We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
Neuronale Stammzellen (NSC) in der Subventrikularzone der lateralen Ventrikel (SVZ) aufrechtzuerhalten olfaktorischen Neurogenese während des gesamten Lebens im Säugerhirn. Sie erzeugen nacheinander Transit Verstärken Zellen (TAC) und Neuroblasten, die in Neuronen zu differenzieren, sobald sie die Riechkolben zu integrieren. Schwellenfluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Techniken die Isolierung von NSCs und deren Nachkommen dürfen und haben begonnen, um Licht auf Genregulationsnetzwerken in Erwachsenen neurogenen Nischen zu vergießen. Wir berichten hier über eine Zellsortiertechnik, die zu verfolgen und zu unterscheiden, die den Zellzyklus Dynamik der oben erwähnten Zellpopulationen aus adulten SVZ mit LeX / EGFR / CD24 Dreifachfärbung ermöglicht. Isolierten Zellen werden dann als anhaftenden Zellen plattiert, um zu erkunden in Details ihrer Zellzyklusprogression durch Zeitraffervideomikroskopie. Hierzu verwenden wir transgene Fluorescence Ubiquitinierung Cell Cycle Indicator (Fucci) Mäusen, in denen Zellen sind rot fluoreszierend during G 1-Phase aufgrund eines G 1 spezifischen roten Cdt1 Reporter. Diese Methode wurde vor kurzem gezeigt, dass proliferierende NSCs ihren G1-Phase während der Alterung allmählich zu verlängern, was zu einer Beeinträchtigung der Neurogenese. Dieses Verfahren ist leicht umstellbar zu anderen Systemen und von großem Interesse für die Untersuchung der Zellzyklus-Dynamik von Hirnzellen im Rahmen der Hirnerkrankungen sein.
Ruhe neurale Stammzellen (NSCs) sind die Quelle für adulte Neurogenese 1 und kann in ihre proliferative konvertieren "aktiviert" Form Ausdruck der EGFR (aNSCs) 2. Einmal aktiviert, führen sie zu Transit Verstärken Zellen (TAC) 3 und Neuroblasten, die zu den Riechkolben (OB) wandern durch ein Rohr von Astrozyten und schließlich zu differenzieren zu Neuronen 4,5. NSCs und deren Nachkommen werden in spezialisierten "Nischen" Architekturen entlang der Seitenventrikel organisiert, impliziert eine Vielzahl von Faktoren, die ihre Proliferation 6. Die Isolierung und Reinigung des SVZ neurogener Zellen notwendig ist, die komplexen molekularen Regulierung ihrer Vermehrung zu beleuchten, aber eine Herausforderung für eine lange Zeit aufgrund des Fehlens von spezifischen Markern und von angepassten Techniken blieben.
Neue Ansätze mittels Durchflusszytometrie wurden die Isolierung von NSCs und thei möglich gemachtr Nachkommenschaft aus adulten SVZ 2,7-11. Unter Verwendung der Stammzellmarker LeX 12 zusammen mit Neuroblast Marker CD24 13 und einem Fluoreszenz-EGF an EGFR auf proliferierende Zellen 2 zu kennzeichnen, die wir vor kurzem eine FACS-Strategie ermöglicht die Reinigung von fünf der wichtigsten SVZ neurogene Bevölkerung: ruhenden und aktivierten NSCs, TAC, unreifen als auch die Migration Neuroblasten 9. Hier beschreiben wir in Details dieses Zellsortiertechnik und wie lex / EGFR / CD24 Dreifachfärbung zum ersten Mal erlaubt die Isolierung von sowohl ruhenden und aktivierten NSCs.
Obwohl die Neurogenese im Erwachsenenalter bestehen bleibt, ist die Produktion von neuen Neuronen drastisch im alternden Gehirn 14 verringert. Die meisten Studien sich auf eine fortschreitende Verminderung der Anzahl proliferierender Vorläuferzellen in der SGZ und SVZ 15-20. Die Folgen sind nicht harmlos wie die altersbedingten Rückgang der Neurogenese im SVZ provoziert eine Verminderung der newborn Neuronen im Riechkolben des gealterten Gehirn, letztlich zu einer Beeinträchtigung in olfaktorischen Diskriminierung führt in alten Mäusen 18. Aufklärung Zellzykluskinetik von neuralen Vorläuferzellen ist ein wichtiger Schritt, um die Mechanismen der Entwicklung der adulten Neurogenese während der Alterung zugrunde zu verstehen. Jüngste Studien haben in den Zellzyklus und Abstammung Progression von adulten neuralen Stammzellen in vitro 21 und in vivo 22 untersucht, aber keine von ihnen nutzten Zellsortiertechniken und genetisch kodierte Fluoreszenzzellzyklus-Sonden, die Zellzyklusphasen von isolierten Zellen sichtbar bei einer Einzelzellebene.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Vorteile der transgenen Fucci Mäusen, bei denen Zellen während ihres Zellzyklus fluoreszierend, so dass der Unterschied zwischen G 1 und SG 2 / M-Phasen 23. Dieses Protokoll zeigt, wie potenzielle Isolierung von NSCs und deren Nachkommen aus adulten Fucci mice kombiniert mit Zeitraffer-Video-Mikroskopie ermöglicht die Untersuchung der Zellzyklusdynamik bei einer Einzelzellebene.
Die hierin beschriebenen Zellsortiertechnik erlaubt eine sichere Unterscheidung zwischen Ruhe NSC, Aktiv NSC und deren Nachkommen ermöglicht Untersuchungen ihrer Eigenschaften und Dynamik im erwachsenen Gehirn 9. Mit der Fucci Technologie, die die Visualisierung der Zellzyklus-Progression in lebenden Zellen 23 erlaubt gekoppelt entwickelten wir eine schnelle und effiziente Technik, um die G 1 und SG 2 / M-Phasen des Zellzyklus von der jungen erwachsenen und alten Mausgehirnzellen folgen.
Die Zellsortiertechnik in diesem Protokoll verwendet das erste validiert Kombination von Markern ermöglicht die Reinigung der fünf Haupt neurogener Populationen vom SVZ 9. Es war auch das erste validierte Methode ermöglicht die Unterscheidung von ruhenden und aktivierten NSCs. Es ist bemerkenswert, dass diese Technik nicht die Verwendung von transgenen Mäusen, per se, die, wenn transgene Mausmodelle so angepasst ist notwendig erfordernch als Fucci. Seitdem Codega et al. 10 eine GFAP-GFP / CD133 / EGFR triple Kennzeichnung Kombination zur Ruhe NSC aus ihrer aktivierten Gegenstück zu unterscheiden, aber es kann nicht auf Fucci Technik angepasst werden, da es die Verwendung von GFAP-GFP-transgenen Mäusen benötigt. Mich et al. 11 haben eine Glast / EGFR / CD24 Dreifachmarkierungsstrategie, die gemeinsamen Ergebnisse mit der Technik, die in dieser Studie verwendet 9 teilt entwickelt. In der Tat wurde eine hohe Korrelation zwischen LeX und Glast NSCs Marker bereits Daynac et al. Untersuchen 9. Jedoch wird die in der Mich et al. Verwendeten Technik Glast Antikörper gekoppelt Phycoerythrin und kann daher nicht mit dem Einsatz von Fucci-Red Mäuse angepasst werden.
Es gibt mehrere wichtige technische Punkte, die Aufmerksamkeit erfordern vor dem Sortieren SVZ Zellen. Erstens ist der Dissoziationsschritt sehr wichtig, da das Hirngewebe hat, in einzelne Zellen dissoziiert werden und gleichzeitig die strukturelle inIntegrität der für die Antikörpermarkierung Strategie verwendeten Proteine. 0,05% Trypsin-EDTA hat sich gezeigt, als sehr wirksam bei distanziert SVZ Gewebe 27, aber der Lex-Antigen wurde festgestellt, hochempfindliche, wie fast alle LeX-FITC Immunfluoreszenz war verloren (Daten nicht gezeigt) sein. Somit wurde Papain verwendet, da es effizienter war und weniger destruktiv als andere Proteasen auf Hirngewebe. Darüber hinaus wurden weder LeX noch EGFR noch CD24 durch Papain-Behandlung nicht beeinflusst. Es sei darauf hingewiesen, dass die Antikörpermarkierung wurde verändert, wenn die Papain-Behandlung mehr als 15 min betragen. Wir erhalten ein optimales Ergebnis mit einem 10 min Papain-Behandlung mit einem mechanischen Dissoziation (Pipette nach oben und unten 20-mal) zugeordnet ist.
Die Poly-D-Lysin-Beschichtung ermöglicht adhärente Zellen und die Bildung von Kolonien nach mehreren Tagen in Kultur. Es ist jetzt allgemein akzeptiert, dass in vitro-Tests wird mit ihren Begrenzungen 28,29. Wir empfehlen die Bestimmung nur den ersten Zellzyklus fürdie Zellen, die zumindest eine nachfolgende Teilung so nahe wie möglich an der in vivo Zell-Phänotyp zu bleiben.
Es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass die Geminin (grüne Fluoreszenz) und Cdt1 (rote Fluoreszenz) Proteine verwendet, um die Fucci System 23 wurden zuvor gezeigt reichlich von neuralen Vorläuferzellen exprimiert werden während der frühen Neurogenese bei Mäusen 30 und in der Erwachsenenhirngewebe 9,25 entwerfen . Obwohl die mKO2-hCdt1 (30/120) Konstrukt wurde hauptsächlich in der vorliegenden Studie verwendet, die G1 Phase mit roter Fluoreszenz zu folgen, die Verwendung beider Konstrukte [mKO2-hCdt1 (30/120) und MAG-hGem (1/110) ] könnte in Betracht gezogen werden, um die Visualisierung der Hauptphasen des Zellzyklus (G 1 und SG 2 / M) sowie der G 1 / S-Übergang 23 zu ermöglichen. Der Hauptnachteil des Zweifarbenbilder ist die begrenzte kompatible Sätze von Fluoreszenz, die noch für die Markierung von Zellen verwendet werden kann. Eine Lösung ist die Verwendung separatiauf Säulen. ZB haben wir erfolgreich die CD24-positive Fraktion von Zellen unter Verwendung von Trennsäulen vor abgereicherte Zellsortierung und Live-Bildgebung verwendeten wir eine CD24-PE-Antikörper, die die gleiche Emissionswellenlänge als der Fucci-rote Fluoreszenz 25 geteilt.
Nur wenige Studien haben den Zellzyklus Länge der erwachsenen Maus SVZ Populationen untersucht. Die mit unseren Technik erhaltenen Gesamtzellzykluslänge in der Nähe des einen in vitro durch Costa et al. 21 geschätzt, aber wir waren zum ersten Mal, um die verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden in der Lage. In einem in vivo-Untersuchung, Ponti et al. 22 verwendet den Einbau von Thymidin-Analoga, die Proliferation Dynamik der verschiedenen SVZ Zellpopulationen zu bestimmen. Allerdings konnte sie weder führen eine kontinuierliche Überwachung des Zellzyklus, noch verfolgen die Zellen an der Einzelzellebene. Dies könnte ein Problem sein, da es sich gezeigt, dass eine starke Heterogenität existiert witHin eine gegebene SVZ Zellpopulation 22,25. Wir beschreiben hier eine Alternative in vitro-Technik, einfach zu installieren, die die Live-Bildgebung der Zellzyklusphasen von verschiedenen Erwachsenen neurogene Bevölkerung bei einer Einzelzellebene ermöglicht.
Das Verständnis der Regulation des Zellzyklus der neuralen Stammzellen und Progenitoren vor eine Herausforderung für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze im Zusammenhang mit der Alterung oder Hirnerkrankungen. Unser Protokoll kann somit über eine breite Palette von Anwendungen. Im Zusammenhang mit der Alterung, könnte diese Technik auch als nützlich erweisen, um die Auswirkungen des Alterns auf NSC Differenzierung zu verstehen. Tatsächlich ist es möglich, neurale Stammzellen / Vorläuferzellen Eingabe Differenzierung zu identifizieren, wie die roten Fluoreszenzintensität ist deutlich höher 26. Schließlich könnte es auch von Interesse sein, die kontinuierliche Echtzeit-Bildgebung bei einer Einzelzellebene zu nutzen, um die Zelle intrinsische und extrinsische Prozesse für die Linie pro verantwortlich studierenSchreiten der Erwachsenen NSCs.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind auf C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet und alle Mitarbeiter von Tiereinrichtungen verschuldet; J Baijer und N Dechamps für Zellsortierung; O. Etienne für die technische Unterstützung, und A. Gouret für ihre administrative Unterstützung. Durchflusszytometrie und Zellsortierung wurden am IRCM Durchflusszytometrie Shared Resource durchgeführt, die von Geräten Zuschüsse von DIM-Stem-polig, INSERM, Fondation ARC und CEA etabliert. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Electricité de France (EDF) unterstützt. MD hat eine Gemeinschaft von La Ligue Contre le Cancer und LM von Region Ile-de-France (DIM Biotherapeutika). Marc-André Mouthon und François D. Boussin Anteil Co-Senior-Autorschaft.
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |