We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
हम वर्तमान embryoid शरीर (ईबी) आत्म संगठन के अध्ययन की अनुमति देता है, जो संस्कृति, समरूपता को तोड़ने, अक्षीय बढ़ाव और निलंबन संस्कृति में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) का समुच्चय का उपयोग करते हुए सेल भाग्य विनिर्देश में सुधार के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। MESCs की कम संख्या से वे प्रयोगात्मक संकेतों का जवाब करने के लिए सक्षम हैं, जिसके बाद गैर-ऊतक संस्कृति का इलाज, यू तली 96 अच्छी तरह प्लेटें, में 48 घंटे के लिए बेसल मध्यम में एकत्रित कर रहे हैं। उपचार के बाद, इन समुच्चय ध्रुवीकृत जीन अभिव्यक्ति के लक्षण दिखाने के और धीरे-धीरे बाहरी विषमता संकेतों के अभाव में एक लम्बी, अच्छी तरह से संगठित संरचना करने के लिए कोशिकाओं का एक गोलाकार जन से उनकी आकृति विज्ञान को बदलने के लिए शुरू करते हैं। इन संरचनाओं न केवल तीन रोगाणु परतों के मार्कर प्रदर्शित करने के लिए सक्षम हैं, लेकिन सक्रिय रूप से महत्वपूर्ण लम्बी संरचना की एक क्षेत्र में होता है, जो सकल, से व्यक्ति की कोशिकाओं के एक दिशात्मक dislodgement इसका सबूत है gastrulation जैसे आंदोलनों, प्रदर्शित करते हैं। इस protocराजभाषा इन समुच्चय की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गठन, ऐसे Wnt / β-catenin सक्रियण और बीएमपी निषेध और एकल समय बिंदु या समय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने विश्लेषण के रूप में संकेतों के साथ उनकी उत्तेजना के लिए एक विस्तृत तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, हम तय समुच्चय के भीतर विशिष्ट मार्कर के Immunocytochemical विश्लेषण के लिए वर्तमान पूरे माउंट माउस भ्रूण धुंधला प्रक्रियाओं के लिए संशोधन का वर्णन है। आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और समुच्चय की लंबाई में परिवर्तन मात्रात्मक संकेतों अक्षीय भाग्य बदल सकते हैं के बारे में जानकारी प्रदान करने, मापा जा सकता है। यह इस प्रणाली में इस तरह के अक्षीय विकास और संगठन के रूप में जल्दी विकास की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए दोनों लागू किया जा सकता है कि परिकल्पना की गई है, और अधिक मोटे तौर पर, आत्म संगठन और सेलुलर निर्णय लेने की प्रक्रियाओं। यह भी इस तरह के रीढ़ की हड्डी और मोटर neurones के रूप में पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति से नायाब हैं कि भ्रूण में मौजूद प्रकार की कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक उपयुक्त आला प्रदान कर सकता है।
जल्दी स्तनधारी विकास में अध्ययन और सेल भाग्य का निर्णय की समझ भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की संस्कृतियों (ESCs), नवीनीकृत और एक जीव की सभी प्रकार की कोशिकाओं में अंतर स्वयं करने की क्षमता है जो blastocysts से निकाली गई प्रतिरूप आबादी का उपयोग कर सकते हैं अर्थात्।, वे pluripotent 1,2 हैं। इन संस्कृतियों किया गया है और सेल भाग्य का निर्णय के आणविक आधार को समझने के लिए उपयोगी होने के लिए जारी कर रहे हैं, वे gastrulation दौरान भ्रूण में उत्पन्न कर रहे हैं कि स्थानिक व्यवस्था और वैश्विक व्यवहार में से कुछ को पुन: पेश करने में असमर्थ हैं। भ्रूण में, gastrulation की प्रक्रिया तीन अलग रोगाणु परतों में एक भी उपकला परत बदल देती है और एक खुला अग्रपश्च संगठन 3-5 के साथ भ्रूण endows। इन घटनाओं के पूर्व vivo पुनरावृत्ति करने के लिए प्रयास ESCs के तीन आयामी समुच्चय की पीढ़ी के आधार पर किया गया है, के रूप में embryoid निकायों (ईबीएस) करने के लिए भेजा है, और उन्हें टी subjectingभेदभाव की स्थिति 6.7 ओ। । जैसे, खून 8 और मौलिक जनन कोशिकाओं 9; ये समुच्चय प्राप्त या पक्षपाती संस्कृति में कम क्षमता के साथ प्रेरित किया जा सकते हैं या तो असमर्थ हैं या बिल्कुल भी उत्पादन नहीं किया जा सकता, जिनमें से कुछ कई विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए राजी कर लिया जा सकता है। ईबीएस के उपयोग में कमी, हालांकि वे स्थानिक विप्लव 6,10, जिसके परिणामस्वरूप विकासशील भ्रूण की प्रमुख विशेषताओं, कर रहे हैं कि मॉर्फ़ोजेनेटिक व्यवहार, रोगाणु परत वितरण या अक्षीय संगठन प्रदर्शित करने में असमर्थ रहे हैं। एक रिपोर्ट में, Wnt साथ ईबीएस के इलाज के कुछ समुच्चय में जीन की अभिव्यक्ति में एक कमजोर ध्रुवीकरण की ओर जाता है, लेकिन कोई स्पष्ट morphogenesis 7 मनाया जाता है। अधिक हाल की रिपोर्ट में, समय की विस्तारित अवधि के लिए संवर्धित किया गया है कि ईबीएस उनके भ्रूण समकक्षों की नकल, जो इस तरह रेटिना, छाल और भीतरी कान संवेदी कोशिकाओं के रूप में पूर्वकाल संरचनाओं को विकसित करने, लेकिन एक अक्षीय संगठनों के संदर्भ के बिना विकसितआयन 11-13।
की एक रिपोर्ट में Marikawa एट अल। 14, फांसी ड्रॉप विधि द्वारा गठित माउस P19 भ्रूण कार्सिनोमा (ईसी) की कोशिकाओं के समुच्चय के साथ काम कर रहा है, जबकि उभयचर में exogastrulae के साथ मनाया जाता है कि elongations की याद ताजा mesodermal मूल की लम्बी संरचनाओं के उद्भव सूचना दी और समुद्री साही भ्रूण और केलर 15-18 explants। इस माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) के साथ मनाया नहीं किया गया था के रूप में, हम P19 चुनाव आयोग कोशिकाओं mESCs 19 का समुच्चय का उपयोग कर के साथ मनाया व्यवहार को पुन: पेश करने का प्रयास किया और हम उनके तोड़ने समरूपता और अक्षीय बढ़ाव के लिए नेतृत्व कि संस्कृति की स्थिति की रिपोर्ट। P19 कोशिकाओं के साथ काम से एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि यहाँ वर्णित एकत्रीकरण प्रोटोकॉल के बजाय बूँदें फांसी की, Eiraku एट अल। 20 से वर्णित है कि इसी तरह एक 96 अच्छी तरह से थाली में किया जाता है। यह परिवर्तन कुल वसूली की और दोनों में मामले में एक वृद्धि की दक्षता में हुईअंतर और अंतर-प्रयोगात्मक reproducibility। उत्पन्न नहीं होती है (फांसी बूंदों से समुच्चय पूलिंग जब आम) महत्वपूर्ण बात है, व्यक्तिगत कुओं में समुच्चय को बनाए रखने के समुच्चय के बीच कि संलयन सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता एकत्रीकरण निम्नलिखित GSK3 अवरोध करनेवाला CHI99021 (ची), Wnt / β-catenin संकेतन का एक शक्तिशाली उत्प्रेरक, 24 घंटा के संपर्क में है।
यहाँ वर्णित विधि अनुमान विवो 19,21 में अक्षीय विकास के विषय में किए जाने के लिए अनुमति देता है, संस्कृति में आत्म संगठन, अक्षीय संगठन और रोगाणु परत विनिर्देश की प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक आधार प्रदान करता है। इन कारणों के लिए विधि भ्रूण में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है कि प्रक्रियाओं की विस्तृत यंत्रवत विश्लेषण की अनुमति देने की क्षमता है। इसके अलावा, एक संभावित आवेदन की वजह से एक संरचित सेलुलर आला की कमी के कारण इस तरह के रूप में करने के लिए पक्षपाती संस्कृति में आसानी से प्राप्य नहीं हैं कि ऊतकों और अंगों की पीढ़ी में हैरीढ़ की हड्डी में 21 और मोटर neurones व्यापारियों। तीन आयामी कुल संस्कृति एक स्थानिक संगठित तरीके से भ्रूण प्रजातियों की व्युत्पत्ति के लिए एक नया दृष्टिकोण के लिए अग्रणी, पारंपरिक तरीकों से प्राप्त नहीं हो सकता है कि एक शारीरिक संरचना और संकेत वातावरण प्रदान करता है।
इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक कुशलता और reproducibly Marikawa एट अल। 14 और ईबी गठन के द्वारा वर्णित दोनों फांसी ड्रॉप संस्कृति के संयोजन, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) कि प्रदर्शन का आयोजन किया समरूपता को तोड़ने और बढ़ाव 19 का समुच्चय उत्पन्न करता है। इन समुच्चय जैसे ऑप्टिक कप 11 और सेरेब्रल कॉर्टेक्स के रूप में 13 ते कोशिकाओं से पूर्वकाल अंगों की पीढ़ी के लिए मौजूदा तरीकों के पूरक, अक्षीय elongations को विकसित करने पर जाना है, और जो प्रदर्शन gastrulation दौरान उन लोगों के लिए इसी तरह की प्रक्रिया तीन रोगाणु परतों की पहचान के साथ सेल होते हैं ऐसे तेजी से सेल आंदोलन 19,21 के रूप में।
यह बाहरी patterning के ऊतकों के अभाव में होता है और युग्मज विषमता 19 cues, क्योंकि यह समरूपता तोड़ने घटना की प्रकृति पर सट्टा करने के लिए दिलचस्प है। एक अल्पविकसित अक्ष का सहज गठन पूर्व मौजूदा heterogen से पैदा हो सकता हैविषमता के विकास के लिए आधार के रूप में है, जो कोशिकाओं का मूल्य उस संस्कृति में eities। दरअसल, ESLIF की स्थिति में संवर्धित कोशिकाओं की आबादी स्वयं renewing और फर्क कोशिकाओं का एक मिश्रण प्रदर्शित करते हैं, जिनमें से रिश्तेदार अनुपात दूसरे के लिए एक समग्र से भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला में प्रारंभिक काम कोशिकाओं की एक पूर्ण pluripotent आबादी से समुच्चय (डीए टर्नर और तैयारी में ए मार्टिनेज एरियस,) का आयोजन पैटर्न गठन में विविधता के लिए एक भूमिका है, सुझाव patterning में देरी विकास और दोषों को पता चलता है कि पता चलता है। यह एक प्रतिक्रिया-प्रसार तंत्र दूर कुल की सतह से एक अवरोध करनेवाला के प्रसार के साथ, पैटर्न उत्पन्न हो सकता है कि विचार के लायक है। Warmflash एट अल। 41 एक ऐसी व्यवस्था है कि यह तीन आयामों में patterning के लिए एक संभावित उम्मीदवार बना रही है, पक्षपाती संस्कृति में रेडियल विषमता के विकास के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि सुझाव।
पहल के दौरानएल 48 घंटा एकत्रीकरण अवधि, कोशिकाओं वे माध्यमिक मध्यम 19,21,24 से संकेतों पर प्रतिक्रिया करने के लिए सक्षम हैं जिसमें postimplantation आद्यबहिर्जनस्तर, भीतर है कि इसी तरह के एक राज्य तक पहुँचने। आमतौर पर, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बढ़ाव के लिए पर्याप्त संकेत है कि उपलब्ध कराने के (जैसे Wnt / β-catenin एगोनिस्ट के रूप में) कारकों में शामिल है जो माध्यमिक माध्यम की एक नाड़ी के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है। लैंकेस्टर एट अल द्वारा वर्णित पिछला संस्कृति तरीकों। और (मानव ESCs 13 का उपयोग) Eiraku एट अल। (MESCs 11) के साथ एकत्रित कोशिकाओं ऑन के लिए Matrigel बूंदों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया 96 अच्छी तरह प्लेटें से पहले कम आसंजन में एकत्रीकरण की एक छोटी अवधि के लिए इस्तेमाल किया संस्कृति जा रहा है। एकत्रीकरण और Matrigel प्रविष्टि के बीच के समय पढ़ाई के बीच अलग था हालांकि, दोनों ही मामलों में, कोशिकाओं की बड़ी संख्या कुल गठन (लगभग 3,000-4,500 कोशिकाओं) के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके विपरीत, प्रोटोकॉल 19 अब तक कम कोशिकाओं (लगभग 400 कोशिकाओं का उपयोग करता यहाँ वर्णितबढ़ाव, समरूपता को तोड़ने और 19 मनाया जाता है कि ध्रुवीकरण की प्रक्रिया के लिए बिल्कुल जरूरी होने के लिए निर्धारित किया गया है जो कुल) के अनुसार। इसके अलावा, इन लम्बी संरचनाओं कृत्रिम matrices में एम्बेड करने के बिना एक बहुत कम समय अवधि में उत्पन्न किया जा करने में सक्षम हैं: लैंकेस्टर एट अल द्वारा परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों की पीढ़ी की तुलना (> 20-30 दिन) Eiraku से 13 और ऑप्टिक कप। एट अल। (~ 11 दिन) ध्रुवीकृत लम्बी संरचनाओं की पीढ़ी के लिए आवश्यक 5 दिन के साथ 11।
हालांकि यहां वर्णित संस्कृति विधि के साथ सीमाओं में से एक है, उनके आकार कुओं के नीचे सिंक और गैर पर भी एक आसंजन के लिए मजबूर करने के लिए गंभीरता के तहत उन्हें सक्षम renders जब तक वे केवल चढ़ाना पोस्ट लगभग 5-6 दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है कि लेपित प्लास्टिक के बर्तन। ऐसे में पहले उल्लेख किया उन लोगों के रूप में कृत्रिम मेट्रिसेस का उपयोग करते हुए आगे के प्रयोगों, हमें की अवधि बढ़ाने के लिए अनुमति दे सकता हैअवलोकन और प्रयोग, और काम पर जा रहे इस तरीके से समुच्चय में बाधा के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए है। इस तकनीक का एक और सीमा समुच्चय को हटाने के बिना मध्यम बदलने के क्रम में, मध्यम की एक छोटी मात्रा अच्छी तरह से नीचे में छोड़ दिया जाना चाहिए। रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण के लिए परिणाम यह कमजोर पड़ने और पिछले मीडिया से किसी भी अवशिष्ट प्रभाव पर विचार करने की जरूरत है: 3 सुक्ष्ममापी ची नाड़ी के दिन पर, 2.37 माइक्रोन के समाधान वास्तव में वितरित, और बाद में मध्यम परिवर्तन 0.499 के एक कैरी ओवर में परिणाम है माइक्रोन (72-96 घंटा) है और यह समय बिंदुओं के बीच 0.105 माइक्रोन (96-120 घंटा)। वर्तमान काम कमजोर पड़ने के लिए सही नहीं है और यह दैनिक मध्यम परिवर्तन अवशिष्ट प्रभाव को कम कर देंगे कि माना जाता है।
अंतर और अंतर-प्रयोगात्मक दोनों reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, mESCs के शुरू संस्कृति में अच्छी तरह से बनाए रखा है और नहीं सह से अधिक होना चाहिएnfluent, और मध्यम हमेशा अच्छी गुणवत्ता यानी होना चाहिए।, ताजा और अच्छी तरह से मिश्रित (चित्रा 5 ए, बी)। गरीब संस्कृति की स्थिति पर प्रतिकूल एकत्रीकरण (चित्रा 5Bi) प्रभावित करते हैं। बड़ा समुच्चय के लिए असफल के रूप में एक ~ 400 कोशिकाओं / 40 μl सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की सटीक गिनती आवश्यक है, स्वयं को व्यवस्थित और छोटे समुच्चय सही नहीं पहुंच पा रहे हैं, जबकि प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 5Bii) के भीतर डबल समुच्चय के रूप में होने की संभावना है वे प्रोत्साहन (चित्रा 5Biii) के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम होते हैं जहां घनत्व। एक प्रमुख अनुकूलन कदम सेल निलंबन से दूषित पदार्थों सीरम निकालता है कि एक दूसरे पीबीएस धोने (2.6 चरण) को शामिल किया गया; इस एकत्रीकरण आवृत्ति सुधार हुआ है और लगभग 24 घंटे से समुच्चय के विकास को त्वरित। इसके बाद, यह सुनिश्चित करने के माध्यम के परिवर्तन के साथ-साथ की सतह का पालन करने की क्षमता है कि किसी भी समुच्चय को बेदखल करने के लिए पर्याप्त बल के साथ लागू कर रहे हैं; इसलिए resu ऐसा करने में विफलतासमुच्चय 'दुर्घटनाग्रस्त' (चित्रा 5Biv) में एलटीएस। (और नीचे) जैसा कि पहले उल्लेख इसके अलावा, और, यह समुच्चय निलंबन संस्कृति में रखा जाता है और किसी भी सतह का पालन करने से रोका जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। समुच्चय पालन किया है एक बार, जीन अभिव्यक्ति और उनके बढ़ाव क्षमता का पैटर्न बाधित कर रहे हैं।
इस तकनीक अपेक्षाकृत सरल है, और अच्छी तरह से अच्छा ऊतक संस्कृति तकनीक के साथ व्यक्तियों के परिहार के भीतर है, एकत्रीकरण के साथ जुड़े समस्याओं के अधिकांश अपेक्षाकृत तेजी से इन महत्वपूर्ण कदम का पालन कर रहे हैं, तो हल किया जा सकता है; मुसीबत शूटिंग का एक पूरा तालिका उपलब्ध (तालिका 1) है। में महारत हासिल करने के बाद, इस तकनीक का अक्षीय विकास, समरूपता को तोड़ने और सेल निर्णय घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिक विशेष रूप से, इन समुच्चय इस तरह के रीढ़ की हड्डी और मोटो के रूप में अब तक संस्कृति में उपलब्ध नहीं किया गया है कि कोशिकाओं के पूल, उत्पन्न करने की क्षमता हैआर neurones।
एथिकल नोट: यह मानव ते या आईपीएस सेल संस्कृति के लिए इस प्रोटोकॉल का अनुवाद करीब मानव भ्रूण शोध पर चौदह दिन की सीमा, एक आदिम लकीर के अर्थात् पीढ़ी के कानूनी आधार के लिए प्रयोगकर्ता ला सकता है की वजह से सावधानी के साथ ध्यान दिया जाना चाहिए, मानव निषेचन और भ्रूणविज्ञान अधिनियम 2008 (ब्रिटेन) 42 में विस्तृत रूप में। अधिनियम की परवाह किए बिना सृष्टि के अपने तरीके के सभी जीवित मानव भ्रूण को शामिल किया गया के बाद से, चरण की तरह आदिम-लकीर से परे मानव gastruloids की संस्कृति लाइसेंस अनुसंधान के दायरे से बाहर होगा।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के एएमए, पीबी जम्मू और इरास्मस, Stichting डॉ करने के लिए एक EPSRC छात्रवृत्ति के लिए वेलकम ट्रस्ट से एक परियोजना अनुदान के योगदान के साथ ए एम ए करने के लिए एक ईआरसी उन्नत अन्वेषक पुरस्कार (डीएटी, टीबी) द्वारा वित्त पोषित है। SCvdB को हेंड्रिक मुलर के Vaderlandsch Fonds और Fundatie वैन डे Vrijvrouwe वैन Renswoude ते 's-Gravenhage। हम चर्चा और रचनात्मक आलोचनाओं के लिए, जे Briscoe, एस MUNOZ-Descalzo, सी Schroeter, और टी रोड्रिगेज का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, बढ़ते मध्यम प्रोटोकॉल के लिए जोकिन डे Navascués और दोनों एके Hadjantonakis और सी Budjan उनकी प्रयोगशाला के प्रोटोकॉल को बांटने के लिए पूरे माउंट भ्रूण का धुंधला करने के लिए संबंधित। इस लेख के एक पहले संस्करण पहले से bioRxiv प्रीप्रिंट सर्वर 29 पर उपलब्ध कराया गया था।
2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |