We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
Vi har utvecklat ett protokoll förbättra nuvarande Embryoid Body (EB) kultur som gör det möjligt att studera självorganisering, symmetribrott, axiella förlängningen och cell öde specifikation med aggregat av mus embryonala stamceller (mESCs) i suspensionskultur. Litet antal mESCs aggregeras i basalt medium under 48 timmar i icke-vävnadskulturbehandlade, U-bottnade 96-brunnsplattor, varefter de är behöriga att svara på experimentella signaler. Efter behandling, dessa aggregat börjar visa tecken på polariserad genuttryck och gradvis förändra deras morfologi från en sfärisk massa av celler till en långsträckt, väl organiserad struktur i frånvaro av externa asymmetri signaler. Dessa strukturer är inte bara kan visa markörer för de tre groddblad, men aktivt visa gastrulation liknande rörelser, framgår av en riktad förflyttning av enskilda celler från aggregatet, som avgörande sker vid en region av det långsträckta strukturen. Denna protocol ger en detaljerad metod för reproducerbar bildandet av dessa aggregat, deras stimulering med signaler såsom Wnt / β-catenin aktivering och BMP hämning och deras analys av enda tidspunkt eller tidsförlopp fluorescensmikroskopi. Dessutom beskriver vi ändringar av nuvarande hel-mount mus embryo färgningsprocedurer för immuncytokemisk analys av specifika markörer inom fasta aggregat. Förändringarna i morfologi, genuttryck och längd av aggregaten kan mätas kvantitativt, med information om hur signalerna kan förändra axiella öden. Det är tänkt att detta system kan användas både för att studera tidiga utvecklings evenemang såsom axiell utveckling och organisation, och mer allmänt, processerna för självorganisering och cellulära beslutsfattandet. Den kan även ge en lämplig nisch för generering av celltyper som är närvarande i embryot som är omöjliga att erhålla från konventionell vidhäftande kultur såsom ryggmärgen och motoriska neuron.
Studien och förståelse av cell öde beslut utveckling tidiga däggdjur kan utnyttja odlingar av embryonala stamceller (ESC), klonala populationer härledda från blastocyster som har förmågan att själv förnya och differentiera till alla celltyper i en organism dvs., de är pluripotenta 1,2. Även om dessa kulturer har varit och fortsätter att vara användbara för att förstå den molekylära grunden för cell öde beslut, de är oförmögna att återge några av de rumsliga arrangemang och globala beteenden som genereras i embryon under gastrulation. I embryot, processen för gastrulation omvandlar ett enda epitelskikt in i de tre distinkta groddblad och förser embryot med en uppenbar anteroposteriora organisation 3-5. Försök att rekapitulera dessa händelser ex vivo har baserats på alstringen av tre-dimensionella aggregat av ekonomiska och sociala råd, benämnd embryoidkroppar (EBS), och utsätta dem to differentieringsförhållanden 6,7. Dessa aggregat kan lirkade att differentiera till många olika celltyper, av vilka några är antingen inte kan erhållas eller framkallas med låg effektivitet i vidhäftande kulturen eller inte kan produceras alls,. T.ex., blod 8 och primordial könsceller 9. En begränsning av användningen av EBS är dock att de inte kan visa morfogenetiskt beteende, distribution GRODDBLAD eller axiell organisation som är viktiga egenskaper hos det växande embryot, vilket resulterar i fysisk desorganisation 6,10. I en rapport, behandling av EBS med Wnt leder till en svag polarisering i genuttryck i vissa aggregat men ingen tydlig morfogenes observeras 7. I senare rapporter, EBS som har odlats under längre tidsperioder utveckla främre strukturer såsom näthinnor, cortex och innerörat sensoriska celler, som efterliknar deras embryonala motsvarigheter men utvecklas utan samband med en axiell organizatjon 11-13.
En rapport från et al. Marikawa 14, samtidigt som man arbetar med aggregat av musen P19 Embryo cancer (EG) celler bildas genom hängande-släpp-metoden, rapporterade uppkomsten av långsträckta strukturer av mesodermalt ursprung påminner om förlängningar som observeras med exogastrulae i amfibie och sjöborre embryon och Keller Explantat 15-18. Eftersom detta inte hade observerats med mus embryonala stamceller (mESCs), försökte vi att återskapa problemet observeras med P19 EC-celler med hjälp av aggregat av mESCs 19 och vi rapporterar odlingsbetingelser som leder till deras symmetribrott och axiella förlängningen. En viktig skillnad från arbetet med P19-celler är att aggregationen Protokollet som beskrivs här utförs i en 96-brunnars platta, liknande den som beskrivits av et al. Eiraku 20, istället för att hänga droppar. Denna förändring resulterade i en ökad effektivitet när det gäller sammanlagd återhämtning och i bådainom och mellan experimentell reproducerbarhet. Det är viktigt att upprätthålla aggregat i enskilda brunnar säkerställer att fusion mellan aggregat (vanligt när sammanslagning aggregat från hängande droppar) inte förekommer. Dessutom är en viktig del av protokollet 24 timmar exponering för GSK3 hämmaren CHI99021 (Chi), en potent aktivator av Wnt / β-catenin signalering, efter aggregering.
Den metod som beskrivs här ger en grund för att förstå processerna för självorganisering, axial organisation och GRODDBLAD specifikation i kultur, vilket gör att slutsatser ska kunna fattas om axiell utveckling in vivo 19,21. Av dessa skäl metoden har potential att tillåta detaljerade mekanistiska analys av processer som kan vara svåra att studera i embryot. Dessutom är en potentiell tillämpning i genereringen av vävnader och organ som inte är lätt att få tag i vidhäftande kulturen på grund av avsaknaden av en strukturerad cellulär nisch såsomryggmärg prekursorer 21 och motoriska neuron. Tredimensionell samlade kulturen erbjuder en fysisk struktur och signalering miljö som kanske inte uppnås på konventionellt sätt, vilket leder till en ny strategi för härledning av embryonala linjer i ett rumsligt organiserat sätt.
Den teknik som beskrivs i detta manuskript effektivt och reproducerbart genererar aggregat av mus embryonala stamceller (mESCs) som displayen organiserad symmetri brytande och förlängning 19, som kombinerar både droppe kultur beskrivs av Marikawa et al. 14 och EB-uppställning. Dessa aggregat går på att utveckla axiella förlängningar, komplettera befintliga metoder för generering av främre organ från ES-celler såsom optiska koppar 11 och hjärnbarken 13, och innehåller celler med identiteter tre germinallager som display processer som liknar dem under gastrulation såsom snabb cellrörelse 19,21.
Det är intressant att spekulera om vilken typ av symmetri brytande händelse, eftersom det förekommer i frånvaro av externa mönstrings vävnader och zygotisk asymmetri Köer 19. Den spontana bildandet av en rudimentär axel kan uppstå från befintlig heterogeneities i startkultur av celler, som ligger till grund för utvecklingen av asymmetri. Faktum populationer av celler som odlats i ESLIF indikering en blandning av självförnyande och differentiering celler, kan de relativa proportionerna av vilka varierar från en aggregat till en annan. Vidare föreslår förberedande arbete i vårt laboratorium som aggregat från en helt pluripotenta population av celler visar försenad utveckling och brister i mönstring, vilket tyder på en roll för heterogenitet i organiserad mönsterbildning (DA Turner & A. Martinez Arias, som en förberedelse). Det är också värt att överväga att ett reaktionsinert diffusionsmekanism kan generera mönstret, med diffusion av en inhibitor bort från ytan av aggregatet. Warmflash et al. 41 tyder på att en sådan mekanism skulle kunna ansvara för att utveckla radiell asymmetri i vidhäftande kultur, vilket gör det till en möjlig kandidat för mönstring i tre dimensioner.
Under inil 48 h samlingsperioden, celler nå ett tillstånd som liknar den i postimplantationsförlust epiblast, där de är behöriga att svara på signaler från den sekundära mediet 19,21,24. Typiskt protokollet beskrivet här ger celler med en puls av sekundära mediet som innehåller faktorer (såsom Wnt / β-catenin agonister) som ger de signaler som är tillräckliga för töjning. Tidigare odlingsförfaranden beskrivna av Lancaster et al. (Med användning av humana ESC 13) och Eiraku et al., (Med mESCs 11) används en kort period av aggregation i lågvidhäftande 96-brunnsplattor innan aggregerade cellerna överfördes till Matrigel droppar för on- går kultur. Även tiden mellan aggregering och Matrigel insättningen var annorlunda mellan studierna, i båda fallen, var ett stort antal celler som används för aggregatbildning (ca 3,000-4,500 celler). Däremot beskrev protokollet här 19 använder betydligt färre celler (ca 400 cellerper aggregat) som har bestämts att vara absolut nödvändig för processen för töjning, symmetri brytande och polarisationen som observeras 19. Dessutom är dessa långsträckta strukturer kan genereras i en mycket kortare tidsperiod utan att bädda i artificiella matriser: jämföra generering av definierade områden i hjärnan från Lancaster et al (> 20-30 dagar) 13 och optiska koppar från Eiraku. et al., (~ 11 dagar) 11 med de 5 dagar som krävs för generering av polariserade långsträckta strukturer.
En av begränsningarna med odlings här beskrivna metoden är emellertid att de endast kan odlas under cirka 5-6 dagar efter utstrykning tills deras storlek gör dem kompetenta under gravitation att sjunka till botten av brunnarna och tvingar en vidhäftning även på icke -belagd plast-ware. Ytterligare experiment med användning av artificiella matriser såsom de som tidigare nämnts, kan tillåta oss att öka tiden förobservationer och experiment, och arbete pågår för att bestämma effekterna av att begränsa aggregaten på ett sådant sätt. En ytterligare begränsning med denna teknik är att för att ändra det medium utan att avlägsna aggregaten måste en liten volym av medium lämnas i botten av brunnen. Konsekvenserna för kemisk genetik tillvägagångssätt är behovet av att beakta denna utspädning och eventuella kvarstående effekter från tidigare medier: på dagen för tre iM Chi puls, är 2,37 iM lösning som faktiskt har levererats, och efterföljande medel förändringar resulterar i en överföring av 0,499 iM (72-96 timmar) och 0,105 iM (96-120 h) mellan tidpunkterna. Pågående arbete har inte korrigerat för spädning och det antas att dagliga medel förändringar kommer att minimera kvarstående effekter.
Det finns ett antal kritiska steg i protokollet att säkerställa både inom och mellan experimentell reproducerbarhet. För det första måste startkultur mESCs vara väl underhållna och inte över confluent, och mediet bör alltid vara god kvalitet dvs., färska och väl blandade (fig 5A, B). Dåliga odlingsbetingelser påverkar aggregering (Figur 5Bi) negativt. Exakt räkning av celler för att få en ~ 400 celler / 40 | il cellsuspension är viktigt, eftersom större aggregat inte själv organisera och är mer benägna att bilda dubbla aggregat inom varje brunn (Figur 5Bii) medan mindre aggregat inte kan nå rätt densitet där de har möjlighet att svara på den stimulans (figur 5Biii). En viktig optimeringssteget var införandet av en andra PBS-tvätt som avlägsnar förorenande serum från cellsuspensionen (steg 2,6); detta förbättrade aggregationen frekvensen och påskyndat utvecklingen av aggregaten med cirka 24 tim. Därefter säkerställer medel ändringar tillämpas med tillräcklig kraft för att få bort eventuella aggregat som har potential att hålla sig till ytan av brunnen; underlåtenhet att göra detta Results i aggregaten 'kraschar "(figur 5Biv). Dessutom, och som tidigare nämnts (och nedan), är det viktigt att säkerställa att aggregaten upprätthålls i suspensionskultur och förhindras från att vidhäfta till någon yta. När aggregaten har anslutit sig, är mönstret av genuttryck och deras förlängning potential störs.
Eftersom denna teknik är relativt enkelt, och väl inom ansvarsområdet för personer med goda vävnadsodlingstekniker, de flesta av de problem som är förknippade med aggregering kan lösas relativt snabbt om dessa kritiska steg följs; ett fullt bord med felsökning finns (Tabell 1). När behärskar, kan denna metod användas för att studera axiella utsträckning, symmetribrott och cell-beslutshändelser. Mer specifikt, dessa aggregat har potential att generera pooler av celler som hittills har varit tillgängliga i kultur, såsom ryggmärgen och motor-neuroner.
Etiska Obs: Det bör noteras med försiktighet att översättningen av detta protokoll till humana ES eller iPS cellodling kunde få försöks nära den rättsliga grunden för de fjorton dagar gränsen för forskning på mänskliga embryon, nämligen för att generera en primitivstrimman, som beskrivs i den mänskliga fertilisering och embryologi Act 2008 (UK) 42. Eftersom lagen omfattar alla levande mänskliga embryon oavsett deras sätt att skapa, skulle odling av humana gastruloids utanför primitiva strimman som scenen vara utanför ramen för tillståndspliktig forskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av en ERC Advanced Investigator Award till AMA (DAT, TB) med ett bidrag på en Projektbidrag från Wellcome Trust för att AMA, en EPSRC STUDENT till PB-J och Erasmus, Stichting dr. Hendrik Mullers Vaderlandsch Fonds och Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage till SCvdB. Vi vill tacka J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, och T. Rodriguez, för diskussioner och konstruktiva kritik, Joaquin de Navascués för monteringsmedium protokollet och både AK Hadjantonakis och C. Budjan för att dela deras laboratorium protokoll avseende färgning av hela-mount embryon. En tidigare version av denna artikel har tidigare gjorts tillgängliga på bioRxiv Preprint Server 29.
2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |