We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
在侧脑室的脑室下区神经干细胞(NSCs)(SVZ)维持整个生命的嗅觉神经发生在哺乳动物的大脑。他们先后产生短暂扩充细胞(总可捕量)和神经母细胞分化成神经细胞,一旦他们整合嗅球。新兴的荧光激活细胞分选(FACS)技术允许NSCs的隔离以及它们的子代,并开始阐明基因调控网络在成年神经源性龛的光。我们在这里报告一细胞分拣技术,它允许按照从成年SVZ用LEX / EGFR / CD24三重染色区分上述细胞群的细胞周期动力学。然后分离的细胞铺板以贴壁细胞,探讨在由时间推移的视频显微镜详细它们的细胞周期进程。为此,我们使用转基因荧光泛素细胞周期指示符(FUCCI)小鼠中,细胞是红色荧光durin的G 1阶段,由于A G 1特异性红CDT1记者。这种方法最近发现,神经干细胞增殖过程中的老化逐渐延长它的G 1期,从而导致神经损伤。这种方法是很容易转座到其他系统,可能是对脑细胞在脑病理学的上下文中,细胞周期动力学的研究极大的兴趣。
静态的神经干细胞(NSCs)是源成年神经1和可以转化成它们的增殖“激活”的形式表达EGFR(aNSCs)2。一旦被激活,它们产生短暂扩充细胞(的TAC)3,然后成神经细胞,为了嗅球(OB)通过星形胶质细胞的管迁移,最终分化成神经元4,5。神经干细胞和它们的后代被组织在专门的“利基市场”架构沿侧脑室,牵连因素控制其扩散6万千。 SVZ神经原细胞的分离和纯化是必要的,照亮其扩散的复杂分子的规定,但仍然很长一段时间了挑战,由于缺乏特异性标记物,并适于技术。
使用流量的新方法术已使可能的神经干细胞和兵卫的隔离- [R后代从成人的SVZ 2,7-11。利用干细胞标记法12以及成神经细胞标志物CD24 13和荧光EGF对增殖细胞2标签 EGFR,我们最近开发出一种FACS策略允许五个主要SVZ神经源性人口的净化:静态和激活的神经干细胞,总可捕量,不成熟以及迁移成神经细胞9。在这里,我们详细描述这种细胞分选技术,以及如何一个LEX / EGFR / CD24三重允许首次染色两者的静态和激活的神经干细胞的分离。
虽然神经发生成年时期仍然存在,生产新的神经元在大脑老化14急剧下降。大多数研究同意逐步减少在SGZ和SVZ 15-20增殖祖细胞的数量。其后果是不是无害的年龄有关的下降,神经发生在SVZ引发n的缩减ewborn神经元在老年人的大脑的嗅球,最终导致在嗅觉辨别减值老年小鼠18。阐明神经祖细胞的细胞周期动力学是了解衰老过程中成年神经的演变的基本机制的关键步骤。最近的研究已经调查了细胞周期成人神经干细胞和谱系进展体外 21 和体内22但它们都没有利用了细胞分选技术和基因编码的荧光细胞周期的探针可视化分离的细胞的细胞周期阶段在单细胞水平。
这里,我们描述一个协议,取,其中将细胞在其细胞周期荧光转基因FUCCI小鼠的优势,使1克和SG 2 / M期23之间的区别。这个协议显示神经干细胞和它们的后代的自成人FUCCI英里如何准隔离策结合的时间推移的视频显微镜允许细胞周期动力学的在单细胞水平的研究。
本文所述的细胞分拣技术允许静止的NSCs,激活神经干细胞和它们的性质的其后代能够研究和动力学在成人脑9之间可靠歧视。再加上FUCCI技术,其允许在活细胞23的细胞周期进展的可视化,我们开发了一种快速和有效的技术,以跟随对G 1和SG 2 / M期的细胞周期从年轻成年和老年鼠脑细胞。
在这个协议中使用的细胞分拣技术是标记允许五个主要神经源性群体的纯化从SVZ 9的第一验证组合。这也是第一个验证的技术使静态和激活神经干细胞的区别。值得注意的是,该技术不要求使用转基因小鼠本身 ,当适于转基因小鼠模型ス这是必要的CH为FUCCI。从那时起,Codega的等人 10已经使用了GFAP-GFP / CD133 / EGFR三重标记组合来从他们的活化的对应物区分开的静态的神经干细胞,但它不能被适于FUCCI技术,因为它要求使用GFAP-GFP转基因小鼠。密歇根州等 11个国家制定了GLAST / EGFR / CD24三联标记策略共享,在这项研究中9所使用的技术共同作用的结果。事实上,在Daynac 等人已经发现lex和GLAST神经干细胞标志物之 间的高相关性,研究9。然而,在美国密歇根州等人的技术中使用的GLAST抗体偶联藻红蛋白,因此不能适用于与使用FUCCI红小鼠。
还有需要注意排序前SVZ细胞几个重要的技术点。首先,将解离的步骤是非常重要,因为脑组织必须被解离成单细胞,同时保留结构在完整性用于抗体的标记策略的蛋白质。 0.05%胰蛋白酶-EDTA已被证明是非常有效的解离SVZ组织27,但LEX抗原被认为是高度敏感的,因为几乎所有的LEX-FITC免疫荧光丢失了(数据未显示)。因此,木瓜蛋白酶,使用,因为它是更有效的和比对脑组织的其他蛋白酶破坏性较小。此外,无论是LEX也不表皮生长因子受体CD24也受到影响,木瓜蛋白酶处理。应当指出的是,抗体标记被更改,如果木瓜蛋白酶治疗超过15分钟。我们得到的最佳结果与机械分离(吸管上下20倍)相关的10分钟木瓜蛋白酶处理。
聚-D-赖氨酸涂层允许贴壁细胞的培养,并在培养数天形成菌落。现在人们普遍认为 ,在体外实验带有其局限性28,29。我们建议确定只有第一个细胞周期经历至少一个后续分裂细胞停留尽可能接近到体内细胞表型。
值得注意的是,提及的是,Geminin(绿色荧光)和CDT1(红色荧光)的蛋白质用于设计FUCCI 系统 23以前证明是大量由神经祖细胞表达在早期神经发生在小鼠中30和在成人脑组织9,25 。虽然mKO2-hCdt1(一百二十〇分之三十)构建体主要用在本研究遵循与红色荧光G1期,同时使用构建体[mKO2-hCdt1(一百二十零分之三十零)和MAG-hGem(110分之1) ]可以设想,以允许细胞周期的主要阶段的可视化(G 1和SG 2 / M)以及对G 1 / S转换23。双彩色成像的主要缺点是荧光的有限相容集,仍然可以用于细胞标记。一个解决方案是使用separati在列。例如,我们已经成功地从贫使用分离柱细胞CD24阳性细胞级分之前分类和活成像,因为我们使用的CD24-PE抗体共享比FUCCI -红色荧光25相同的发射波长。
很少有研究调查成年小鼠SVZ人口的细胞周期的长度。与我们的技术获得的总细胞周期长度接近一个通过Costa等人的 21估计在体外 ,但我们能够首次来区分不同的细胞周期阶段。 在体内研究中,蓬蒂等人 22使用胸苷类似物的掺入,以确定不同SVZ细胞群的增殖动力学。然而,它们既不能进行连续监测的细胞周期也不跟踪细胞在单细胞水平。这可能是因为它表明一个非均质性强存在机智的问题欣给定的SVZ细胞群体22,25。我们在这里描述的体外技术的替代,容易设置,它允许不同的成人神经源性群体的细胞周期阶段的实时成像在单个细胞水平。
了解神经干细胞和祖细胞的细胞周期的调节仍然是新的治疗方法中的老化或脑病症的上下文中的发展是一个挑战。因此我们的协议可具有广泛的应用。在老龄化的背景下,这种技术也被证明有助于了解对神经干细胞分化衰老的作用。事实上,这是可能的,以确定进入分化的神经干/祖细胞作为它们红色荧光强度是鲜明高出 26。最后,它也可能是感兴趣的利用连续实时成像在一个单细胞水平来研究负责谱系亲细胞内在的和外在的过程回归成人神经干细胞。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢为C茹贝尔,V诺伊维尔,V Barroca酒店,J Tilliet和动物的设施之外,所有的工作人员;到J Baijer和N Dechamps的细胞分选; O.艾蒂安技术援助,并答Gouret为她提供行政协助。流式细胞仪和细胞分选进行了在红外对抗流式细胞仪共享资源,通过设备赠款DIM茎极,INSERM,ARC基金会,并建立了CEA。这项工作是由法国电力公司(EDF)的资助。 MD有来自La法甲癌症中心和LM的奖学金从区域法兰西岛(DIM生物疗法)。马克 – 安德烈·Mouthon和弗朗索瓦D. Boussin份额共同高级作者。
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |