We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
पार्श्व निलय की subventricular क्षेत्र में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) (SVZ) स्तनधारी दिमाग में जीवन भर घ्राण न्यूरोजेनेसिस बनाए। वे क्रमिक वे घ्राण बल्ब एकीकृत एक बार न्यूरॉन्स में अंतर यह है कि पारगमन amplifying कोशिकाओं (दूसस) और neuroblasts उत्पन्न करते हैं। उभरते फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल (FACS) तकनीक एनएससी के अलगाव के रूप में भी उनकी संतान की अनुमति दी है छंटनी और वयस्क तंत्रिकाजन्य आलों में जीन विनियामक नेटवर्क पर प्रकाश डाला करने के लिए शुरू कर दिया है। हम यहाँ का पालन करें और एक लेक्स / EGFR / CD24 ट्रिपल धुंधला के साथ वयस्क SVZ से उपर्युक्त सेल आबादी के सेल चक्र गतिशीलता भेद करने के लिए अनुमति देता है कि एक सेल छँटाई तकनीक की रिपोर्ट। अलग कक्षों तो समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने सेल चक्र प्रगति विवरण में पता लगाने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया जाता है। यह अंत करने के लिए, हम कोशिकाओं ड्यूरिन लाल फ्लोरोसेंट रहे हैं, जिसमें ट्रांसजेनिक प्रतिदीप्ति Ubiquitination कोशिका चक्र संकेतक (FUCCI) चूहों का उपयोगजी जी जी एक विशिष्ट लाल Cdt1 संवाददाता के कारण 1 चरण। इस विधि को हाल ही में proliferating एनएससी उत्तरोत्तर न्यूरोजेनेसिस हानि के लिए अग्रणी, उम्र बढ़ने के दौरान उनके जी 1 चरण को लंबा है कि पता चला है। इस विधि के अन्य प्रणालियों के लिए आसानी से transposable है और मस्तिष्क विकृतियों के संदर्भ में मस्तिष्क कोशिकाओं के कोशिका चक्र की गतिशीलता के अध्ययन के लिए महान ब्याज की हो सकती है।
मौन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) वयस्क न्यूरोजेनेसिस 1 के लिए स्रोत रहे हैं और उनके proliferative में परिवर्तित कर सकते हैं EGFR (aNSCs) व्यक्त प्रपत्र 2 "सक्रिय"। एक बार सक्रिय, वे astrocytes की एक ट्यूब के माध्यम से घ्राण बल्ब (ओ) की ओर पलायन और अंत में न्यूरॉन्स 4,5 में अंतर तो है कि पारगमन amplifying कोशिकाओं (दूसस) 3 और neuroblasts को जन्म दे। एनएससी और उनके वंशज अपने प्रसार 6 कारकों को नियंत्रित करने के असंख्य फंसाने, पार्श्व निलय साथ विशेष "आलों" आर्किटेक्चर में आयोजित कर रहे हैं। SVZ तंत्रिकाजन्य कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि उनके प्रसार के जटिल आणविक विनियमन रोशन करने के लिए आवश्यक है, लेकिन कारण विशिष्ट मार्करों और अनुकूलित तकनीक की कमी के लिए एक लंबे समय के लिए एक चुनौती बनी हुई हैं।
प्रवाह का उपयोग कर नए तरीकों cytometry एनएससी और उनके व्यापार के अलगाव संभव प्रदान की गई हैवयस्क SVZ 2,7-11 से आर संतान। , मौन और सक्रिय एनएससी, दूसस: कोशिकाओं 2 proliferating पर EGFR लेबल करने के लिए neuroblast मार्कर CD24 13 और एक प्रतिदीप्ति EGF के साथ स्टेम सेल मार्कर लेक्स 12 का उपयोग करना, हम हाल ही में मुख्य SVZ तंत्रिकाजन्य आबादी में से पांच की शुद्धि के लिए अनुमति देता है एक FACS रणनीति विकसित अपरिपक्व है और साथ ही पलायन neuroblasts 9। यहाँ, हम विवरण में इस तकनीक सेल छँटाई और कैसे का वर्णन पहली बार के लिए अनुमति एक लेक्स / EGFR / CD24 ट्रिपल धुंधला मौन और सक्रिय एनएससी दोनों के अलगाव की।
न्यूरोजेनेसिस वयस्कता के दौरान बनी रहती है, नए न्यूरॉन्स का उत्पादन तेजी से उम्र बढ़ने मस्तिष्क 14 में कमी आई है। अधिकांश अध्ययन SGZ और SVZ 15-20 में पूर्वज कोशिकाओं proliferating की संख्या में एक प्रगतिशील कमी पर सहमत हैं। SVZ में न्यूरोजेनेसिस में उम्र से संबंधित गिरावट n का एक कमी भड़काती के रूप में परिणामों अहानिकर नहीं हैंवृद्ध व्यक्ति के मस्तिष्क की घ्राण बल्ब में ewborn न्यूरॉन्स, अंततः आयु वर्ग के चूहों 18 में घ्राण भेदभाव में हानि के लिए अग्रणी। तंत्रिका progenitors के सेल चक्र कैनेटीक्स elucidating उम्र बढ़ने के दौरान वयस्क न्यूरोजेनेसिस के विकास अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हाल के अध्ययनों से इन विट्रो 21 और इन विवो 22 में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के कोशिका चक्र और वंश प्रगति की जांच की है, लेकिन उनमें से कोई भी अलग कक्षों की सेल-चक्र के चरणों कल्पना करने के लिए सेल छँटाई तकनीक और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सेल चक्र जांच का फायदा उठाया एक एकल कोशिका के स्तर पर।
यहाँ हम जी 1 और एसजी 2 / एम चरणों 23 के बीच भेद की इजाजत दी, कोशिकाओं को उनके सेल चक्र के दौरान फ्लोरोसेंट रहे हैं, जिसमें ट्रांसजेनिक FUCCI चूहों का लाभ लेता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल वयस्क FUCCI मील से एनएससी और उनकी संतान की कैसे संभावित अलगाव से पता चलता हैसमय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त सीई एक एकल कोशिका के स्तर पर सेल चक्र की गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है।
यहाँ बताया सेल छँटाई तकनीक वयस्क मस्तिष्क 9 में मौन एनएससी, सक्रिय एनएससी और उनके गुणों की अपनी संतान को सक्षम करने के अध्ययन और गतिशीलता के बीच विश्वसनीय भेदभाव की अनुमति देता है। जीवित कोशिकाओं 23 में कोशिका चक्र प्रगति के दृश्य परमिट जो FUCCI तकनीक के साथ मिलकर, हम युवा वयस्क और वृद्ध माउस मस्तिष्क की कोशिकाओं से सेल चक्र के जी 1 और एसजी 2 / एम चरणों का पालन करने के लिए एक तेजी से और कारगर तकनीक विकसित की है।
इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सेल छँटाई तकनीक SVZ 9 से पांच मुख्य तंत्रिकाजन्य आबादी की शुद्धि के लिए अनुमति देता है मार्कर के पहले मान्य संयोजन था। यह भी मौन और सक्रिय एनएससी का गौरव सक्रिय करने के पहले मान्य तकनीक था। यह इस तकनीक सु ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के लिए अनुकूलित जब आवश्यक है, जो ट्रांसजेनिक चूहों से प्रति, के उपयोग की आवश्यकता नहीं है उल्लेखनीय है किFUCCI के रूप में चर्चा। तब से, Codega एट अल। 10 उनकी सक्रिय समकक्ष से मौन एनएससी भेद करने के लिए एक GFAP-GFP / CD133 / EGFR ट्रिपल लेबलिंग संयोजन का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह GFAP-GFP ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की आवश्यकता के रूप में यह FUCCI प्रौद्योगिकी के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता। Mich एट अल। 11 इस अध्ययन 9 में इस्तेमाल तकनीक के साथ आम परिणाम है कि शेयर एक GLAST / EGFR / CD24 ट्रिपल लेबलिंग रणनीति विकसित किया है। दरअसल, लेक्स और GLAST एनएससी मार्करों के बीच एक उच्च संबंध पहले से ही Daynac एट अल में मनाया गया। 9 का अध्ययन। हालांकि, Mich एट अल। तकनीक में इस्तेमाल GLAST एंटीबॉडी phycoerythrin के लिए युग्मित है और इस तरह FUCCI लाल चूहों के उपयोग के साथ अनुकूलित नहीं किया जा सकता।
SVZ कोशिकाओं सॉर्ट करने से पहले ध्यान देने की जरूरत है कि कई महत्वपूर्ण तकनीकी अंक हैं। सबसे पहले, हदबंदी कदम मस्तिष्क के ऊतकों में संरचनात्मक संरक्षण, जबकि एकल कक्षों में अलग हो गया है के रूप में बहुत महत्वपूर्ण हैएंटीबॉडी लेबलिंग रणनीति के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन की tegrity। 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA SVZ ऊतक 27 लेकिन लेक्स प्रतिजन के रूप में लगभग सभी लेक्स-FITC इम्यूनोफ्लोरेसेंस (नहीं दिखाया डेटा) खो गया था अत्यधिक संवेदनशील होना पाया गया बवाल में बहुत प्रभावी होना दिखाया गया है। इसे और अधिक कुशल और मस्तिष्क के ऊतकों पर अन्य प्रोटिएजों से कम विनाशकारी था के रूप में इस प्रकार, papain इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, लेक्स और न ही EGFR और न ही CD24 न papain उपचार से प्रभावित थे। यह papain उपचार के लिए 15 मिनट से अधिक हो गई है, तो एंटीबॉडी लेबलिंग बदल गया था कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हम एक यांत्रिक हदबंदी (पिपेट ऊपर और नीचे 20 बार) के साथ जुड़े एक 10 मिनट papain उपचार के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त किया।
पाली-डी-लाइसिन कोटिंग पक्षपाती कोशिकाओं की संस्कृति और संस्कृति में कई दिनों के बाद कालोनियों के गठन की अनुमति देता है। अब यह व्यापक रूप से इन विट्रो assays में अपनी सीमाओं 28,29 के साथ आता है कि स्वीकार किया जाता है। हम केवल पहले सेल चक्र का निर्धारण करने की सिफारिशकम से कम एक बाद के विभाजन के दौर से गुजर कोशिकाओं में विवो सेल phenotype के लिए संभव के रूप में बंद रहने के लिए।
यह Geminin (हरी प्रतिदीप्ति) और Cdt1 (लाल प्रतिदीप्ति) प्रोटीन पहले चूहों 30 में और वयस्क मस्तिष्क 9,25 ऊतकों में जल्दी न्यूरोजेनेसिस दौरान बहुतायत से तंत्रिका पूर्वज द्वारा व्यक्त होना दिखाया गया 23 FUCCI प्रणाली डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल का उल्लेख है कि उल्लेखनीय है । MKO2-hCdt1 (30/120) का निर्माण मुख्य रूप से लाल प्रतिदीप्ति साथ G1 चरण का पालन करने के लिए वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था हालांकि, दोनों निर्माणों का उपयोग [mKO2-hCdt1 (30/120) और पत्रिका-hGem (1/110) ] कोशिका चक्र के प्रमुख चरणों के दृश्य (जी 1 और एसजी 2 / एम) के साथ-साथ जी 1 / एस संक्रमण 23 अनुमति देने के लिए कल्पना की जा सकती है। दोहरी रंग इमेजिंग के मुख्य दोष अभी भी सेल लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रतिदीप्ति की सीमित संगत सेट है। एक समाधान separati का उपयोग करने के लिए हैस्तंभों पर। उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक सेल छँटाई से पहले जुदाई स्तंभों का उपयोग कोशिकाओं से CD24 पॉजिटिव अंश को समाप्त किया है और जीने-इमेजिंग हम FUCCI लाल प्रतिदीप्ति 25 से एक ही तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन साझा की है कि एक CD24 पीई एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है।
कुछ अध्ययनों वयस्क माउस SVZ आबादी के सेल चक्र लंबाई की जांच की है। हमारी तकनीक के साथ प्राप्त की कुल सेल चक्र लंबाई कोस्टा एट अल। 21 से इन विट्रो में अनुमान के अनुसार एक के करीब है, लेकिन हम अलग सेल चक्र के चरणों भेद करने के लिए पहली बार के लिए सक्षम थे। एक में विवो अध्ययन में, पोंटी एट अल। 22 विभिन्न SVZ सेल आबादी के प्रसार की गतिशीलता का निर्धारण करने के thymidine analogs के समावेश का इस्तेमाल किया। हालांकि, वे सेल चक्र की एक सतत निगरानी प्रदर्शन और न ही एकल कोशिका स्तर पर कोशिकाओं को ट्रैक कर सकता न। इस तरह से यह एक मजबूत विविधता बुद्धि मौजूद है कि दिखाया गया था के रूप में एक मुद्दा हो सकता हैएक दिया SVZ सेल की आबादी 22,25 हीन। हम यहाँ एक एकल कोशिका के स्तर पर अलग वयस्क तंत्रिकाजन्य आबादी के सेल चक्र के चरणों का जीना इमेजिंग की अनुमति देता है कि स्थापित करने के लिए आसान विट्रो तकनीक में एक वैकल्पिक, का वर्णन है।
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और progenitors के सेल चक्र के विनियमन को समझना उम्र बढ़ने या मस्तिष्क विकृतियों के संदर्भ में नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के विकास के लिए एक चुनौती बनी हुई है। हमारी प्रोटोकॉल इस प्रकार के आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला हो सकती है। उम्र बढ़ने के संदर्भ में, इस तकनीक को भी एनएससी भेदभाव पर उम्र बढ़ने के प्रभाव को समझने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। दरअसल, यह उनकी लाल फ्लोरोसेंट तीव्रता 26 विशिष्ट अधिक है के रूप में भेदभाव में प्रवेश तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पहचान करने के लिए संभव है। अंत में, यह भी वंश समर्थक के लिए जिम्मेदार सेल आंतरिक और बाह्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक एकल कोशिका के स्तर पर निरंतर रहते इमेजिंग का फायदा उठाने के लिए ब्याज की हो सकता हैवयस्क एनएससी के gression।
The authors have nothing to disclose.
हम सी Joubert, वी न्यूविल, वी Barroca, जम्मू टिलिएट और पशु सुविधाओं के सभी कर्मचारियों के लिए आभारी हैं; सेल छँटाई करने के लिए J Baijer और एन Dechamps करने के लिए; उसकी प्रशासनिक सहायता के लिए तकनीकी सहायता के लिए ओ एटीन, और ए Gouret। प्रवाह cytometry और सेल छँटाई मंद-स्टेम पोल, INSERM, Fondation एआरसी, और सीईए से उपकरण अनुदान द्वारा स्थापित, IRCM फ्लो साझा संसाधन पर किए गए। इस काम ELECTRICITE डी फ्रांस (ईडीएफ) का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। एमडी इले-डे-फ्रांस (मंद Biothérapies) से ला लीग Contre Le कैंसर और एल एम से एक फैलोशिप है। मार्क-आंद्रे Mouthon और शेयर सह वरिष्ठ ग्रन्थकारिता फ़्राँस्वा डी Boussin।
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |