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Neuroscience

सेल वयस्क माउस subventricular क्षेत्र से तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की छंटनी और उनके सेल चक्र गतिशीलता का लाइव-इमेजिंग

Published: September 14, 2015 doi: 10.3791/53247
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 5, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1CEA DSV iRCM SCSR, Laboratoire de Radiopathologie, UMR 967, 2INSERM, UMR 967, 3Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, UMR 967, 4Université Paris Sud, UMR 967, 5CNRS, Université Paris Sud, UMR 9197, Neuroscience Paris-Saclay Institute, Molecules Circuits Department
* These authors contributed equally

Abstract

पार्श्व निलय की subventricular क्षेत्र में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) (SVZ) स्तनधारी दिमाग में जीवन भर घ्राण न्यूरोजेनेसिस बनाए। वे क्रमिक वे घ्राण बल्ब एकीकृत एक बार न्यूरॉन्स में अंतर यह है कि पारगमन amplifying कोशिकाओं (दूसस) और neuroblasts उत्पन्न करते हैं। उभरते फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल (FACS) तकनीक एनएससी के अलगाव के रूप में भी उनकी संतान की अनुमति दी है छंटनी और वयस्क तंत्रिकाजन्य आलों में जीन विनियामक नेटवर्क पर प्रकाश डाला करने के लिए शुरू कर दिया है। हम यहाँ का पालन करें और एक लेक्स / EGFR / CD24 ट्रिपल धुंधला के साथ वयस्क SVZ से उपर्युक्त सेल आबादी के सेल चक्र गतिशीलता भेद करने के लिए अनुमति देता है कि एक सेल छँटाई तकनीक की रिपोर्ट। अलग कक्षों तो समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने सेल चक्र प्रगति विवरण में पता लगाने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया जाता है। यह अंत करने के लिए, हम कोशिकाओं ड्यूरिन लाल फ्लोरोसेंट रहे हैं, जिसमें ट्रांसजेनिक प्रतिदीप्ति Ubiquitination कोशिका चक्र संकेतक (FUCCI) चूहों का उपयोगजी जी जी एक विशिष्ट लाल Cdt1 संवाददाता के कारण 1 चरण। इस विधि को हाल ही में proliferating एनएससी उत्तरोत्तर न्यूरोजेनेसिस हानि के लिए अग्रणी, उम्र बढ़ने के दौरान उनके जी 1 चरण को लंबा है कि पता चला है। इस विधि के अन्य प्रणालियों के लिए आसानी से transposable है और मस्तिष्क विकृतियों के संदर्भ में मस्तिष्क कोशिकाओं के कोशिका चक्र की गतिशीलता के अध्ययन के लिए महान ब्याज की हो सकती है।

Introduction

मौन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) वयस्क न्यूरोजेनेसिस 1 के लिए स्रोत रहे हैं और उनके proliferative में परिवर्तित कर सकते हैं EGFR (aNSCs) व्यक्त प्रपत्र 2 "सक्रिय"। एक बार सक्रिय, वे astrocytes की एक ट्यूब के माध्यम से घ्राण बल्ब (ओ) की ओर पलायन और अंत में न्यूरॉन्स 4,5 में अंतर तो है कि पारगमन amplifying कोशिकाओं (दूसस) 3 और neuroblasts को जन्म दे। एनएससी और उनके वंशज अपने प्रसार 6 कारकों को नियंत्रित करने के असंख्य फंसाने, पार्श्व निलय साथ विशेष "आलों" आर्किटेक्चर में आयोजित कर रहे हैं। SVZ तंत्रिकाजन्य कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि उनके प्रसार के जटिल आणविक विनियमन रोशन करने के लिए आवश्यक है, लेकिन कारण विशिष्ट मार्करों और अनुकूलित तकनीक की कमी के लिए एक लंबे समय के लिए एक चुनौती बनी हुई हैं।

प्रवाह का उपयोग कर नए तरीकों cytometry एनएससी और उनके व्यापार के अलगाव संभव प्रदान की गई हैवयस्क SVZ 2,7-11 से आर संतान। , मौन और सक्रिय एनएससी, दूसस: कोशिकाओं 2 proliferating पर EGFR लेबल करने के लिए neuroblast मार्कर CD24 13 और एक प्रतिदीप्ति EGF के साथ स्टेम सेल मार्कर लेक्स 12 का उपयोग करना, हम हाल ही में मुख्य SVZ तंत्रिकाजन्य आबादी में से पांच की शुद्धि के लिए अनुमति देता है एक FACS रणनीति विकसित अपरिपक्व है और साथ ही पलायन neuroblasts 9। यहाँ, हम विवरण में इस तकनीक सेल छँटाई और कैसे का वर्णन पहली बार के लिए अनुमति एक लेक्स / EGFR / CD24 ट्रिपल धुंधला मौन और सक्रिय एनएससी दोनों के अलगाव की।

न्यूरोजेनेसिस वयस्कता के दौरान बनी रहती है, नए न्यूरॉन्स का उत्पादन तेजी से उम्र बढ़ने मस्तिष्क 14 में कमी आई है। अधिकांश अध्ययन SGZ और SVZ 15-20 में पूर्वज कोशिकाओं proliferating की संख्या में एक प्रगतिशील कमी पर सहमत हैं। SVZ में न्यूरोजेनेसिस में उम्र से संबंधित गिरावट n का एक कमी भड़काती के रूप में परिणामों अहानिकर नहीं हैंवृद्ध व्यक्ति के मस्तिष्क की घ्राण बल्ब में ewborn न्यूरॉन्स, अंततः आयु वर्ग के चूहों 18 में घ्राण भेदभाव में हानि के लिए अग्रणी। तंत्रिका progenitors के सेल चक्र कैनेटीक्स elucidating उम्र बढ़ने के दौरान वयस्क न्यूरोजेनेसिस के विकास अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हाल के अध्ययनों से इन विट्रो 21 और इन विवो 22 में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के कोशिका चक्र और वंश प्रगति की जांच की है, लेकिन उनमें से कोई भी अलग कक्षों की सेल-चक्र के चरणों कल्पना करने के लिए सेल छँटाई तकनीक और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सेल चक्र जांच का फायदा उठाया एक एकल कोशिका के स्तर पर।

यहाँ हम जी 1 और एसजी 2 / एम चरणों 23 के बीच भेद की इजाजत दी, कोशिकाओं को उनके सेल चक्र के दौरान फ्लोरोसेंट रहे हैं, जिसमें ट्रांसजेनिक FUCCI चूहों का लाभ लेता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल वयस्क FUCCI मील से एनएससी और उनकी संतान की कैसे संभावित अलगाव से पता चलता हैसमय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त सीई एक एकल कोशिका के स्तर पर सेल चक्र की गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल 24 नवंबर के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के अनुपालन में बनाया गया है, 1986 (86/609 / ईईसी) और हमारे पशु कल्याण संस्थागत समिति (CETEA-सीईए DSV आईडीएफ) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

संस्कृति और videomicroscopy करने के लिए 1. बेसिक सेटअप प्रायर

  1. कोंफोकल वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए गिलास नीचे संस्कृति प्लेटों या μ-प्लेट का उपयोग करें। 1 के लिए - अच्छी तरह / 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं, / अच्छी तरह से अधिक से अधिक 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें और 24 अच्छी तरह प्लेटें का उपयोग करें।
  2. कम से कम एक दिन पहले प्रयोग शुरू करने से, पक्षपाती monolayer संस्कृतियों के लिए बाँझ पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) लेपित प्लेटें तैयार करते हैं। अच्छी तरह से कोट करने के लिए प्रत्येक के नीचे पर्याप्त पीडीएल (dH2O में 10 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। पीडीएल समाधान निकालें और प्लेट एक लामिना का प्रवाह के तहत कम से कम 2 घंटे के दौरान हुड में सूखे की अनुमति देने से पहले DH 2 हे के साथ तीन बार कुल्ला। तुरंत इस्तेमाल नहीं करते हैं, तो कम से लेपित थाली स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस।
  3. एक 9 पर एनएससी बेसल मध्यम और एनएससी प्रसार अनुपूरक के मिश्रण से संस्कृति के माध्यम तैयार: 1 के अनुपात 2 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 20 एनजी / एमएल शुद्ध पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक (EGF), और 10 एनजी / एमएल के साथ (सामग्री तालिका देखें) मानव पुनः संयोजक fibroblast वृद्धि कारक 2 (FGF -2)। उपयोग करने से पहले एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति के माध्यम से गर्म।
  4. SVZ हदबंदी के लिए, papain समाधान तैयार: 1 मिलीग्राम / एमएल papain 0.2 मिलीग्राम / एमएल एल सिस्टीन, 0.2 मिलीग्राम / एमएल EDTA, और 0.01 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं युक्त अर्ल बैलेंस नमक समाधान (EBSS) में (15 यूआई / एमएल) पीबीएस में। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान जीवाणुरहित। उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान संतुलित करना।
  5. DMEM: F12 मध्यम 0.7 मिलीग्राम / एमएल trypsin अवरोध प्रकार द्वितीय युक्त enzymatic प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, एक protease अवरोध समाधान (Ovomucoid) तैयार करते हैं। 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर।
  6. दिमाग और पीबीएस 0.15% बीएसए एस इकट्ठा करने के लिए ग्लूकोज समाधान पीबीएस 0.6% तैयारधोने कदम के लिए और एंटीबॉडी धुंधला के लिए olution।
  7. विदारक और, छुरी संदंश बांधने, कैंची: विच्छेदन उपकरण तैयार करें। 70% इथेनॉल में भिगोएँ।

2. फसल काटने वाले वयस्क माउस के दिमाग और SVZ Microdissections

  1. उचित संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के प्रदर्शन के बलिदान वयस्क FUCCI चूहों 23 (2-3 महीने की उम्र में और / या उम्र बढ़ने अध्ययन के लिए 12 महीने की उम्र में)।
  2. 70% इथेनॉल का उपयोग माउस स्प्रे और तेज कैंची का उपयोग सिर काट दिया।
  3. खोपड़ी को प्रकट करने के लिए खोपड़ी के साथ एक चीरा बनाओ।
  4. कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग घ्राण बल्ब की ओर खोपड़ी के आधार पर शुरू होने वाले एक अनुदैर्ध्य midline कटौती प्रदर्शन करते हैं। कैंची ब्लेड के साथ अंतर्निहित मस्तिष्क को क्षति से बचाने के लिए सुनिश्चित करें। मस्तिष्क को बेनकाब करने के घुमावदार संदंश के साथ खोपड़ी का ऊपरी हिस्सा खुला निकालें।
  5. पीबीएस में 0.6% ग्लूकोज युक्त एक 15 मिमी पेट्री डिश में मस्तिष्क लीजिए।
  6. डीघ्राण बल्ब दूर issect। अपने पृष्ठीय सतह पर मस्तिष्क की जगह और एक छुरी का उपयोग कर ऑप्टिक chiasm के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग बनाते हैं।
  7. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, प्रयोगकर्ता की ओर ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ कटौती राज्याभिषेक की सतह के साथ मस्तिष्क खंड के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा स्थिति।
  8. , SVZ काटना ठीक एक घुमावदार संदंश के साथ पट निकालने के लिए तो वेंट्रिकल को तुरंत आसन्न स्ट्रिएटम में एक ठीक संदंश की एक टिप डालने और आसपास के ऊतकों से SVZ अलग। अतिरिक्त जानकारी के लिए, Azari एट अल। 24 को देखें। पीबीएस 0.6% ग्लूकोज के 1 मिलीलीटर युक्त एक पेट्री डिश में विच्छेदित SVZ रखें।

3. SVZ ऊतक हदबंदी

  1. कोई बड़े टुकड़े रहने तक पेट्री डिश में विच्छेदित SVZ कीमा।
  2. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज को पीबीएस 0.6% ग्लूकोज के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण।
  3. (1 सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूर्व गर्म papain के 1 मिलीलीटर जोड़ेंमिलीग्राम / एमएल, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नहाने के पानी में 10 मिनट के लिए 0.01 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं सेते के साथ पूरक) 1.4 चरण में तैयार किया। माउस प्रति papain के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
  4. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. के 1 मिलीलीटर जोड़ें ovomucoid पूर्व गर्म (0.7 मिलीग्राम / एमएल, 1.5 चरण में तैयार) papain गतिविधि को रोकने के लिए। यंत्रवत् धीरे एक P1000 micropipette टिप के माध्यम से नीचे 20 बार Pipetting और एक एकल कोशिका निलंबन में आगे कीमा बनाया हुआ ऊतक अलग कर देना। हवा के बुलबुले से बचें।
  6. एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक बाँझ 20 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं। कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए पीबीएस 0.15% BSA के साथ सेल फिल्टर धोने के लिए सुनिश्चित करें।
  7. 10 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 0.15% BSA युक्त पीबीएस के 100 μl में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।

सेल छँटाई के लिए 4. Immunofluorescent धुंधला

सेल के लिए FUCCI लाल चूहों (2A चित्रा), निम्नलिखित का उपयोग का उपयोग कर छँटाईएंटीबॉडी: CD24 phycoerythrin-cyanine7 संयुग्म [PC7]; CD15 / लेक्स fluorescein आइसोथियोसाइनेट [FITC] संयुग्मित और Ax647 संयुग्मित EGF ligand।

नोट: लेक्स + EGFR + कोशिकाओं और EGFR + कोशिकाओं वयस्क SVZ में प्रचुर मात्रा में नहीं हैं: ≈ 600 और 1500 कोशिकाओं / माउस क्रमशः 9। हम पर्याप्त सामग्री है करने के लिए 2 से 3 चूहों से SVZ कोशिकाओं पूलिंग सलाह देते हैं। सेल छँटाई अवधि 3 घंटा से अधिक नहीं है तो यह है कि एक ही दिन में 12 से अधिक चूहों के साथ काम नहीं करते। एक ही दिन में भी कई चूहों के साथ काम कर रहे एक बढ़ सेल छँटाई अवधि संभवतः वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु और / या सेल भेदभाव, जिसके परिणामस्वरूप करने के लिए नेतृत्व करेंगे कि मन में रखो।

  1. माउस प्रति (या इष्टतम धुंधला के लिए 2 चूहों से 3 के एक समूह के लिए 200 μl में) पीबीएस 0.15% BSA के 100 μl में FACS धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
  2. नियंत्रण ट्यूबों तैयार। निर्माता के अनुसार एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों तैयार करने के लिए मुआवजा मोती का उपयोग करें9; प्रोटोकॉल। कोशिकाओं का एक अंश (एक माउस के लिए पर्याप्त है से निकाली गई कोशिकाओं के 1/10) का चयन करें और एक नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब (अगोचर कोशिकाओं) और 3 प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) नियंत्रण ट्यूबों तैयार करने के लिए 4 ट्यूबों में यह अलग। ट्यूब प्रति पीबीएस 0.15% BSA के 200 μl में कोशिकाओं Resuspend।
    सुझाव: लेक्स-FITC एफएमओ नियंत्रण के लिए, CD24-PC7 (1:50) और Ax647 संयुग्मित EGF ligand के साथ कोशिकाओं (1: 200) लेबल; और Ax647 संयुग्मित EGF ligand एफएमओ नियंत्रण के लिए CD15 / LeX- साथ कोशिकाओं लेबल: CD24-PC7 एफएमओ नियंत्रण के लिए, CD15 / लेक्स-FITC (1:50) और Ax647 संयुग्मित EGF ligand (200 1) के साथ कोशिकाओं लेबल FITC (1:50) और CD24-PC7 (1:50)।
  3. सेल छँटाई के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबों के लिए, पीबीएस में संकेत कमजोर पड़ने पर 0.15% बीएसए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग करें: CD24-PC7 (1:50), CD15 / लेक्स-FITC (1:50) और Ax647 संयुग्मित EGF ligand (1: 200)।
  4. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। 10 मिनट के लिए 200 XG पर 1 मिलीलीटर पीबीएस 0.15% BSA और सेंट्रीफ्यूज के साथ धोएं। 200 में कोशिकाओं Resuspend81, मस्तिष्क प्रति पीबीएस 0.15% BSA के एल। बर्फ पर सेल छँटाई ट्यूबों रखें और सेल छँटाई करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  5. FUCCI-ग्रीन चूहों का उपयोग करते हैं, तो सेल लेक्स-FITC एंटीबॉडी शेयरों के रूप में FUCCI-हरी प्रतिदीप्ति तुलना में एक ही तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन छँटाई से पहले जुदाई स्तंभों का उपयोग अलग लेक्स पॉजिटिव और लेक्स नकारात्मक भिन्न (चित्रा 3 ए, बी)।
    1. सबसे पहले, पीबीएस 0.15% BSA के 100 μl में अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक माउस विरोधी मानव लेक्स प्रतिरक्षी (1:50) के साथ कोशिकाओं लेबल।
    2. तो अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए विरोधी माउस आईजीएम microbeads (1:10) के साथ कोशिकाओं लेबल, 10 मिनट के लिए 200 XG पर 1 मिलीलीटर पीबीएस 0.15% BSA और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. 10 मिनट के लिए 200 XG पर 1 मिलीलीटर पीबीएस 0.15% BSA और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। 500 μl पीबीएस 0.15% BSA में कोशिकाओं Resuspend और चित्रा 3 सी में schematized के रूप में चुंबकीय क्षेत्र में जुदाई कॉलम के माध्यम से कोशिकाओं डालना। 1 मिलीलीटर पीबीएस 0.15% बी के साथ स्तंभ धो लेंएसए लेक्स नकारात्मक अंश प्राप्त करने के लिए।
    4. लेक्स पॉजिटिव अंश प्राप्त करने के लिए, चुंबकीय क्षेत्र से अलग होने के स्तंभ को हटाने और 2 मिलीलीटर पीबीएस 0.15% BSA के साथ कोशिकाओं elute।
    5. 4.2 में संकेत के रूप CD24-PC7 और Ax647 संयुग्मित EGF ligand धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।

5. सेल छंटनी

नोट: कक्ष एक 86 माइक्रोन noozle के साथ 40 साई में एक FACS सॉर्टर पर हल किया गया। 520 / 35nm (FITC), 575 / 26nm (पीई), 670 / 20nm (Ax647) और 740LP (PC7): प्रतिदीप्ति निम्नलिखित फिल्टर सेट का उपयोग कर एकत्र किया गया था। एक ओवरलैप FUCCI लाल प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और PC7 डाई के बीच पाया जाता है के रूप में मुआवजा झूठी सकारात्मक संकेतों को रोकने के लिए आवश्यक है।

  1. सेल छँटाई करने के तुरंत पहले, मृत कोशिकाओं से जीना भेदभाव करने के लिए एक महत्वपूर्ण डाई जोड़ें। हम एक 2 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में हो (सामग्री तालिका देखें) का इस्तेमाल किया। FACS सॉर्टर और चयन वीं के माध्यम से नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब (अगोचर कोशिकाओं) भागोपक्ष तितर बितर (एसएससी) और आगे तितर बितर (एफएससी) मानकों (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर ई कोशिकाओं।
    नोट: मृत कोशिकाओं (चित्रा 1 ए ') केवल ओ-नेगेटिव अंश gating और फिर दोहरी पल्स चौड़ाई नकारात्मक अंश (चित्रा 1 ए का चयन करके बाहर रखा गया है' ') से बाहर रखा गया है।
  2. 4.2 कदम में तैयार एकल रंग नियंत्रण चलाने के लिए और photomultiplier ट्यूब समायोजित (पीएमटी) यदि आवश्यक (यानी नकारात्मक आबादी बहुत अधिक है और / या सकारात्मक कोशिकाओं बंद पैमाने) voltages। सॉफ्टवेयर का मुआवजा विंडो में रंग मुआवजा प्रदर्शन करते हैं।
  3. भागो एफएमओ 4.2 कदम (लेक्स-FITC एफएमओ नियंत्रण, CD24-PC7 एफएमओ नियंत्रण और Ax647 संयुग्मित EGF ligand एफएमओ नियंत्रण) में तैयार नियंत्रित करता है और छँटाई फाटकों (चित्रा 1) आकर्षित। सीधे 1.5 मिलीलीटर microtubes में संस्कृति के माध्यम से 100 μl में क्रमबद्ध कोशिकाओं।

माइक्रोस्कोपी के लिए कक्षों की 6. तैयारी

  1. हौसले के अनुसार क्रमबद्ध सेल प्लेट1 के घनत्व पर एस - 3 एक्स 10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह पर पाली-डी-Lysine- संस्कृति के माध्यम से 300 μl के साथ 96 अच्छी तरह से μ-प्लेट लेपित।
  2. वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए पहले, कोशिका आसंजन अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों सेते हैं और 5%।

7. माइक्रोस्कोप सेटअप और छवि अधिग्रहण

  1. सीओ 2 माहौल के 5% के नीचे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक औंधा thermostated चैम्बर से जुड़ी एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग सिस्टम पर: एक योजना ए पी ओ कुलपति 20x डीआईसी उद्देश्य (0.75 एनए) का उपयोग रहते इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
  2. पूर्व गर्म और equilibrated thermostated कक्ष के अंदर 96 अच्छी तरह से μ-प्लेट स्थिति और एक thermostated कवर से ढकने की जगह।
  3. एनआईएस-तत्वों सॉफ्टवेयर पर खुला और मेनू पट्टी में क्लिक समय चूक के विकल्प (लंबाई, मंच पदों, कोंफोकल Z-वर्गों, ...), "मोल / अधिग्रहण नियंत्रण का चयन करने के लिए" मोल / अधिग्रहण / एनडी अधिग्रहण नियंत्रण " / तिवारी पैड221; उद्देश्यों का चयन करें और "मोल / अधिग्रहण नियंत्रण / A1plus सेटिंग्स" मेनू पट्टी में प्रत्येक प्रतिदीप्ति के लिए पीएमटी के स्तर का चयन करने के लिए। डेटा फ़ाइलों को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें।
  4. एनडी अधिग्रहण खिड़की का उपयोग करना, प्रत्येक के केंद्र में अच्छी तरह से एक मंच स्थिति सेट और 7 एक्स 7 मिमी ² के लिए बड़ी छवि विकल्प चुनें। यह अच्छी तरह से प्रत्येक के केंद्र के चारों ओर एक पच्चीकारी छवि बनाएगा। 5% करने के लिए बड़े पच्चीकारी छवि के लिए ओवरलैप सेट करें। 24 घंटे के लिए हर 20 मिनट तस्वीरें ले लो। तिवारी पैड खिड़की में: योजना ए पी ओ कुलपति 20x डीआईसी उद्देश्य (0.75 एनए) का चयन करें।
  5. A1plus सेटिंग्स विंडो में, 1.26 माइक्रोन / पिक्सेल का एक संकल्प के साथ एक 512 x 512 पिक्सल प्रारूप पर उच्च गति गुंजयमान स्कैनर का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण। सेल आकार कल्पना करने के लिए brightfield का प्रयोग करें। FUCCI लाल चूहों के मामले में, 561 एनएम पर लाल प्रतिदीप्ति उत्तेजित और एक 595/50 एनएम फिल्टर का उपयोग कर इकट्ठा। FUCCI-ग्रीन चूहों के मामले में, 488 एनएम पर हरी प्रतिदीप्ति उत्तेजित और एक 530/40 एनएम फिल्टर का उपयोग कर इकट्ठा। इष्टतम प्रधानमंत्री का निर्धारण करेंप्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए टी स्तर, ऑफसेट और लेजर शक्ति।
    नोट: हम सॉफ्टवेयर प्रत्येक अधिग्रहण से पहले प्रत्येक चरण की स्थिति पर autofocus करने की अनुमति के लिए brightfield चैनल के लिए ऑटोफोकस समारोह का उपयोग करना चाहिये। सुझाव: एक योजना ए पी ओ कुलपति 20x डीआईसी उद्देश्य (एनए: 0.75) तेल के लिए आवश्यकता के बिना अपने उत्कृष्ट समाधान के लिए इस्तेमाल किया गया था। अन्य उद्देश्यों वांछित ऑप्टिकल संकल्प के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. अधिग्रहण शुरू करने के लिए एन डी अधिग्रहण खिड़की पर 'अब भागो' बटन का चयन करें।
    सुझाव: ठीक से काम करने में सब कुछ है कि यह सुनिश्चित करने की एक पाश के लिए कंप्यूटर काम का पालन करें।

8. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. व्यक्तिगत रूप से कोशिकाओं पर नज़र रखने से एनआईएस-तत्वों सॉफ्टवेयर पर सीधे डेटा का विश्लेषण। सुझाव:, समय हासिल एनआईएस-तत्वों सॉफ्टवेयर का उपयोग कर .AVI प्रारूप में प्रत्येक स्थिति को बचाने और ImageJ के साथ फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए।
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर में, करने के लिए कम से कम 2 डिवीजनों (यानी एक सेल के दौर से गुजर व्यक्ति की कोशिकाओं को ट्रैकएक चार सेल कॉलोनी)। सेल के चारों ओर एक छोटा सा क्षेत्र की फसल और 'छवि / डुप्लीकेट' का चयन करें।
  3. एक असेंबल करने के लिए मेनू पट्टी में 'छवि / ढेर / मेकअप असेंबल' का चयन करें। , फ्रेम शामिल होने के लिए छवियों का आकार निर्दिष्ट करें और इष्टतम समाधान के लिए एक .tif फ़ाइल के रूप में असेंबल बचाने के लिए।
  4. पहले एसजी 2 / एम चरण लंबाई (चित्रा -2 सी, डी) की गणना करने के लिए, (जी 1 में) एक ही लाल फ्लोरोसेंट सेल चयन करें और फिर टी (लाल प्रतिदीप्ति बंद स्विच एक बार शुरू हो जाएगा एस चरण) = 0 निर्धारित किया है। सेल एसजी 2 / एम लंबाई का अनुमान है बिताते हैं जब तक तख्ते की संख्या की गणना।
    नोट: गणना के समय प्रत्येक फ्रेम के बीच समय अंतराल पर निर्भर करता है।
  5. निम्नलिखित G1 चरण (चित्रा -2 सी, डी) की गणना करने के लिए, बस विभाजित है कि सेल को ट्रैक करने के लिए जारी है। विभाजित सेल G1 के चरण में प्रवेश करती है, तो cdt1 लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक संग्रह हो जाएगा। लाल प्रतिदीप्ति आगा बंद स्विच जब तक फ्रेम की संख्या की गणनाप्रत्येक कक्ष के लिए में।
    सुझाव: जी 1 की शुरुआत में लाल प्रतिदीप्ति कमजोर हो सकता है तो सेल approximations से बचने के लिए विभाजित किया गया है, जहां फ्रेम पर जी 1 चरण की शुरुआत चुनें।

Representative Results

मज़बूती से वयस्क माउस SVZ स्टेम सेल वंश के अलग सेल आबादी के बीच भेदभाव करने की क्षमता उनके कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए मौलिक है। उस प्रयोजन के लिए, हम वयस्क SVZ से विशेष सेल आबादी की शुद्धि के लिए अनुमति देता है एक लेक्स / EGFR / CD24 ट्रिपल लेबलिंग रणनीति विकसित किया है: मौन एनएससी (लेक्स उज्ज्वल), सक्रिय एनएससी (लेक्स + EGFR +) दूसस (EGFR +) अपरिपक्व और पलायन neuroblasts (CD24 + EGFR + और ​​क्रमशः CD24 +) 9 (चित्रा 1)। FUCCI ट्रांसजेनिक चूहों के लिए आवेदन किया, तकनीक सेल छँटाई एकल कोशिका स्तर 25 पर विभिन्न तंत्रिकाजन्य आबादी के सेल चक्र के चरणों का जीना इमेजिंग की अनुमति देता है। FUCCI लाल चूहों लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी (2A चित्रा) के साथ जी 1 चरण का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। FUCCI लाल neg कोशिकाओं एस में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्वजी सेल चक्र के 2 / एम चरणों, FUCCI लाल पीओएस कोशिकाओं जी 1 कोशिकाओं और FUCCI-चमकदार लाल कोशिकाओं या सेल चक्र से बाहर (चित्रा 2 बी) 23,26 बाहर निकलने कोशिकाओं रहे हैं। लेक्स + EGFR + और ​​युवा वयस्क (चित्रा -2) और मध्यम आयु वर्ग के चूहों (चित्रा 2 डी) से EGFR + कोशिकाओं पाली डी lysine लेपित संस्कृति प्लेटों पर पक्षपाती कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया गया। लाल प्रतिदीप्ति सेल विभाजित तक बंद स्विच एक बार पहले एसजी 2 / एम चरण एकल कक्षों पर पहचान की थी। पहले एसजी के रूप में मनाया 2 / एम चरण लंबाई, या तो युवा या मध्यम आयु वर्ग के चूहों में लेक्स + EGFR + और ​​EGFR + कोशिकाओं के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया। लाल प्रतिदीप्ति के स्विच बंद है तो जब तक हम प्रथम श्रेणी से अगले जी 1 चरण लंबाई की गणना की। दिलचस्प है, एक जी 1 चरण लंबी लेक्स + EGFR + कोशिकाओं लेकिन नहीं में उम्र बढ़ने के दौरान पाया गया थाEGFR + कोशिकाओं 25 (चित्रा -2 सी, डी) में। परिणाम में, neurospheres 5 दिनों चढ़ाना के बाद प्राप्त चित्रा 2 ई के रूप में दिखाया आयु वर्ग के चूहों से प्राप्त लेक्स + EGFR + कोशिकाओं में छोटे होते हैं।

FUCCI-ग्रीन चूहे भी एसजी हरी प्रतिदीप्ति के साथ 2 / एम चरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 3 ए, बी) लेकिन कोशिकाओं लेक्स-FITC एंटीबॉडी के रूप में जुदाई स्तंभों का उपयोग पूर्व हल किया जाना है FUCCI- तुलना में एक ही तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन साझा हरी प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 सी)। युवा वयस्क लेक्स + EGFR + और ​​EGFR + कोशिकाओं की पहली एसजी 2 / एम चरण के लिए FUCCI-हरी प्रतिदीप्ति का एक उदाहरण चित्रा 3 डी में दिखाया गया है।

चित्र 1
चित्रा 1:। FACS द्वारा सेल के चयन की रणनीति (ए) कोशिकाओं को पहले टी के अनुसार चयन किया गया थाआगे तितर बितर (एफएससी) पैरामीटर बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) का उपयोग वारिस आकृति विज्ञान। आकृति विज्ञान गेट चयन पर अधिक जानकारी के लिए, Daynac एट अल को देखें। 9 (ए ') मृत कोशिकाओं हो मार्कर का उपयोग लेबल और चयन से बाहर रखा गया है। (ए' ') दोहरी पल्स चौड़ाई पैरामीटर का उपयोग करके बाहर रखा गया है। छँटाई फाटक, प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) स्थापित करने के लिए आदेश में CD24-PC7 के लिए नियंत्रण (लेक्स-FITC / FUCCI-लाल / EGF की Ax647 लेबलिंग, बी) और लेक्स-FITC (FUCCI-लाल / EGF की Ax647 / CD24 -PC7 लेबलिंग, बी ') का उपयोग किया गया (सी, सी।' फिर, छँटाई फाटकों लेक्स-FITC / FUCCI लाल एफएमओ नियंत्रण के साथ साथ / EGF की Ax647 / CD24-PC7 लेबल ट्यूबों में निर्धारित किया गया है)। कुल कोशिकाओं का मतलब प्रतिशत फाटकों के भीतर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। CD24 + कोशिकाओं (neuroblasts) का चयन करते हैं, तो गेट से CD24 उज्ज्वल व्यक्त कोशिकाओं को बाहर करने के लिए सावधान रहना होगा। Ependymal सीई करने के लिए वास्तव में, CD24 उज्ज्वल अनुरूपLLS 2,9। सी 'CD24 नकारात्मक कोशिकाओं (सी में काले वर्ग) का प्रतिनिधित्व करता है। केवल लेक्स + EGFR + और ​​EGFR + (सी ') छँटाई फाटकों इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया।

चित्र 2
चित्रा 2: FUCCI लाल चूहों का उपयोग सेल चक्र का लाइव विश्लेषण (ए) कोशिकाओं एसजी 2 / एम चरणों 23 (बी) के FACS प्रतिनिधित्व के दौरान G1 के चरण के दौरान लाल फ्लोरोसेंट और बेरंग हैं जहां FUCCI-लाल कोशिका चक्र की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।। SVZ कोशिकाओं पर FUCCI लाल प्रतिदीप्ति। (सी, डी) लेक्स + EGFR + और ​​EGFR + कोशिकाओं युवा (सी) से हल और मध्यम आयु वर्ग (डी) के साथ वीडियो माइक्रोस्कोपी FUCCI लाल चूहों जी 1 चरण की ट्रैकिंग के साथ की अनुमति देता है 2 / एम चरणों whe deduced किया जा सकता एसजी जबकि लाल प्रतिदीप्तिएन लाल प्रतिदीप्ति बंद स्विच। लगातार छवियों डी में प्रस्तुत एक समय के पैमाने के साथ दिखाया गया है। कालोनियों के (ई) प्रतिनिधि छवियों (neurospheres) चढ़ाना के बाद 5 दिन प्राप्त की। स्केल पट्टी:। 10 माइक्रोन (सी, डी), 30μm (ई) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:।। FUCCI-ग्रीन चूहों का उपयोग सेल चक्र का जीना विश्लेषण के लिए रणनीति (ए) कोशिकाओं एसजी दौरान जी 1 चरण 23 के दौरान 2 / एम चरण और बेरंग हरा कर रहे हैं, जहां FUCCI-ग्रीन सेल चक्र की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (बी) FACS प्रतिनिधित्व FUCCI-ग्रीन प्रतिदीप्ति की: FUCCI-ग्रीन neg कोशिकाओं जी में सेल चक्र का एक चरण कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते FUCCI-Gree जबकिएन पीओएस कोशिकाओं / एम 23 एसजी 2 में कोशिकाओं रहे हैं। (सी) हरी फ्लोरोसेंट एसजी 2 / एम लेक्स + EGFR + के चरणों और EGFR + कोशिकाओं का पालन करने के लिए, SVZ कोशिकाओं जुदाई स्तंभों के साथ पहले से हल किया जाना था। प्रकोष्ठों विरोधी माउस लेक्स एंटीबॉडी और लेक्स + अंश विरोधी माउस microbeads का उपयोग स्तंभ पर बनाए रखा गया था साथ लेबल रहे थे (प्रोटोकॉल 4. देखें)। फिर, लेक्स + और ​​लेक्स - अंशों eluted और EGF की Ax647 और FACS छँटाई के लिए CD24-PC7 एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे (डी) वीडियो लेक्स + EGFR + के माइक्रोस्कोपी और EGFR युवा FUCCI-ग्रीन चूहों से हल + कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। हरी प्रतिदीप्ति साथ एसजी 2 / एम चरणों। लगातार छवियों डी में प्रस्तुत एक समय के पैमाने के साथ दिखाया गया है। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन (डी)।

Discussion

यहाँ बताया सेल छँटाई तकनीक वयस्क मस्तिष्क 9 में मौन एनएससी, सक्रिय एनएससी और उनके गुणों की अपनी संतान को सक्षम करने के अध्ययन और गतिशीलता के बीच विश्वसनीय भेदभाव की अनुमति देता है। जीवित कोशिकाओं 23 में कोशिका चक्र प्रगति के दृश्य परमिट जो FUCCI तकनीक के साथ मिलकर, हम युवा वयस्क और वृद्ध माउस मस्तिष्क की कोशिकाओं से सेल चक्र के जी 1 और एसजी 2 / एम चरणों का पालन करने के लिए एक तेजी से और कारगर तकनीक विकसित की है।

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सेल छँटाई तकनीक SVZ 9 से पांच मुख्य तंत्रिकाजन्य आबादी की शुद्धि के लिए अनुमति देता है मार्कर के पहले मान्य संयोजन था। यह भी मौन और सक्रिय एनएससी का गौरव सक्रिय करने के पहले मान्य तकनीक था। यह इस तकनीक सु ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के लिए अनुकूलित जब आवश्यक है, जो ट्रांसजेनिक चूहों से प्रति, के उपयोग की आवश्यकता नहीं है उल्लेखनीय है किFUCCI के रूप में चर्चा। तब से, Codega एट अल। 10 उनकी सक्रिय समकक्ष से मौन एनएससी भेद करने के लिए एक GFAP-GFP / CD133 / EGFR ट्रिपल लेबलिंग संयोजन का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह GFAP-GFP ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की आवश्यकता के रूप में यह FUCCI प्रौद्योगिकी के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता। Mich एट अल। 11 इस अध्ययन 9 में इस्तेमाल तकनीक के साथ आम परिणाम है कि शेयर एक GLAST / EGFR / CD24 ट्रिपल लेबलिंग रणनीति विकसित किया है। दरअसल, लेक्स और GLAST एनएससी मार्करों के बीच एक उच्च संबंध पहले से ही Daynac एट अल में मनाया गया। 9 का अध्ययन। हालांकि, Mich एट अल। तकनीक में इस्तेमाल GLAST एंटीबॉडी phycoerythrin के लिए युग्मित है और इस तरह FUCCI लाल चूहों के उपयोग के साथ अनुकूलित नहीं किया जा सकता।

SVZ कोशिकाओं सॉर्ट करने से पहले ध्यान देने की जरूरत है कि कई महत्वपूर्ण तकनीकी अंक हैं। सबसे पहले, हदबंदी कदम मस्तिष्क के ऊतकों में संरचनात्मक संरक्षण, जबकि एकल कक्षों में अलग हो गया है के रूप में बहुत महत्वपूर्ण हैएंटीबॉडी लेबलिंग रणनीति के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन की tegrity। 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA SVZ ऊतक 27 लेकिन लेक्स प्रतिजन के रूप में लगभग सभी लेक्स-FITC इम्यूनोफ्लोरेसेंस (नहीं दिखाया डेटा) खो गया था अत्यधिक संवेदनशील होना पाया गया बवाल में बहुत प्रभावी होना दिखाया गया है। इसे और अधिक कुशल और मस्तिष्क के ऊतकों पर अन्य प्रोटिएजों से कम विनाशकारी था के रूप में इस प्रकार, papain इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, लेक्स और न ही EGFR और न ही CD24 न papain उपचार से प्रभावित थे। यह papain उपचार के लिए 15 मिनट से अधिक हो गई है, तो एंटीबॉडी लेबलिंग बदल गया था कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हम एक यांत्रिक हदबंदी (पिपेट ऊपर और नीचे 20 बार) के साथ जुड़े एक 10 मिनट papain उपचार के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त किया।

पाली-डी-लाइसिन कोटिंग पक्षपाती कोशिकाओं की संस्कृति और संस्कृति में कई दिनों के बाद कालोनियों के गठन की अनुमति देता है। अब यह व्यापक रूप से इन विट्रो assays में अपनी सीमाओं 28,29 के साथ आता है कि स्वीकार किया जाता है। हम केवल पहले सेल चक्र का निर्धारण करने की सिफारिशकम से कम एक बाद के विभाजन के दौर से गुजर कोशिकाओं में विवो सेल phenotype के लिए संभव के रूप में बंद रहने के लिए।

यह Geminin (हरी प्रतिदीप्ति) और Cdt1 (लाल प्रतिदीप्ति) प्रोटीन पहले चूहों 30 में और वयस्क मस्तिष्क 9,25 ऊतकों में जल्दी न्यूरोजेनेसिस दौरान बहुतायत से तंत्रिका पूर्वज द्वारा व्यक्त होना दिखाया गया 23 FUCCI प्रणाली डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल का उल्लेख है कि उल्लेखनीय है । MKO2-hCdt1 (30/120) का निर्माण मुख्य रूप से लाल प्रतिदीप्ति साथ G1 चरण का पालन करने के लिए वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था हालांकि, दोनों निर्माणों का उपयोग [mKO2-hCdt1 (30/120) और पत्रिका-hGem (1/110) ] कोशिका चक्र के प्रमुख चरणों के दृश्य (जी 1 और एसजी 2 / एम) के साथ-साथ जी 1 / एस संक्रमण 23 अनुमति देने के लिए कल्पना की जा सकती है। दोहरी रंग इमेजिंग के मुख्य दोष अभी भी सेल लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रतिदीप्ति की सीमित संगत सेट है। एक समाधान separati का उपयोग करने के लिए हैस्तंभों पर। उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक सेल छँटाई से पहले जुदाई स्तंभों का उपयोग कोशिकाओं से CD24 पॉजिटिव अंश को समाप्त किया है और जीने-इमेजिंग हम FUCCI लाल प्रतिदीप्ति 25 से एक ही तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन साझा की है कि एक CD24 पीई एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है।

कुछ अध्ययनों वयस्क माउस SVZ आबादी के सेल चक्र लंबाई की जांच की है। हमारी तकनीक के साथ प्राप्त की कुल सेल चक्र लंबाई कोस्टा एट अल। 21 से इन विट्रो में अनुमान के अनुसार एक के करीब है, लेकिन हम अलग सेल चक्र के चरणों भेद करने के लिए पहली बार के लिए सक्षम थे। एक में विवो अध्ययन में, पोंटी एट अल। 22 विभिन्न SVZ सेल आबादी के प्रसार की गतिशीलता का निर्धारण करने के thymidine analogs के समावेश का इस्तेमाल किया। हालांकि, वे सेल चक्र की एक सतत निगरानी प्रदर्शन और न ही एकल कोशिका स्तर पर कोशिकाओं को ट्रैक कर सकता न। इस तरह से यह एक मजबूत विविधता बुद्धि मौजूद है कि दिखाया गया था के रूप में एक मुद्दा हो सकता हैएक दिया SVZ सेल की आबादी 22,25 हीन। हम यहाँ एक एकल कोशिका के स्तर पर अलग वयस्क तंत्रिकाजन्य आबादी के सेल चक्र के चरणों का जीना इमेजिंग की अनुमति देता है कि स्थापित करने के लिए आसान विट्रो तकनीक में एक वैकल्पिक, का वर्णन है।

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और progenitors के सेल चक्र के विनियमन को समझना उम्र बढ़ने या मस्तिष्क विकृतियों के संदर्भ में नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के विकास के लिए एक चुनौती बनी हुई है। हमारी प्रोटोकॉल इस प्रकार के आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला हो सकती है। उम्र बढ़ने के संदर्भ में, इस तकनीक को भी एनएससी भेदभाव पर उम्र बढ़ने के प्रभाव को समझने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। दरअसल, यह उनकी लाल फ्लोरोसेंट तीव्रता 26 विशिष्ट अधिक है के रूप में भेदभाव में प्रवेश तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पहचान करने के लिए संभव है। अंत में, यह भी वंश समर्थक के लिए जिम्मेदार सेल आंतरिक और बाह्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक एकल कोशिका के स्तर पर निरंतर रहते इमेजिंग का फायदा उठाने के लिए ब्याज की हो सकता हैवयस्क एनएससी के gression।

Acknowledgments

हम सी Joubert, वी न्यूविल, वी Barroca, जम्मू टिलिएट और पशु सुविधाओं के सभी कर्मचारियों के लिए आभारी हैं; सेल छँटाई करने के लिए J Baijer और एन Dechamps करने के लिए; उसकी प्रशासनिक सहायता के लिए तकनीकी सहायता के लिए ओ एटीन, और ए Gouret। प्रवाह cytometry और सेल छँटाई मंद-स्टेम पोल, INSERM, Fondation एआरसी, और सीईए से उपकरण अनुदान द्वारा स्थापित, IRCM फ्लो साझा संसाधन पर किए गए। इस काम ELECTRICITE डी फ्रांस (ईडीएफ) का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। एमडी इले-डे-फ्रांस (मंद Biothérapies) से ला लीग Contre Le कैंसर और एल एम से एक फैलोशिप है। मार्क-आंद्रे Mouthon और शेयर सह वरिष्ठ ग्रन्थकारिता फ़्राँस्वा डी Boussin।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well uncoated glass bottom culture plates  MatTek Corp. P96G-1.5-5-F
µ-Plates 96-well Ibidi 89626
Poly-D-Lysine Millipore A003E
NeuroCult NSC Basal Medium STEMCELL Technologies 5700
NeuroCult NSC Proliferation Supplement  STEMCELL Technologies 5701
Heparin STEMCELL Technologies 7980
EGF Millipore GF144
FGF-2 Millipore GF003
Papain Worthington LS003119
EBSS Invitrogen 24010-043
L-cysteine Sigma C-7352
0.5M EDTA, pH 8.0 Promega V4231
DNase I Sigma D5025-15KU
Trypsin inhibitor type II Sigma T9128 Ovomucoid
DMEM:F12 medium Life Technologies 31330-038
20 µm filter  BD Medimachine Filcon 340622
Eppendorf microtubes 3810X Sigma Z606340-1000EA
BSA Sigma A1595 Bovine serum albumin solution
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] Life Technologies A14776 Mouse IgM; clone MMA. 1:50
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated BD Biosciences 332778 Rat IgG2b; clone M1/69.  1:50
Mouse anti-human LeX antibody BD Pharmingen 559045 Mouse IgM; clone MAM.  1:50
Alexa647 - conjugated EGF ligand Life Technologies E35351 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text
CompBeads BD Biosciences 644204
MACS LS separation columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 separation columns (in the manuscript)
Anti-mouse IgM microbeads  Miltenyi Biotec 130-047-301
Hoechst 33258 Sigma 861405 HO (in the manuscript)
INFLUX cell sorter BD Biosciences FACS sorter (in the text)
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti Nikon Corp. confocal laser scanning microscope (in the manuscript)
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software Nikon Corp. NIS-Elements software (in the manuscript)
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) Nikon Corp.
ECLIPSE Ti thermostated chamber Nikon Corp. thermostated chamber (in the manuscript)
ImageJ RBS
FlowJo Tree Star, Ashland, OR
FUCCI mice RIKEN BioResource Center, JAPAN Sakaue-Sawano et al. 2008

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 103 FUCCI FACS तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं subventricular क्षेत्र समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी कोशिका चक्र।
सेल वयस्क माउस subventricular क्षेत्र से तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की छंटनी और उनके सेल चक्र गतिशीलता का लाइव-इमेजिंग
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Daynac, M., Morizur, L.,… More

Daynac, M., Morizur, L., Kortulewski, T., Gauthier, L. R., Ruat, M., Mouthon, M. A., Boussin, F. D. Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics. J. Vis. Exp. (103), e53247, doi:10.3791/53247 (2015).

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