We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
Neurala stamceller (NSCs) i subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna (SVZ) upprätthålla luktneurogenes hela livet i däggdjurshjärnan. De genererar successivt transitförstärkande celler (TAC) och neuroblaster som differentierar till neuroner när de integrera lukt glödlampor. Emerging fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) tekniker har möjliggjort isolering av NSCs samt deras avkomma och har börjat att belysa genreglerande nätverk hos vuxna neurogena nischer. Vi rapporterar här ett cellsortering teknik som gör det möjligt att följa och särskilja cellcykel dynamik ovannämnda cellpopulationer från vuxen SVZ med lex / EGFR / CD24 trippel färgning. Isolerade celler stryks sedan ut som vidhäftande celler att utforska i detaljer deras cellcykelprogressionen av tidsförlopp video mikroskopi. För detta ändamål använder vi transgena Fluorescence ubikitinering Cell Cycle Indicator (Fucci) möss i vilka celler är röda fluorescerande During G 1 fas på grund av en G 1 specifik röd-Cdt1 reporter. Denna metod har nyligen avslöjat att prolifererande NSCs successivt förlänga sin G 1 fas under åldrande, vilket leder till nybildning av nervceller nedskrivningar. Denna metod är lätt överföras till andra system och skulle kunna vara av stort intresse för studium av cellcykel dynamik hjärnceller i samband med hjärn patologier.
Vilande neurala stamceller (NSCs) är källan för vuxna neurogenes 1 och kan omvandlas till deras proliferativa "aktiverade" formen som uttrycker EGFR (aNSCs) 2. När den är aktiverad, de ger upphov till transit förstärka celler (TAC) 3 och sedan neuroblaster som migrerar till lukt glödlampor (OB) genom ett rör av astrocyter och slutligen differentieras till neuroner 4,5. NSCs och deras avkomma är organiserade i specialiserade "nischer" arkitekturer längs de laterala ventriklarna, blandar en myriad av faktorer som styr deras proliferation 6. Isoleringen och reningen av SVZ neurogena celler är nödvändig för att belysa den komplexa molekylära regleringen av deras spridning, men har förblivit en utmaning för en lång tid på grund av bristen på specifika markörer och anpassade tekniker.
Nya metoder använder flödescytometri har gjort det möjligt att isoleringen av NSCs och their avkomma från den vuxna SVZ 2,7-11. Använda stamcellsmarkören LeX 12 tillsammans med neuroblast markör CD24 13 och en fluorescens EGF att märka EGFR på celler som förökar 2, nyligen utvecklade vi en FACS strategi som möjliggör rening av fem av de viktigaste SVZ neurogena populationer: vilande och aktiverade NSCs, TAC, omogna samt flyttande neuroblaster 9. Här beskriver vi i detalj denna cellsortering teknik och hur lex / EGFR / CD24 triple färgning tillåts för första gången isolering av både vilande och aktiverade NSCs.
Även om neurogenes kvarstår i vuxen ålder, är produktionen av nya nervceller drastiskt minskat i den åldrande hjärnan 14. De flesta studier är överens om en gradvis minskning av antalet förökande stamceller i SGZ och SVZ 15-20. Konsekvenserna är inte oskyldigt som den åldersrelaterade nedgången i neurogenes i SVZ framkallar en minskning av newborn neuroner i luktsinnet lökar av den åldrade hjärnan, vilket slutligen leder till försämring av lukt diskriminering i åldrade möss 18. Belysa cellcykelkinetiken av neurala stamceller är ett viktigt steg för att förstå mekanismerna bakom utvecklingen av vuxna neurogenes under åldrandet. Nyligen genomförda studier har undersökt cellcykeln och härstamning progression av vuxna neurala stamceller in vitro 21 och in vivo 22 men ingen av dem utnyttjade cellsorteringstekniker och genetiskt kodade fluorescerande cellcykel prober för att visualisera cellcykelfaser av isolerade celler vid en enda-cellnivån.
Här beskriver vi ett protokoll som tar fördel av de transgena Fucci möss i vilka celler är fluorescerande under sin cellcykel, vilket gör att skillnaden mellan G 1 och SG 2 / M faser 23. Detta protokoll visar hur blivande isolering av NSCs och deras avkomma från vuxna Fucci mice kombinerad med tidsförlopp videomikroskopi tillåter studiet av cellcykeln dynamiken vid en enkelcellnivån.
Den cellsortering teknik som beskrivs häri möjliggör tillförlitlig diskriminering mellan vilande NSCs, aktiverade NSCs och deras avkomma som möjliggör studier av deras egenskaper och dynamik i den vuxna hjärnan 9. Tillsammans med Fucci teknik som medger visualisering av cellcykelprogression i levande celler 23, utvecklade vi en snabb och effektiv teknik för att följa G 1 och SG 2 / M-faserna av cellcykeln från unga vuxna och åldrade mus hjärnceller.
Den cellsortering teknik som används i detta protokoll var den första validerade kombination av markörer som möjliggör rening av de fem viktigaste neurogena populationer från SVZ 9. Det var också den första validerade tekniken möjliggör skillnaden av vilande och aktiverade NSCs. Det är anmärkningsvärt att denna teknik inte kräver användning av transgena möss i sig, vilket är nödvändigt efter anpassning till transgena musmodeller SUlm som Fucci. Sedan dess har Codega et al., 10 används en GFAP-GFP / CD133 / EGFR-trippelmärknings kombination för att särskilja vilande NSCs från deras aktiverade motsvarighet men det kan inte anpassas till Fucci teknik eftersom den kräver användning av GFAP-GFP transgena möss. Mich et al. 11 har utvecklat en GLAST / EGFR / CD24 trippel strategi märkning som delar gemensamma resultat med den teknik som används i denna studie 9. I själva verket, en hög korrelation mellan Lex och GLAST NSCs markörer redan observerats i Daynac et al. Studie 9. Emellertid är GLAST antikropp som används i Mich et al., Teknik kopplad till fykoerytrin och således inte kan anpassas med användning av Fucci-Red-möss.
Det finns flera viktiga tekniska frågor som kräver uppmärksamhet innan sortering SVZ celler. För det första är dissociationssteget mycket viktig eftersom hjärnvävnaden måste dissocieras till enstaka celler och samtidigt bevara den strukturella iintegritet av proteiner som används för strategin märkningsantikroppen. 0,05% trypsin-EDTA har visat sig vara mycket effektivt för att dissociera SVZ vävnad 27 men lex-antigenet visade sig vara mycket känsliga eftersom nästan all LeX-FITC-immunfluorescens var förlorad (data ej visade). Således var papain användes som det var mer effektivt och mindre destruktiva än andra proteaser på hjärnvävnad. Dessutom har varken LeX eller EGFR eller CD24 påverkas av papain behandling. Det bör noteras att märkningen antikroppen ändras om papain behandling översteg 15 minuter. Vi fick optimala resultat med en 10 min papain behandling i samband med en mekanisk dissociation (pipett upp och ner 20 gånger).
Poly-D-Lysin beläggning medger odling av vidhäftande celler och bildning av kolonier efter flera dagar i odling. Det är nu allmänt accepterat att in vitro-analyser kommer med sina begränsningar 28,29. Vi rekommenderar att bestämma endast den första cellcykeln förde celler som genomgår åtminstone en efterföljande division bo så nära som möjligt in vivo cellfenotypen.
Det är anmärkningsvärt att nämna att Geminin (grön fluorescens) och Cdt1 (röd fluorescens) proteiner som används för att utforma Fucci systemet 23 tidigare visat sig vara rikligt uttrycks av neurala stamceller under tidig neurogenes hos möss 30 och vuxna hjärnan vävnader 9,25 . Även om mKO2-hCdt1 (30/120) konstruktionen har huvudsakligen använts i denna studie att följa G1 fasen med röd fluorescens, användning av båda konstruktionerna [mKO2-hCdt1 (30/120) och MAG-hGem (1/110) ] skulle kunna förutses för att tillåta visualisering av huvudfaserna i cellcykeln (G 1 och SG 2 / M) såväl som G 1 / S övergång 23. Den huvudsakliga nackdelen med tvåfärgad avbildning är de begränsade kompatibla uppsättningar av fluorescens som fortfarande kan användas för cellmärkning. En lösning är att använda separatipå kolonner. Till exempel har vi framgångsrikt utarmat CD24-positiva fraktion från celler med hjälp av separationskolonner innan cellsortering och live-avbildning som vi använde en CD24-PE-antikropp som delade samma emissions våglängd än Fucci-röda fluorescens 25.
Få studier har undersökt cellcykelns längd av vuxna mus SVZ populationer. Den totala cellcykelns längd erhålles med vår teknik är nära till ett uppskattat in vitro av al. Costa et 21, men vi kunde för första gången för att skilja de olika cellcykelfaser. I en in vivo-studie, al. Ponti et 22 används inkorporering av tymidinanaloger att bestämma proliferations dynamiken i de olika SVZ cellpopulationer. Men de kunde inte utföra en kontinuerlig övervakning av cellcykeln eller spåra celler vid encelliga nivå. Detta kan vara ett problem, eftersom det visade sig att en stark heterogenitet finns within en given SVZ cellpopulation 22,25. Vi beskriver här ett alternativ in vitro teknik, enkel att installera, som gör den levande avbildning av cellcykelfaserna av olika vuxna neurogen populationer på en encelliga nivå.
Förstå regleringen av cellcykeln av neurala stamceller och stamceller fortfarande en utmaning för utvecklingen av nya behandlingsmetoder i samband med åldrande eller hjärn patologier. Vår protokoll kan således ha ett brett spektrum av applikationer. I samband med åldrande, kan denna teknik även vara användbar för att förstå effekterna av åldrande på NSCs differentiering. I själva verket är det möjligt att identifiera neurala stam / progenitorceller in differentiering som deras röda fluorescensintensitet är tydligt högre 26. Slutligen kan det också vara av intresse att utnyttja den kontinuerliga levande avbildning på en enda cellnivå för att studera cellens inre och yttre processer som ansvarar för härstamning prosion av vuxna NSCs.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i tacksamhetsskuld till C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet och all personal av djuranläggningar; till J Baijer och N Dechamps för cellsortering; O. Etienne för tekniskt stöd, och A. Gouret för hennes administrativt stöd. Flödescytometri och cellsortering genomfördes vid iRCM Flow Cytometry delad resurs, som inrättades genom bidrag utrustning från DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC, och CEA. Detta arbete har finansierats med bidrag från Electricité de France (EDF). MD har ett stipendium från La Ligue Contre le Cancer och LM från Région Ile-de-France (DIM Biothérapies). Marc-André Mouthon och François D. Boussin aktie co-ledande författarskap.
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |