会カントン-S男性のスペースではなく、T夕方には女性のハエのための社会空間の大きな変化（ 図4B）に向かう傾向があったが、女性の帽子は、夕方に増加します。我々は以前独立して、同じ観測24を行いました 。
我々は以前にビスフェノールA（BPA）2の効果を研究するためにオレゴン-Rラインを使用して報告されているように、社会空間室もショウジョウバエの遺伝的背景に敏感です。ここでは、エルウッド、最近キャッチ野生型ラインは、カントン-Sとサマルカンドではなく、オレゴン（ 図5）に比べて社会的なスペースが増加したことを示しています。サマルカンドとオレゴンの社会空間は、互いに有意差はなかったが、カントン-Sの社会空間よりも、両方の大きい（ 図5）。これらのデータは、与えられた環境の中で、別の近交系と野生型株は、動作の遺伝的要素を示す、異なる社会的な空間を有することを示しています。それはまた、それ自体ことを示しこのテストのnsitivityは、このようにハエは前実験に適切な遺伝的背景に外部交配されている必要があります。これは違い、あるいは逆に社会空間で見られる類似点は、テストされている要因によるものであることを確認するために役立ちます。
図1。ソーシャルスペースチャンバコンポーネントおよび配置。 （A）は、様々な寸法の社会空間室16.5センチの高さ（直角三角形の形をしたアクリルスペーサー（17.6 0.3センチメートルによってCMで17.6センチ）と同じガラス板を用いて構成することができる8.9センチメートルのベース、 0.3センチ厚さ-小さな文字a）と長方形（0.3センチメートル1.5 CMで9センチメートルで示さ- 。小さな文字Bで示される）、（B）最大の社会空間室、1で説明したようにするのに適しています30-40ハエ。これは、内側のDIMを有し14.5センチメートル16.5 CMで16.5センチメートルのensions、86.45センチメートル2の面積を与え、そして40ハエのためにフライあたり2.16センチメートル2の領域につながる。（C）20ハエのためのチャンバーサイズ最適。それは43.25センチメートル2の面積を与え、その場あたり2.16センチメートル2の領域につながる5.96センチメートル14.5 CMで16.5センチメートルの内側の寸法を、持っています。（D）小さめ室、15ハエに最適な。それは32.45センチメートル2の面積を与え、その場あたり2.16センチメートル2の領域につながる8.9 CMで8.9センチメートル10.2センチ内寸を持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。室とグループサイズのオリエンテーションではなく、密度、社会空間に影響を与える。データはボックスで表現されています1 番目の四分位数（25 番目のパーセント ）を表すボックスと3 番目の四分位数（75 番目のパーセント ）、中央値を表すボックス内の行、およびTukeyのウィスカーと、チャンバ内の最も近い隣人への距離、のウィスカープロット（AB）の代表的なデータは、同じサイズのチャンバ内のハエの数を増やすと安定した社会空間測定値をもたらすことを示しています。 10〜70カントン-Sのグループ男性のハエは大きな縦社会空間室に入れ、30分間沈降させました。各ハエの最近傍までの距離を記録しました。 15未満のハエを有する基は大きなチャンバー内に20以上のハエを持つ群よりも有意に多くの社会的なスペースを持っていた。（A）10のn = 9、20 N = 9、30、N = 8のグループ、40、N = 8、クラスカル-Wallis 検定 p <0.0001、ダンの多重比較検定：各文字は、＃BはP <0.0001（B）グループは統計的に差を示します</ 15 N = 6、40 N = 8、50はn = 5、N = 6、70 N = 5、クラスカル・ワリス検定 p <0.0001、＃bはp <0.001の強い>グループ（C）ときチャンバのサイズは、フライ密度（大チャンバ内のそれぞれの媒体中で小さな15、20または40、フライあたり2.16 cm 2の密度で各時間を維持するように調整された垂直に試験した場合に、有意差は観察されない。（D ）しかし、これらの社会的なスペースチャンバは水平に配置された場合15または20ハエを持っていたグループは15のn = 3、20、N = 4、40 N = 4の（グループ、クラスカル40ハエを持つグループに比べて、最も近い隣人に長い距離を持っていました-Wallis 検定 p <0.0001、ダンの多重比較は、＃bはp <0.01）をテストする。（Eは-F）すべてのハエまでの距離が15のグループ20を測定したところ、40雄カントン-Sハエが上下両方に配置され、水平に向ける室。全ての距離も大きく、チャンバー内のハエの量が多いですハエ（（E）：15の群はn = 6、20 N = 6、40 N = 3、クラスカル・ワリス検定 p <0.0001、ダンの多重比較検定＃bはp <0.01;（F）：15 Nのグループ= 6、20 N = 6、40 N = 3、クラスカル・ワリス検定 p <0.0001、ダンの多重比較検定＃Bが＃cをP <0.0001）。注：（A、B、およびCF）3つの異なる地理的地域、したがって、異なる実験室の設定で、取得したデータを示し、（A）リージョン1：UCLA、ロサンゼルス、カリフォルニア州;（B）リージョン2：ニューヨーク大学、ニューヨーク、ニューヨーク。 （CF）リージョン3：西大学、ロンドン、ON この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.方向OFソーシャル空間室は走地性の問題を交絡を制御するために使用することができる（A - C）：のいずれかP.を感染させた40雄カントン-Sハエのグループ7日間rettgeriまたは対照としての媒体を注射が水平（A）または（B）が配置され、30分間静置した垂直のいずれかの社会的空間室に入れました。各ハエの最近傍までの距離を記録しました。データは、1 番目の四分位数（25 番目のパーセント ）を表すボックスと3 番目の四分位数（75 番目のパーセント ）、ボックス内の行で、チャンバー内の最も近い隣人への距離の箱ひげプロットで表現されています中央値を表す、とテューキーウィスカー。（A）の代表的なデータは、Pで感染しているハエのための社会的なスペースの増加を示しますrettgeriと垂直に配置ソーシャルスペースチャンバーに入れ、メディアの注射に比べて（ウィルコクソン順位検定：各文字はグループに統計的な差はp <0.0001を示し、N = 6）（B）は代表的なデータは、Pに影響されない社会空間を示しています。ハエは、水平に配置ソーシャルスペースチャンバ内に配置された場合rettgeri感染（ウィルコクソン順位検定：P> 0.1、n = 5）を（C）向装置は、感染および媒体の両方の制御ハエの登る動作を評価しました。 ; Welchの修正を持つ2つの両側t検定; N = 6 5秒の選択でバイアルの上半分にハエの％を：感染ハエは、グラフが平均性能指数±SEMを表し、〜12日齢ハエ（より不十分そのメディア・コントロールよりも登ります60ハエ〜の、それぞれの文字は、グループ統計的な差はp = 0.08）を示し、（D - F）：三角形や円形のいずれかの垂直方向と水平方向に配置室は、と）カントン-S（CSの社会空間を比較しましたその1118ワット Csを10（W）の。データは、1 番目の四分位数（25 番目のパーセント ）を表すボックスと3 番目の四分位数（75 番目のパーセント ）、ボックス内の行で、チャンバー内の最も近い隣人への距離の箱ひげプロットで表現されています中央値を表す、およびTukeyのウィスカー。社会空間室の向きや形状の両方で、Csの10 1118ワット カントン-Sよりも大きな社会的なスペースを持っていた（（D）、垂直三角形：クラスカル・ワリス検定、各文字統計学的に異なるグループを示す：クラスカル・ワリス検定、各文字は、グループが統計的に差はp <0.0001、（E）、水平円を示していますp <0.01）（F））向装置は、カントン-Sの両方の登る動作を評価するために使用し、1118ワットのCs 10株（3-5日齢ハエ、グラフは、平均性能指数±SEMを表す：トップバイアル内のハエの％を15秒の選択で）。カントン-Sのいずれかの間や Cs 10 1118ワットの能力には差がなかった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。男性の社会的なスペース夜の間に増加している。（A）の代表的なデータは、昼の時間（「日に比べて夜の時間（前のライトオフに"夜" ZT 11-12、）の間に男性のハエの間に増加した社会空間を示しています「ZT 4-7）。 セシウム10 40カントン-Sハエのと1118ワットのグループハエは、昼間時間や夕方の時間のいずれかの間に社会空間室に入れ、30分間沈降させました。各ハエの最近傍までの距離を記録しました。両方の遺伝子型の場合は、ハエは夕方に社会空間を増加し、系統間の差は関係なく、一日の時間の保持（N = 6-7た、クラスカル・ワリス検定p <0.0001、ダンの多重比較検定：各文字は、グループ統計的に異なるPを示します<大きな内部変動に対する非有意な傾向は女性に見られるが、0.01）。（B）カントン-Sハエが性別男性のみによって分離したクラスカル（、夕方（TのP <0.01）における社会空間の増加を示しています-Wallisテスト、各文字は、グループ統計的な差はp <0.0002）を示しています。データは、1 番目の四分位数（25 番目のパーセント ）を表すボックスと3で、チャンバー内の最も近い隣人への距離の箱ひげプロットで表現されています番目の四分位数（75 番目のパーセント ）、中央値を表すボックス内の行、およびTukeyのウィスカー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5。ハエの遺伝的背景は、社会空間に影響を与えます。40カントン-S、サマルカンドのグループ、オレゴン州、およびエルウッドハエは、社会空間室に入れ、30分間沈降させた。各フライの最近傍までの距離を記録しました。グループの分布が異なる（クラスカル・ワリス検定は p <0.0001）、共通の文字を共有していないグループは、有意に異なります。データは、箱ひげPで表されます1 番目の四分位数（25 番目のパーセント ）を表すボックスと3 番目の四分位数（75 番目のパーセント ）、中央値を表すボックス内の行、およびTukeyのウィスカーと、チャンバ内の最も近い隣人への距離、多くの（ダネット多重比較検定、p <0.05の[D]、p <0.001 [A、B、C]、その結果1-2内部反復を有する3つの独立した反復、エルウッドとサマルカンドN = 3、オレゴン州カントン及びS-N = 4 ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、社会的な空間の定量化のための詳細な手順を説明しました。実験が成功であることを確認するために、いくつかの重要な手順は次のとおりです。装置のクリーニングおよび設定するとき1）常に2）少なくとも一日前にハエが収集されていることを確認し、装置の内部チャンバから独自のオイルと香りを保つために、手袋を使用しますこれらの2時間の間に実験はハエを確保するために生鮮食品を含む新しいバイアルを提供する前に、3）2時間を冷たい麻酔の任意の潜在的な影響を低減するための実験に飢えていない、と自分自身を掃除している、4）、ハエが彼らに順応させます実験を行うときに、新しい環境、5）は、温度と湿度の条件を注意してください。 6）実験の実行中に社会空間室を乱さないようにしてください、そして7）日の同じ時間に実験を行う、好ましくZeitgeber時間ZT4の間、24〜25°Cおよび50％の湿度の間で一貫性を保つためにしてみてくださいそして、ZGT7。
社会空間は限りサイズを満たし、最小限のグループがあるとして、唯一の室内のハエの密度に依存し、グループのサイズに依存しません。ハエに関係なく、グループのメンバーの量のそれらの間で同じ社会的間隔を維持します。しかし、チャンバー内のすべてのハエまでの距離は、予想されたように、グループサイズだけでなく、室内の向きによって影響されます。それは、（ 図3Dは3Eとの比較）バーグら （ハエは同じように簡単に沈降しない）水平方向にもかかわらず使用することが困難なということに留意することが重要であり、私たちの手の中に遺伝子型の間分離が低減につながる。3が正常に水平を使用しました、正方形室。彼らの実験では、最も近い隣人への距離は、私たちの垂直に配向された社会空間の結果に最も類似していました。しかし、彼らのチャンバー内に、ハエの社会グループの間隔は、当社の垂直室の代わりに、私たちの横室に最も類似であることに寄与していた可能性が連続気流がありました。垂直室を使用することに制限はMOBILIを持つショウジョウバエをテストする能力でありますTY障害。社会空間室は、モバイルようにハエを必要とするので、彼らは、彼らがなりたい自分の隣人から何距離で選ぶことができます。ハエが不動であったか、何らかの方法で障害を持っていた場合、それらは、チャンバ内に適切に安定な基を形成することができないかもしれません。貧しい運動のための潜在的な救済策は、水平室を使用したり、ハエは写真を撮る前に解決するために多くの時間を可能にすることであろう。研究者はまた、縦社会空間室が適切であるかどうかを確認するために登る能力やハエの可能走地性の障害を評価する必要があります。これらのいずれかの欠損がある場合は、水平方向に位置するチャンバは、それらを避けるために使用することができます。
注目すべきは、その場の活性または全体的な体力と健康は社会空間の測定に影響を与える登る場合、我々は、活動や運動レベルは社会空間と相関していないことを示しています。別の研究では、運動を低下させる処理、（BPAを供給）も、社会的に減少することを示しますスペース2。しかし、 しわの変異体（自閉症の候補遺伝子neurobeachinのショウジョウバエオルソログ）表示機能亢進と増加した社会空間4。最後に、 白い変異ハエが運動や走地性18の増加なしに、社会空間1,3の増加が表示されます。要するに、活動レベルと社会間隔のいくつかの組み合わせは、2つの動作の間には相関関係がないことを示す、これまでに観察されています。実際には、社会空間は、必ずしも別の根底にある神経回路を示唆し、そのような社会的な回避8,25として、いずれかの他の社会的行動に相関しません。例えば、 しわ/ neurobeachinディスプレイの変異体は、社会空間を増加させ、社会的回避4を削減しました。しかし、 白は社会空間を増加し、非常に強力な社会的回避4ました両方。
一日の時間は、少なくとも男性で、社会空間に影響を与えるとして、それはcriticaです研究者は彼らの実験が行われ、努力が全ての実験のために一定の時間を維持するために行われる時刻を認識していることL。考慮されるべきである他の考慮事項は、年齢、性別、およびハエの嵌合状態を含みます。私たちは、社会的距離は両方の男性と女性の1の両方のため、交配個体と比較して処女で増加していることを知っている、と我々は今、男性は夕方（ 図4B）で女性より少ない近接していることを示しています。日中は株単一ハエの活動レベルでの具体的な性差は、以前の日の時間に比べて、朝と夕方に男性より高い自発運動が彼らの求愛行動26,27に関連しているかもしれないことを提案し、記載されています。しかし、我々の場合には、男女が分離されているが、ハエがグループ化され、我々は彼らの社会空間を測定する時間によって、ハエが落ち着いてきました。男性のペアで概日リズムを維持することを藤井ら 27レポート女性のペアのリズムは、単一のハエのことに似ているときに一緒に、明瞭なピークなしに、不安定な日常のリズムを持っています。だから、夕方には男性で増加した間隔は、おそらく求愛行動の増加または運動活性の特定の増加に関連していないと、この動作の性的二型の根底にある理由は、さらに調査する必要があります。
男性と女性の間の社会的相互作用の違いを見ることができるように考慮してこれにより、ハエは常に実験のためのセックスで区切る必要があります。最後に、我々は現在、年齢がハエの社会的相互作用にどのように影響するかはまだわかりません。したがって、我々は社会的宇宙実験が22以上1週齢のハエに影響を受けることが知られている登山活動を含む様々な行動公演として、7日を超えない古いハエを用いて実施することをお勧めします。
社会空間のための最終的な考慮事項は、中央値で観察された変動であります社会的距離。 図2B、図3D、図4、図5、ロンドン、ON： 図2C-F、ニューヨーク州イサカ： 図;新ニューヨーク、NY 図2A：社会空間の測定は、（ロサンゼルス、カリフォルニア州など、さまざまな場所から採取しました図3A、B;すべて同じカントン-Sバックグラウンドで）。地理的な位置、または実験室の設定の間で一定ではなかった未知の変数は、中央値の社会的距離に影響を与えました。可能性のある要因は、さまざまな食品、標高、それ自体は、大気圧、大気圧28の変化が含まれます。中央値では、ロケーション間の一定ではなかったが、場所内の中央値は非常に一定で再現可能です。そして、社会空間の測定で見られる傾向とパターンは、場所の間で同じでした。したがって、限り、研究者が内部で一定の条件を維持するように、彼らは次のようになります社会空間の違いを検出するために、BLE。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Nikon | SMZ-645 | Any other standard scope for fly handling would work |
| Small paint brushes | for pushing flies | ||
| Jazz-mix | Fisher | 33545 | any other standard drosophila food would work |
| Mini-Alarm Timer/Stopwatch | |||
| Sharpie pens | |||
| Adhesive Tape | |||
| Medium size binder clips | Staples | to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity | |
| small SupportStands | Carolina | 707161 | to hold the chambers in a vertical orientation |
| Buret clamps | Carolina | 707362 | |
| Digital Camera | Nikon | Coolpix S8000 | to take the still pictures |
| small ruler | to be able to scale the picture | ||
| trifold board and white bench cover | to provide a white background, and a homogeneous light. | ||
| pounding pad | any mouse pad works. | ||
| Prism 6 | GraphPad Software Inc. | Prism 6 for Mac OS X | Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work |
References
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