We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
Vi har udviklet en protokol forbedre strøm embryoide Krop (EB) kultur, der tillader studiet af selvorganisering, symmetribrud, aksial forlængelse og celle skæbne specifikation hjælp aggregater af muse embryonale stamceller (mESCs) i suspension kultur. Lille antal mESCs aggregeres i basalt medium i 48 timer i ikke-cellekultur-behandlede, U-bund 96 brønde, hvorefter de er kompetente til at reagere på eksperimentelle signaler. Efter behandling, begynder disse aggregater at vise tegn på polariseret genekspression og gradvist ændrer deres morfologi fra en sfærisk masse af celler til en aflang, velorganiseret struktur i fravær af eksterne asymmetri signaler. Disse strukturer er ikke kun i stand til at vise markører for de tre kimlag, men aktivt vise gastrulation-lignende bevægelser, der repræsenteres ved et retningsbestemt forskydning af individuelle celler fra aggregatet, som har en afgørende forekommer ved et område af den aflange struktur. Denne protocol giver en detaljeret metode til reproducerbar dannelsen af disse aggregater, deres stimulering med signaler såsom Wnt / β-Catenin aktivering og BMP hæmning og deres analyse ved en enkelt gang-point eller tidsforskudt fluorescerende mikroskopi. Desuden beskriver vi ændringer af de nuværende hel-mount mouse embryo farvningsprocedurer for immuncytokemisk analyse af specifikke markører indenfor faste aggregater. Ændringerne i morfologi, genekspression og længden af aggregaterne kan måles kvantitativt, at give oplysninger om, hvordan signaler kan ændre aksiale skæbner. Det forventes, at dette system kan anvendes både til studiet af tidlige udviklingsmæssige begivenheder såsom aksial udvikling og organisering, og mere bredt, de processer af selvorganisering og cellulære beslutningstagning. Det kan også tilvejebringe en egnet niche til frembringelse af celletyper til stede i embryoet som er uopnåelige fra konventionel klæbende kultur som rygmarv og motoriske neuroner.
Undersøgelsen og forståelse af celle-skæbne beslutninger i tidlige udvikling pattedyr kan gøre brug af kulturer af embryonale stamceller (EKSF), klonpopulationer afledt af blastocyster, der har evnen til selv at forny og differentiere til alle celletyper i en organisme ie., de er pluripotente 1,2. Mens disse kulturer har været og fortsat være nyttige for forståelsen af den molekylære basis for celle-skæbne beslutninger, er de i stand til at gengive nogle af de rumlige arrangementer og globale adfærd, der genereres i fostre under gastrulation. I fosteret, processen med gastrulation forvandler et enkelt epithellaget i de tre særskilte kimlag og forlener embryo med en åbenlys anteroposterior organisation 3-5. Forsøg på at rekapitulere disse begivenheder ex vivo har været baseret på genereringen af tredimensionelle aggregater af økonomiske og sociale råd, kaldet embryoide organer (EBS), og udsætte dem to differentieringstilstande 6,7. Disse aggregater kan lokkes til at differentiere til mange forskellige celletyper, hvoraf nogle er enten ude af stand til at opnå eller induceret med lav effektivitet i vedhængende kultur eller ikke kan produceres på alle;. Fx, blod 8 og primordiale kønsceller 9. En begrænsning i brugen af EB'er er imidlertid, at de ikke kan vise den morfogenetiske adfærd, kim lag distribution eller aksial organisation, der er vigtige egenskaber for det udviklende foster, hvilket resulterer i rumlig forvaltningsmæssigt 6,10. I en rapport, behandling af EB'er med Wnt fører til en svag polarisering i genekspression i nogle aggregater, men observeres nogen klar morfogenese 7. I nyere rapporter, EBS, der er dyrket i længere perioder udvikle anteriore strukturer såsom nethinder, cortex og indre øre sensoriske celler, som efterligner deres embryonale modparter, men udvikle sig uden for rammerne af en aksial organization 11-13.
En rapport fra Marikawa et al. 14, mens de arbejder med aggregater af mus P19 Embryo karcinom (EF) celler dannet ved hængning slip-metoden, rapporterede fremkomsten af langstrakte strukturer mesodermal oprindelse minder om forlængelserne, der er observeret med exogastrulae i padder og søpindsvin embryoner og Keller explanter 15-18. Da dette ikke var blevet observeret med mus embryonale stamceller (mESCs), vi forsøgte at gengive adfærden observeret med P19 EC-celler under anvendelse af aggregater af mESCs 19 og vi rapporterer dyrkningsbetingelser, der fører til deres symmetribrud og aksial forlængelse. En vigtig forskel fra arbejdet med P19 celler er, at aggregeringen protokollen beskrevet her udføres i en 96-brønds plade, der svarer til den beskrevet af Eiraku et al. 20, i stedet for at hænge dråber. Denne ændring medførte en øget effektivitet i form af samlede genopretning og i bådeinden for og mellem eksperimentelle reproducerbarhed. Vigtigere er det, at opretholde aggregater i individuelle brønde sikrer, at fusion mellem aggregater (fælles, når pooling aggregater fra hængende dråber) ikke forekommer. Hertil kommer, et centralt element i protokollen er 24 timers eksponering for GSK3 hæmmeren CHI99021 (Chi), en potent aktivator af Wnt / β-Catenin signalering, efter sammenlægning.
Den her beskrevne metode giver et grundlag for at forstå processerne i selvorganisering, aksial organisation og kim lag specifikation i kultur, så slutninger, der skal foretages vedrørende aksial udvikling in vivo 19,21. Af disse grunde metoden har potentiale til at tillade detaljeret mekanistisk analyse af processer, der kan være svære at studere i embryoet. Desuden er en mulig anvendelse er i dannelsen af væv og organer, der ikke er let tilgængelige i vedhængende kultur på grund af manglen på en struktureret cellulært niche såsomrygmarven forstadier 21 og motoriske neuroner. Tredimensionale aggregerede kultur giver en fysisk struktur og signalering miljø, kan muligvis ikke nås ved konventionelle metoder, hvilket fører til en ny tilgang til afledning af embryoniske afstamninger i et rumligt organiseret måde.
Teknikken er beskrevet i dette manuskript effektivt og reproducerbart frembringer aggregater af muse embryonale stamceller (mESCs), som display organiseret symmetri-breaking og forlængelse 19, der kombinerer både hængende dråbe kultur beskrevet af Marikawa et al. 14 og EB formation. Disse aggregater gå på at udvikle aksiale forlængelser, der supplerer de eksisterende metoder til generering af forreste organer fra ES-celler, såsom optiske bægre 11 og hjernebarken 13, og indeholder celler med identitet tre kimlag som display processer svarende til dem i løbet af gastrulation såsom hurtigt cellebevægelse 19,21.
Det er interessant at spekulere om karakteren af den symmetri-breaking begivenhed, da det forekommer i fravær af eksterne mønsterdannende væv og zygotisk asymmetri tidskoder 19. Den spontane dannelse af en rudimentær akse kan opstå fra allerede eksisterende heterogeneities i udgangs-kulturen af celler, som danner grundlag for udviklingen af asymmetri. Faktisk populationer af celler dyrket i ESLIF betingelser vise en blanding af selvfornyende og differentiere celler, kan de relative andele af som varierer fra den ene aggregat til en anden. Desuden indledende arbejde i vores laboratorium viser, at aggregater fra en helt pluripotente population af celler viser forsinket udvikling og defekter i mønster, hvilket tyder på en rolle for heterogenitet i mønsterdannelse organiseret (DA Turner & A. Martinez Arias, under forberedelse). Det er også værd at overveje, at en reaktion-diffusionsmekanisme kan generere det mønster, med diffusion af en inhibitor bort fra overfladen af aggregatet. Warmflash et al. 41 tyder på, at en sådan mekanisme kunne være ansvarlig for udvikling radial asymmetri i vedhængende kultur, hvilket gør det en mulig kandidat til mønsterdannelse i tre dimensioner.
Under initial 48 timers sammenlægning periode, celler nå en tilstand, der svarer til den i implantation epiblasten, hvor de er kompetente til at reagere på signaler fra det sekundære medium 19,21,24. Typisk protokollen beskrevet her giver celler med en impuls af sekundære medium, der indeholder faktorer (såsom Wnt / β-catenin-agonister), som giver de signaler der er tilstrækkelige til forlængelse. Tidligere kultur metoderne beskrevet af Lancaster et al. (Anvendelse af humane ESC 13) og Eiraku et al. (Med mESCs 11) anvendes en kort periode aggregering i lav friktionskoefficient 96-brønds plader før aggregerede celler blev overført til Matrigel dråber for on- gå kultur. Selvom tiden mellem aggregering og Matrigel indsættelse var forskellig mellem undersøgelserne, i begge tilfælde et stort antal celler blev anvendt til aggregatdannelse (ca. 3,000-4,500 celler). Derimod protokollen beskrevet her 19 bruger langt færre celler (ca. 400 cellerper aggregat), som er bestemt til at være helt afgørende i processen med forlængelse, symmetri-breaking og polarisering, der er observeret 19. Desuden er disse langstrakte strukturer er i stand til at blive genereret i et meget kortere tidsrum uden indlejring i kunstige matricer Sammenlign dannelsen af definerede områder af hjernen af Lancaster et al (> 20-30 dage) 13 og optiske kopper fra Eiraku. et al. (~ 11 dage) 11 med de 5 dage, der er nødvendige til frembringelse af polariserede langstrakte strukturer.
En af begrænsningerne med her beskrevne imidlertid dyrkningsmetode, er, at de kun kan dyrkes i ca. 5-6 dage efter udpladning, indtil deres størrelse gør dem kompetente ved hjælp af tyngdekraften til at synke til bunden af brøndene, og tvinge en vedhæftning selv på ikke overtrukne plast-ware. Yderligere eksperimenter ved hjælp af kunstige matricer såsom dem tidligere nævnt, kan tillade os at øge den periodeobservation og eksperimenter, og der arbejdes løbende for at bestemme virkningerne af begrænse aggregaterne på en sådan måde. En yderligere begrænsning ved denne teknik er, at for at ændre mediet uden at fjerne aggregaterne, skal et lille volumen af mediet tilbage i bunden af brønden. Konsekvenserne for kemiske genetik metoder er behovet for at overveje denne fortynding og eventuelle eftervirkninger fra tidligere medier: på dagen for de 3 uM Chi puls, er 2,37 uM løsning faktisk leveres, og de efterfølgende mellemstore ændringer resulterer i en fremførsel af 0,499 uM (72-96 timer) og 0,105 pM (96-120 time) mellem tidspunkter. Nuværende arbejde har ikke korrigeret for fortynding og det antages, at de daglige mellemstore ændringer vil minimere eftervirkninger.
Der er en række kritiske trin i protokollen for at sikre både inden for og mellem eksperimentelle reproducerbarhed. For det første skal den start kultur mESCs være godt vedligeholdt og ikke over confluent og medium bør altid være god kvalitet ie., frisk og blandet godt (figur 5A, B). Dårlige dyrkningsbetingelser negativ indvirkning sammenlægning (Figur 5Bi). Præcis tælling af celler for at opnå en ~ 400 celler / 40 pi cellesuspension er afgørende, som større aggregater undlader at selv-organisere og er mere tilbøjelige til at danne dobbelte aggregater inden for hver brønd (figur 5Bii) mens mindre aggregater ikke er i stand til at nå den korrekte tæthed, hvor de er i stand til at reagere på stimulus (Figur 5Biii). Et vigtigt optimering skridt var indføjelsen af en anden PBS vask, der fjerner forurenende serum fra cellesuspensionen (Trin 2.6); dette forbedrede sammenlægning frekvens og fremskyndet udviklingen af aggregaterne med ca. 24 timer. Dernæst sikrer udskiftning af medium anvendes med tilstrækkelig kraft for at løsne eventuelle aggregater, der har potentiale til at klæbe til overfladen af brønden; undladelse results i aggregaterne 'nedbrud' (Figur 5Biv). Desuden og som tidligere nævnt (og nedenfor), er det vigtigt at sikre, at aggregaterne holdes i suspensionskultur og forhindres i at klæbe til en overflade. Når aggregaterne har levet, er mønsteret af genekspression og deres forlængelse potentiale afbrudt.
Da denne teknik er forholdsvis ligetil, og godt inden for rammerne af individer med gode cellekultur teknikker, kan de fleste af de problemer, der er forbundet med aggregering løses relativt hurtigt, hvis der følges disse kritiske trin; en fuld oversigt af fejlfinding er tilgængelig (tabel 1). Når beherskes, kan denne teknik anvendes til at studere aksiale udvikling, symmetribrud og celle-beslutning begivenheder. Mere specifikt disse aggregater har potentiale til at generere puljer af celler, der hidtil har været utilgængelig i kultur, såsom rygmarven og motoR neuroner.
Etisk Bemærk: Det skal bemærkes, med behørig forsigtighed, at oversættelsen af denne protokol til humane ES eller iPS cellekultur kunne bringe forsøgslederen tæt på retsgrundlaget for fjorten dage grænse for forskning i menneskelige embryoner, nemlig dannelsen af et primitivstriberne, som beskrevet i human fertilisering og embryologi Act 2008 (UK) 42. Da loven omfatter alle levende menneskelige embryoner uanset deres måde af skabelsen, vil dyrkning af humane gastruloids ud over den primitive-streak gerne scenen være uden for licensløsning forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er finansieret af et ERC Advanced Investigator Award til AMA (DAT, TB) med et bidrag på et projekt Grant fra Wellcome Trust til AMA, en EPSRC studentship til PB-J og Erasmus, Stichting dr. Hendrik Mullers Vaderlandsch Fonds og Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage til SCvdB. Vi vil gerne takke J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, og T. Rodriguez, for diskussioner og konstruktive kritik, Joaquin de Navascués for montering medium protokol og både AK Hadjantonakis og C. Budjan for at dele deres laboratoriets protokoller vedrørende farvning af hel-mount embryoner. En tidligere version af denne artikel er tidligere gjort tilgængelig på bioRxiv Preprint Server 29.
2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |