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Biology

प्रतियोगिता assays का उपयोग GTPase बंधनकारी प्रोटीन की आत्मीयता की तुलना

Published: October 8, 2015 doi: 10.3791/53254
Automatic Translation
1, 2
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Department of Biomedical Science, University of Sheffield

Protocol

जीएसटी टैग GTPase 1. शुद्धीकरण

  1. संस्कृति एक ई इस तरह के 220 rpm पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर pGEX-Rac1 हे / एन के साथ बदल BL21, के रूप में कोलाई तनाव, autoinduction मीडिया के 500 एमएल (25 मिमी ना 2 4 HPO, 25 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 50 मिमी एनएच 4 सीएल, 5 अतः 4 मिमी ना 2, 2 मिमी MgSO 4, 2 मिमी 2 CaCl, 0.5% ग्लिसरॉल, 0.05% ग्लूकोज, 0.2% लैक्टोज, 5 ग्राम tryptone, 2.5 ग्राम खमीर निकालने, 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन)।
  2. 10,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरिया।
  3. 20 मिलीलीटर प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक, 1x protease अवरोध में बैक्टीरिया गोली Resuspend और उलटा के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. 30 मिनट के लिए 40,000 XG पर centrifugation द्वारा lysate स्पष्ट करें।
  5. फॉस्फेट बफर खारा से धोया 2 मिलीलीटर glutathione चुंबकीय मोती, जोड़ें (पीबीएस: 10 मिमी ना 2 4 HPO, 1.8 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl)।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर उलटा द्वारा मिश्रण, 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. हर कदम पर मोती वेग के लिए एक चुंबकीय कण सॉर्टर का उपयोग करते हुए, 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्रोटीन से भरी हुई मोती चार बार धोएं।
  8. जब तक जरूरत Resuspend 100 μl aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर पीबीएस में माला और दुकान प्रोटीन से भरी हुई है।

GTPase बंधनकारी प्रोटीन की 2. अभिव्यक्ति

  1. इस प्रकार के रूप में दिन के प्रयोग से पहले, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एन्कोडिंग transfect प्लास्मिडों HEK293T का एक अलग 75 सेमी 2 फ्लास्क में प्रत्येक GTPase बाध्यकारी प्रोटीन के संस्करणों -tagged। न्यूक्लियोटाइड लोडिंग के सत्यापन के लिए, transfect HEK293T का एक तिहाई 75 सेमी 2 फ्लास्क में TrioD1 GFP टैग।
    1. 100 μl में 1 मिलीग्राम / एमएल बाँझ 150 मिमी NaCl को polyethylamine पतला।
    2. 223 μl कम हो सीरम मीडिया के 27 μl पतला polyethylamine जोड़ें।
    3. 250 μl कम हो सीरम मीडिया के लिए 12 माइक्रोग्राम प्रति प्लास्मिड डीएनए जोड़ें।
    4. आरटी पर 2 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब सेते हैं। Polyethylamine का मिश्रण है और डीएनए 2 मिनट के लिए एक एकल ट्यूब और भंवर में घोला जा सकता है।
    5. आरटी पर 15-20 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. 5 मिलीलीटर ताजा वृद्धि मीडिया के साथ 90% मिला हुआ HEK293T पर विकास मीडिया (Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, कोई एंटीबायोटिक) बदलें।
    7. कुप्पी के लिए संयुक्त polyethylamine / डीएनए मिश्रण जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 हे / एन सेते हैं।

GTPase बंधनकारी प्रोटीन 3. शुद्धीकरण

  1. पीबीएस में कोशिकाओं की बोतल कुल्ला और मुक्त तरल aspirating, 5 मिनट के लिए कुप्पी नाली।
  2. 500 μl lysis बफर में कोशिकाओं परिमार्जन (50 मिमी Tris एचसीएल (pH7.8), 1% Nonidet पी -40, 1x protease अवरोध) microfuge ट्यूब में।
  3. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उलटा द्वारा मिश्रण से Lyse कोशिकाओं।
  4. सेल के दौरान, washes के बीच 2 मिनट के लिए 2,700 XG पर 40 μl GFP-जाल मोतियों की दो लाट ताजा lysis बफर के साथ तीन बार, sedimenting मोती धोने।
  5. 10 मिनट के लिए 21,000 XG पर centrifugation द्वारा lysates स्पष्ट करें।
  6. स्थानांतरण 4 डिग्री सेल्सियस पर उलटा द्वारा मिश्रण, धोया GFP-जाल मोती अलग और GFP-संलयन प्रोटीन 2 घंटे के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रतियोगी प्रोटीन में से प्रत्येक की lysate स्पष्ट किया। बर्फ पर GFP-TrioD1 कोशिकाओं से lysate रखें।
  7. 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.8), 50 मिमी NaCl में दो बार भरी हुई GFP-जाल मोती धो, 0.7% (w / v) Nonidet पी 40 और दो ​​बार 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6) में 20 मिमी 2 MgCl , washes के बीच 2 मिनट के लिए 2,700 XG पर मोती sedimenting।
  8. 40 μl 0.2 एम ग्लाइसिन (पीएच 2.5) को जोड़ने और 30 सेकंड के लिए नीचे से ऊपर pipetting और द्वारा GFP-संलयन प्रोटीन Elute। 4 μl 1 एम Tris एचसीएल (पीएच 10.4) युक्त एक नया microfuge ट्यूब 21,000 60 एस के लिए XG और हस्तांतरण तरल पर तुरंत तलछट मोती। शुद्ध प्रोटीन को नुकसान को सीमित करने के लिए जल्दी से यह मत करो।
  9. एक मात्रात्मक blott का उपयोग कर रिश्तेदार उपज की स्थापना के लिए एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा और जांच से प्रत्येक शुद्ध प्रोटीन की 1 μl का विश्लेषण करेंनिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार सिस्टम हैैं। वैकल्पिक रूप से, bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा प्रोटीन सांद्रता निर्धारित लेकिन प्रोटीन एक समान फैशन में परख के साथ प्रतिक्रिया नहीं है या दूषित पदार्थों प्रोटीन देखते हैं, तो यह त्रुटियों का परिचय।
  10. 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 20 मिमी 2 MgCl के अलावा द्वारा दाढ़ प्रोटीन एकाग्रता बराबर।

GTPase 4. Nucleotide लोड हो रहा है

  1. चरण 1 में तैयार जीएसटी Rac1 चुंबकीय मोती, में से एक विभाज्य पिघलना।
  2. हर कदम पर मोती वेग के लिए एक चुंबकीय कण सॉर्टर का उपयोग कर, जीएसटी Rac1 मोतियों की 90 μl ले लो और 20 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 25 मिमी NaCl, 0.1 मिमी डीटीटी, 4 मिमी EDTA के साथ तीन बार धोएं।
  3. महाप्राण मोतियों से बफर और 100 μl 20 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 25 मिमी NaCl, 0.1 मिमी डीटीटी, 4 मिमी EDTA जोड़ें।
  4. सकल घरेलू उत्पाद, जीटीपी या कोई न्यूक्लियोटाइड लोडिंग प्रतियोगिता प्रयोग के लिए आवश्यक है कि क्या के अनुसार, 12 μl 100 मिमी सकल घरेलू उत्पाद के 12 μl 10 मिमी गुजरात जोड़नेanosine 5 '- [γ-thio] ट्रायफ़ोस्फेट (GTPγS) या 60 μl जीएसटी Rac1 मोती करने के लिए कोई न्यूक्लियोटाइड।
  5. न्यूक्लियोटाइड लोडिंग नियंत्रण के लिए, तीन 10 μl aliquots में शेष मोती विभाजित है और 2 μl 100 मिमी सकल घरेलू उत्पाद, 2 μl 10 मिमी GTPγS या प्रत्येक ट्यूब करने के लिए कोई न्यूक्लियोटाइड जोड़ें।
  6. आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मनका घोला जा सकता है सेते हैं।
  7. प्रयोगात्मक मिश्रण करने के लिए 3 μl (कदम 4.4), नियंत्रण घोला जा सकता है (4.5 कदम) में से प्रत्येक के लिए 0.5 μl: 1 एम 2 MgCl के अलावा द्वारा न्यूक्लियोटाइड बाध्य Rac1 स्थिर।

बाध्यकारी 5. प्रतियोगिता।

  1. 6 microfuge ट्यूबों को सेट करें, प्रत्येक युक्त:
    200 μl 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 20 मिमी 2 MgCl
    (कदम 4.7 से) 10 μl प्रयोगात्मक न्यूक्लियोटाइड से भरी हुई Rac1 मोती
    5 μl Rac1 बाध्यकारी प्रोटीन ए (निरंतर बाध्यकारी प्रोटीन)
  2. प्रत्येक ट्यूब, 0, 1, 2.5, 5, 10 या 20 μl Rac1 बाध्यकारी प्रोटीन बी (चर बाध्यकारी प्रोटीन) जोड़ें। इन संस्करणों एक मानpproximately बराबर शेयर स्थिर और चर बंधनकारी प्रोटीन की सांद्रता और समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    1. वहाँ दो प्रोटीन के बंधन समानताएं में बड़े मतभेद रहे हैं और इस प्रयोगात्मक दोहराता के माध्यम से अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए अगर बाध्यकारी प्रोटीन की मात्रा और बी समायोजित करें। 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 20 मिमी 2 MgCl के अलावा द्वारा 235 μl के लिए बाध्यकारी मिश्रण की कुल मात्रा को बनाओ।
  3. युक्त एक microfuge ट्यूब सेट करें:
    200 μl 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 20 मिमी 2 MgCl
    (कदम 4.7 से) 10 μl प्रयोगात्मक न्यूक्लियोटाइड से भरी हुई Rac1 मोती
    10 μl Rac1 बाध्यकारी प्रोटीन ए (निरंतर बाध्यकारी प्रोटीन)
  4. सकल घरेलू उत्पाद, GTPγS और कोई न्यूक्लियोटाइड नियंत्रण ट्यूबों सेट करें:
    200 μl 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 20 मिमी 2 MgCl
    10 μl नियंत्रण Rac1 मोती सकल घरेलू उत्पाद, GTPγS या कोई न्यूक्लियोटाइड साथ 4.5 कदम में भरी हुई है और कदम 4.7 में स्थिर हो।
    180 μl एच3.6 कदम के रूप में तैयार EK293T GFP-TrioD1 lysate,
    4 μl 1 एम 2 MgCl
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर उलटा द्वारा मिश्रण, 2 घंटे के लिए मिश्रण को सेते हैं।
  6. 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.6), 20 मिमी 2 MgCl के साथ मोती तीन बार धोएं।
  7. Elute नमूना बफर को कम करने के लिए 20 μl में प्रोटीन बाध्य (50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7), 5% एसडीएस, 20% ग्लिसरॉल, 0.02 मिलीग्राम / एमएल bromophenol नीले, 5% β-mercaptoethanol)।

प्रतियोगिता के 6. विश्लेषण

  1. सोडियम dodecyl सल्फेट जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) और पश्चिमी धब्बा से बाध्य प्रोटीन (5.6 कदम) के 10 μl का समाधान करें।
  2. 4 डिग्री सीओ पर झिल्ली सेते / एन विरोधी GFP एंटीबॉडी में बफर अवरुद्ध में 1/1000 पतला पीबीएस में 1x को पतला, 0.1% बीच 20 गईं GTPase बंधनकारी प्रोटीन के दोनों पता लगाने के लिए।
  3. पीबीएस के साथ 10 मिनट, 0.1% बीच-20 के लिए झिल्ली तीन बार धोएं।
  4. 800 संयुग्मित विरोधी खरगोश सेकंड DyLight में आरटी पर 30 मिनट के लिए झिल्ली सेतेondary एंटीबॉडी, बफर अवरुद्ध में 1 / 10,000 पतला, 0.1% बीच 20 पीबीएस में 1x को पतला।
  5. पीबीएस के साथ 10 मिनट, 0.1% बीच-20 के लिए झिल्ली तीन बार धोएं।
  6. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बैंड तीव्रता को मापने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक अवरक्त इमेजिंग प्रणाली का उपयोग झिल्ली स्कैन करें।
  7. चर प्रतियोगी (प्रोटीन बी) की मात्रा के खिलाफ एक प्रोटीन का बैंड तीव्रता प्लॉट।
  8. लाइनों संतुलन हासिल की है, जिस पर प्रतियोगी अनुपात का निर्धारण करने के लिए निरंतर प्रतियोगी (एक प्रोटीन, 5 μl) की मात्रा से एक दूसरे को काटना, जिस पर बिंदु पर चर प्रतियोगी की मात्रा फूट डालो।
  9. कदम 6.1-6.6 में वर्णित के रूप में P21 सक्रिय काइनेज 1 (PAK1) (एक प्रेरक) और GFP-TrioD1 (एक जीईएफ), के लिए न्यूक्लियोटाइड लोडिंग स्थिति, जांच झिल्ली के सत्यापन के लिए।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल प्रतियोगियों की सटीक एकाग्रता में पता करने की जरूरत है (चित्रा 1) के बिना, Rac1 के लिए बाध्यकारी भागीदारों के रिश्तेदार समानताएं गणना करने के लिए बनाया गया है। प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण त्रुटियों का परिचय और एक संकेतन मार्ग में अणुओं के बीच प्रतिस्पर्धा जब विचार की जरूरत नहीं है। हालांकि, यह दो प्रतियोगियों परख करने के लिए अलग-अलग मात्रा में जोड़ने जब सरल अनुपात की गणना की जा करने के लिए अनुमति देने के लिए स्टॉक समाधान में ही दाढ़ एकाग्रता है कि पता करने के लिए महत्वपूर्ण है। GFP-जाल मोतियों की 40 μl 300 pmol तो एक मिला हुआ 75 सेमी अत्यधिक दो अलग बंधनकारी प्रोटीन की तैयारी के समायोजन से पहले के समान हो जाएगा कि परिणाम के साथ, मोती तर जाएगा कोशिकाओं को व्यक्त करने की 2 बोतल ~ की एक बाध्यकारी क्षमता है (चित्रा 2A)। प्रोटीन से एक खराब व्यक्त करता है, तो इस समस्या कोशिकाओं के एक से अधिक कुप्पी से प्रोटीन है कि सफ़ाई के द्वारा दूर किया जा सकता है।

8 (चित्रा 2 बी) द्वारा पता लगाया जा सकता है। संक्रमण राज्य को स्थिर करने के GTPase मुक्त न्यूक्लियोटाइड को अधिमान्यतया बाँध GEFs। GEFs आम तौर पर निष्क्रिय कम बहुतायत, के होते हैं और अक्सर खराब दाग के रूप में, यह परीक्षण न्यूक्लियोटाइड मुक्त GTPase करने के लिए एक जीईएफ या जीईएफ टुकड़ा overexpress के लिए बेहतर है। हम अक्सर तिकड़ी की पहली Dbl अनुरूपता का उपयोग करें, एक GFP संलयन (GFP TrioD1 9) (चित्रा 2 बी) के रूप में व्यक्त किया, लेकिन किसी भी जीईएफ काम करेगा। सकल घरेलू उत्पाद से भरी हुई GTPase करने के लिए बाध्य प्रोटीन है कि दुर्लभ हैं। बिंदी के रूप में बस मान्य किया जा सकता है एक ऐसे प्रोटीन 7, या सकल घरेलू उत्पाद की लोडिंग के रूप में हमने हाल ही में RCC2 सूचना दीन जीईएफ और न ही प्रेरक के लिए एनजी।

प्रयोग से उत्पादन GTPase के लिए बाध्य कर दो GFP टैग बंधन भागीदारों का चित्रण एक पश्चिमी धब्बा होगा। दोनों प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक एकल एंटीबॉडी का उपयोग करके, दोनों प्रतियोगियों की समान मात्रा में जो बाँध में सांद्रता निर्धारित किया जा सकता है और इसलिए रिश्तेदार समानताएं अनुमान लगाया। Rac1 तस्करी प्रोटीन की प्रोपेलर डोमेन के बीच इस उदाहरण प्रतियोगिता में, coronin -1 सी (प्रोटीन एक Rac1 बाध्यकारी), और Rac1-sequestering प्रोटीन, RCC2 (प्रोटीन बी Rac1 बाध्यकारी), (चित्रा 3) का प्रदर्शन किया है। Coronin -1 सी प्रोपेलर (5 μl) की एक निरंतर मात्रा का उपयोग करते हुए, और RCC2 की बढ़ती मात्रा को जोड़ कर, हम RCC2 एक मजबूत है कि प्रदर्शन, GFP से कि संतुलन RCC2 (तारांकन) के 1.25-2.5 μl पर पहुंच गया है दाग देख सकते हैं coronin -1 सी से Rac1 के लिए आत्मीयता। प्रत्येक competito के लिए औसत मूल्यों मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर बैंड की तीव्रता को मापने के लिए, और साजिश रचने के द्वाराआर, संतुलन बिंदु मात्रा में है, जिस पर घटता (चित्रा 3 बी) एक दूसरे को काटना पहचान करके सही गणना की जा सकती है।

बंधन भागीदारों को एक दूसरे के साथ ही Rac1 के लिए बाध्य करने के लिए बाध्य करता है, तो एक सफल प्रतियोगिता परख करने के लिए संभव बाधाओं में से एक है। चित्रा 3 ए + बी में हम नहीं बल्कि पूर्ण लंबाई coronin -1 सी से RCC2 और coronin -1 सी के प्रोपेलर डोमेन के बीच प्रतिस्पर्धा है, प्रदर्शित करता है। छोटा coronin प्रयोग करने के लिए कारण coronin -1 सी भी पूंछ डोमेन के माध्यम से RCC2 कि बांध है। पूर्ण लंबाई coronin -1 सी RCC2 के खिलाफ titrated जाता है, तो दोनों प्रोटीन के बंधन के कारण त्रिगुट जटिल गठन, बजाय प्रतियोगिता (चित्रा 3 सी) के लिए, का पता चला है। प्रतियोगिता होने वाली है, तो एक प्रोटीन के बंधन अन्य कम हो जाती है, जबकि वृद्धि होगी, और कुल बाध्य GFP- संलयन स्थिर रहेगा। मामलों में एक त्रिगुट जटिल यह GTPase बाध्यकारी प्रोटीन का एक छोटा करने के लिए आवश्यक है रूपों जहां इतना है कि competitors अब कोई बातचीत।

चित्र 1
चित्रा 1. कार्यप्रवाह। प्रतियोगिता assays का उपयोग GTPase बंधनकारी प्रोटीन की आत्मीयता का निर्धारण करने के लिए कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
शुद्ध प्रोटीन की चित्रा 2. मान्यकरण। (ए) शुद्ध GFP टैग दो प्रोटीन के रिश्तेदार उपज का निर्धारण करने के लिए विरोधी GFP के साथ जांच कर रही, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रोटीन बाध्यकारी Rac1। प्रयोग के दौरान समीकरण के इस प्रकार वे बाध्यकारी प्रयोग में मैच इसलिए दो प्रोटीन की एकाग्रता को समायोजित करने की अनुमति देता है। (बी) जी.डी.पी, GTPγS और कोई न्यूक्लियोटाइड से भरी हुई जीएसटी Rac1 अंतर्जात PAK1 या overexpressed GFP-TrioD1 के लिए साजिश रचने के द्वारा पता लगाया प्रोटीन GFP-TrioD1 व्यक्त HEK293T से lysate साथ incubated और ही था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
रिश्तेदार प्रोटीन की चित्रा 3. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण बंधन। उदाहरण outputs के प्रतियोगिता बाध्यकारी assays से। (ए) Rac1 5 μl GFP-coronin -1 सी प्रोपेलर डोमेन के साथ मिलाया जाता है और में titrated थे GFP-RCC2 की मात्रा बढ़ रहा था सकल घरेलू उत्पाद से भरी हुई है। रखकर GFP के लिए पश्चिमी सोख्ता बाध्य प्रोटीन, दो प्रोटीन के अंतर का पता लगाने के साथ मुद्दों को बचा रहे हैं और GFP संकेत दो संलयन प्रोटीन के बीच दाढ़ अनुपात की रिपोर्ट। तारों के eithe पर प्रतियोगिता अनुपात से संकेत मिलता हैसंतुलन बिंदु के आर पक्ष। (बी) के तीन स्वतंत्र प्रयोगों से बाध्य GFP संलयन प्रोटीन का बैंड तीव्रता संतुलन तक पहुँचने की जरूरत fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और औसत RCC2 की राशि की गणना करने के लिए साजिश रची का उपयोग कर, मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता द्वारा मापा गया। (सी Rac1 बंधनकारी प्रोटीन बल्कि प्रतिस्पर्धा की तुलना में, एक दूसरे के लिए बाध्य है और एक त्रिगुट जटिल फार्म जहां एक प्रयोग से) उदाहरण उत्पादन। सकल घरेलू उत्पाद से भरी हुई Rac1 5 μl GFP-RCC2 के साथ मिलाया और GFP-coronin -1 सी पूर्ण लंबाई की मात्रा बढ़ रहा था में titrated थे। बाध्य GFP-coronin -1 सी में वृद्धि के लिए बाध्य GFP-RCC2 की हानि के बिना त्रिगुट जटिल गठन इंगित करता है। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bugbuster Novagen 70584-3
COMPLETE protease inhibitor Roche 05 056 489 001
Glutathione magnetic beads Pierce 88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma Aldrich 408727-100ML
OPIMEM Life Technologies 31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270-1-6
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
GFP-Trap_A Chromotec gta-20
GDP Sigma Aldrich G7127 Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS Sigma Aldrich G8634 Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer Sigma Aldrich B6429
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Anti-GFP antibody Living Colors 632592 Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody Fisher Scientific 10733944
Anti-PAK1 antibody Cell Signaling 2602S Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System Li-cor 9260-11PC

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 104 GTPase Rac1 प्रतियोगिता बाध्यकारी न्यूक्लियोटाइड लोडिंग कोशिका संकेतन रो-परिवार
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