Protocol
GST-태그는 GTPase 1. 정제
- 문화 E. 예컨대 220 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 유전자 pGEX-RAC1 O / N로 형질 전환 된 BL21로서 대장균, autoinduction 배지 500 ㎖ (25 mM의 나트륨 2 HPO 4, 25 mM의 KH 2 PO 4, 50 mM의 NH 4 CL, 5 mM의 SO 4 나 2, 2 mM의 황산, 2 mM의 CaCl2를, 0.5 % 글리세롤, 0.05 % 글루코스, 0.2 % 락토오스, 5g 트립 톤, 2.5 g 효모 추출물, 100 μg의 / ㎖ 암피실린).
- 10,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 박테리아.
- 20 ㎖의 단백질 추출 시약, 1X 프로테아제 억제제 세균 펠렛을 재현 탁하고 반전하여 실온에서 20 분 동안 배양한다.
- 30 분 동안 40,000 XG에서 원심 분리하여 해물을 명확히.
- 인산염 완충 식염수로 세척 2 ㎖의 글루타티온 자석 구슬, 추가 (PBS : 10 밀리미터 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 137 mM의 NaCl을, 2.7 밀리미터의 KCl).
- 4 ° C에서 반전하여 혼합, 2 시간 동안 품어.
- 각 단계에서 비즈를 침전 자분 분류기를 사용하여, 10 ml의 PBS로 단백질 로딩 비드 네 번 씻는다.
- 필요할 때까지 재현 탁의 100 μL 씩에 -80 ° C에서 2 ml의 PBS에서 구슬과 상점을 단백질로드.
는 GTPase 결합 단백질의 2 식
- 다음 실험 하루 전에, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 플라스미드를 형질 HEK293T 별도 75 cm-2는 GTPase 플라스크에 각각 결합 단백질의 버전 -tagged. 염기로드의 검증을 위해, 트랜의 HEK293T의 세 번째 75 cm 2 플라스크에 TrioD1을 GFP - 태그.
- 100 μL에 1 ㎎ / ㎖ 멸균 150 mM의 염화나트륨에 polyethylamine을 희석.
- 223 μL 감소 혈청 미디어에 27 μl를 희석 polyethylamine를 추가합니다.
- 250 μL 감소 혈청 배지에 12 μg의 플라스미드 DNA를 추가합니다.
- 실온에서 2 분 동안 각 튜브를 품어. polyethylamine을 결합하고 DNA는 2 분에 대해 하나의 튜브와 소용돌이에 혼합.
- 실온에서 15 ~ 20 분 동안 품어.
- 5 ml의 신선한 성장 배지에 90 % 합류에 HEK293T 성장 배지 (둘 베코 변형 이글 미디어, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 항생제)를 대체.
- 플라스크에 결합 polyethylamine / DNA 믹스를 추가하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 O / N을 품어.
는 GTPase 결합 단백질의 3 정화
- PBS에서 형질 세포의 플라스크를 씻어 무료로 액체를 흡입, 5 분 동안 플라스크 드레인.
- 500 ㎕의 용해 완충액에 세포를 긁어 (50mM 트리스 - 염산 (pH7.8), 1 % Nonidet P-40, 1X 프로테아제 억제제) 미세 원심 분리 튜브에.
- 30 분 동안 4 ° C에서 반전하여 혼합하여 세포를 Lyse.
- 용해시, 세척 사이에 2 분 동안 2,700 XG에 40 μL GFP - 트랩 구슬이 많은 신선한 용해 완충액으로 3 회, 침강 구슬을 씻어.
- 10 분 동안 21,000 XG에서 원심 분리 용 해물을 명확히.
- 전사는 4 ° C에서 반전하여 혼합, 세척 GFP 트랩 비드를 분리 및 GFP 융합 단백질은 2 시간 동안 결합하게 경쟁 단백질의 각각의 용 해물을 정화. 얼음에 GFP - TrioD1 세포에서 해물을 유지합니다.
- 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.8), 50 mM의 NaCl을 두번로드 GFP 트랩 구슬 씻어 0.7 % (W / V) Nonidet P-40 회 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6)에서, 20 밀리미터의 MgCl 2 , 세척 사이에 2 분 동안 2,700 XG에 구슬을 침강.
- 40 ㎕의 0.2 M 글리신 (PH 2.5)을 추가하고 30 초 동안 아래로 피펫 팅에 의해 GFP - 융합 단백질을 용출. 4 μL 1 M 트리스 - 염산 (PH 10.4)를 포함하는 새로운 미세 원심 분리 튜브에 21,000 60 초 동안 XG 및 전송 액체에서 즉시 침전물 구슬. 정제 된 단백질의 손상을 제한하기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다.
- 정량적 blott를 사용 상대적인 수율을 확립 항 GFP 항체와 함께 웨스턴 블랏에 의한 각 프로브와 정제 된 단백질의 1 μL를 분석제조 업체의 프로토콜에 따라 시스템을 보내고. 대안 적으로, bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석으로 농도를 결정하지만, 단백질과 동일한 방식으로 분석과 반응하지 않거나 오염 단백질이 존재하면 에러를 도입한다.
- 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl 2를 첨가하여 단백질의 몰 농도를 등화.
는 GTPase의 4 염기로드
- 단계 1에서 제조 한 GST-RAC1 자성 비드, 하나의 분취 량을 해동.
- 각 단계에서 비즈를 침전 자분 분류기를 사용하여, GST-RAC1 비드의 90 μl를 취하여 20 mM 트리스 - 염산 (PH 7.6), 25 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 DTT, 4 mM의 EDTA로 3 회 세척 하였다.
- 대기음 구슬에서 버퍼와 100 μL 20 mM 트리스 - 염산 (PH 7.6), 25 mM의 NaCl을 0.1 mM의 DTT, 4 mM의 EDTA를 추가합니다.
- 국내 총생산 (GDP), GTP 또는 전혀 염기 로딩 경쟁 실험에 필요한지 여부에 따라, 12 μl의 100 mM의 국내 총생산 (GDP), 12 ㎕의 10 mM의 번지를 추가anosine 5 '- [γ-티오] 트리 포스페이트 (GTPγS) 또는 60 μL GST-RAC1 비즈없이 염기.
- 염기 로딩 컨트롤, 세 10 μL 분취에 남아있는 구슬을 분할하여 2 μL 100 mM의 국내 총생산 (GDP), 2 μL 10 밀리미터 GTPγS 각 튜브없이 염기를 추가합니다.
- 교반하면서 30 ℃에서 30 분 동안 비드 혼합물을 배양한다.
- 실험 믹스 3 μL (단계 4.4), 제어 믹스 (단계 4.5)의 각각 0.5 μL 1 M의 MgCl 2를 첨가하여 핵산 - 결합 RAC1 안정화.
바인딩 5. 경쟁.
- 6의 microfuge 튜브를 설정, 각 포함 :
200 ㎕의 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl 2
(단계 4.7에서) 10 μL 실험 염기로드 RAC1 비즈
5 μL RAC1 결합 단백질 A (단백질 결합 상수) - 각 튜브에, 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μL의 RAC1 - 결합 단백질 B (가변 결합 단백질)를 추가한다. 이 볼륨은 가정pproximately 동일한 주식 상수와 변수 결합 단백질의 농도를 조정해야 할 수도 있습니다.
- 이 두 단백질의 결합 친화도에 큰 차이가 있으며 이것이 반복 실험을 통해 경험적으로 결정되어야하는 경우 결합 단백질의 양 및 B를 조정한다. 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl 2를 첨가하여 235 μL로 결합 혼합물의 전체 부피를 차지한다.
- 포함하는 미세 원심 분리 튜브를 설정합니다 :
200 ㎕의 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl 2
(단계 4.7에서) 10 μL 실험 염기로드 RAC1 비즈
10 μL RAC1 결합 단백질 A (단백질 결합 상수) - 국내 총생산 (GDP), GTPγS없이 염기 제어 튜브를 설정합니다 :
200 ㎕의 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl 2
10 μL 제어 RAC1 비즈는 국내 총생산 (GDP), GTPγS 또는 전혀 염기와 4.5 단계에서로드 단계 4.7에서 안정화.
180 μL H단계 3.6에서와 같이 제조 EK293T GFP - TrioD1 용 해물,
4 μL 1 M의 MgCl 2 - 4 ° C에서 반전하여 혼합, 2 시간 동안 상기 혼합물을 배양한다.
- 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl 2 비드 세 번 세척 하였다.
- 용출 시료 완충액을 20 μL 환원 단백질을 결합 (50 mM 트리스 -HCl (pH 7), 5 % SDS, 20 % 글리세롤, 0.02 ㎎ / ㎖ 브로 모 페놀 블루, 5 % β 메르 캅토 에탄올).
경쟁 6. 분석
- 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯에 의해 결합 된 단백질 (단계 5.6) 10 μL를 해결.
- 39 °에서 CO 막을 인큐베이션 / N 안티 GFP 항체로 블로킹 완충액으로 1/1000 희석하여 PBS로 1 배 희석하고, 0.1 % 트윈 -20은이 태그는 GTPase - 결합 단백질의 양을 검출한다.
- PBS로 10 분, 0.1 % 트윈 20 막 세 번 씻으십시오.
- 800 - 공액 안티 - 토끼 초 DyLight에 RT에서 30 분 동안 인큐베이션 막을ondary 항체, 버퍼를 차단에서 1 / 10,000을 희석하면, 0.1 % 트윈 20 PBS에 1 배 희석.
- PBS로 10 분, 0.1 % 트윈 20 막 세 번 씻으십시오.
- 제조사의 프로토콜에 따라 밴드 강도를 측정하기 위해 소프트웨어를 사용하여, 적외선 이미지 시스템을 사용하여 멤브레인을 스캔.
- 가변 경쟁자 (단백질 B)의 양에 대해 각 단백질 밴드의 강도를 플롯.
- 라인이 평형이 달성되는 경쟁자 비율을 결정하는 상수 경쟁자 (단백질 A, 5 μL)의 체적 교차하는 점에서 가변 경쟁자의 볼륨을 나눈다.
- 단계 6.1-6.6에 설명 된대로 P21 활성화 키나제 1 (PAK1) (이펙터)와 GFP - TrioD1 (GEF)에 대한 염기 로딩 상태, 프로브 막 확인하십시오.
Representative Results
이 프로토콜은 경쟁사의 정확한 농도를 알 필요 (그림 1)하지 않고, RAC1 바인딩 파트너의 상대적 친화도를 계산하도록 설계되었습니다. 단백질 농도의 측정 오류를 소개하고 신호 경로의 분자 사이의 경쟁을 고려할 때 필요하지 않습니다. 그러나, 두 경쟁 분석법으로 상이한 양을 추가 할 때 단순 비율이 계산 될 수 있도록하는 스톡 용액에 동일 몰 농도가 있음을 아는 것이 중요하다. GFP 트랩 비드 40 ㎕를 300 pmol의 그래서 합류 75cm 높은 두 개의 다른 결합 단백질의 제제는 조정 전의 유사 할 것이라는 결과, 비드 포화 것이다 발현 세포의 2 플라스크 ~의 결합능을 가지고 (도 2A). 단백질 중 하나가 잘못 표현하면,이 문제는 셀의 하나 이상의 플라스크에서 그 단백질을 정제에 의해 극복 될 수있다.
(8) (그림 2B)에 의해 검출 될 수있다. 전이 상태를 안정화시키기는 GTPase없는 뉴클레오티드 우선적 결합 GEFs. GEFs는 일반적으로 비활성 낮은 풍부,의이고 자주 가난시킨다, 그것은 시험 염기 프리는 GTPase에 GEF 또는 GEF 단편을 과발현하는 것이 좋습니다. 우리는 자주 트리오의 첫 번째 DBL 동성을 사용하여, GFP 융합 (GFP - TrioD1 9) (그림 2B)로 표현하지만 어떤 GEF는 작동합니다. 국내 총생산 (GDP)로드는 GTPase에 결합하는 단백질은 희소하다. BINDI로 간단하게 검증 할 수있는 하나의 단백질 (7), 또는 국내 총생산 (GDP) 로딩으로 우리는 최근 RCC2보고도 지구 환경 기금이나 이펙터에 겨.
실험의 출력에 결합는 GTPase 두 GFP 표지 된 결합 파트너를 나타내는 웨스턴 블롯 것이다. 두 단백질을 검출하기 위해 하나의 항체를 사용하여, 두 경쟁 유사한 양 결합되는 농도를 결정할 수 있으므로 상대적 친화 유추. RAC1 인신 매매 단백질의 프로펠러 도메인 사이에이 예 대회에서, coronin-1C (단백질을 RAC1가 결합) 및 RAC1 - 금속 이온 봉쇄 단백질, RCC2은 (단백질 B를 RAC1가 결합), (그림 3A)를 시연한다. coronin-1C 프로펠러 (5 μL)의 일정한 볼륨을 사용하고, RCC2의 증가 볼륨을 추가함으로써, 우리는 RCC2가 강하게 가지고 있음을 보여주는 GFP에서 그 평형이 RCC2 (별표)의 1.25-2.5 μL에 도달시킨다 볼 수 있습니다 coronin-1C보다 RAC1에 대한 친화력. 각 competito 평균치를 정량적 웨스턴 블 롯팅을 사용하여 밴드의 강도를 측정하고, 플롯에 의해R, 평형 점은 볼륨되는 곡선 (도 3b)를 교차를 식별하여 정확하게 계산 될 수있다.
결합 파트너가 서로뿐만 아니라 RAC1 결합에 결합하는 경우 성공적인 경쟁 분석에 사용할 수있는 하나의 장애물이다. 그림 3A의 + B의 우리는 오히려 전체 길이 coronin-1C보다 RCC2과 coronin-1C의 프로펠러 도메인 간의 경쟁을 보여줍니다. 절두 coronin를 사용하는 이유는 coronin-1C는 테일 도메인 통해 RCC2 결합한다는 것이다. 전장 coronin-1C는 RCC2 대해 적정하면, 두 단백질의 결합으로 인해 삼원 복합체 형성보다는 경쟁 (도 3c)로 검출된다. 경쟁이 발생하는 경우, 하나의 단백질의 결합은 다른 감소하면서 증가하고 총 결합 GFP 융합은 일정하게 유지 될 것이다. 경우 삼원 복합체는는 GTPase 결합 단백질 중 하나자를 형성 할 필요가 있기 때문에 여기서 compet적인 억제제는 더 이상 상호 작용하지 않습니다.
그림 1. 워크 플로우. 경쟁 분석을 사용하여는 GTPase 결합 단백질의 친 화성을 결정하기위한 워크 플로우의 도식 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정제 된 단백질의 그림 2. 검증. (A)으로 정제하여 GFP - 태그 두 단백질의 상대 수익률을 결정하는 안티 GFP와 프로빙, 웨스턴 블롯 분석 결합 단백질 RAC1. 실험 기간 동안 보상이 유형들이 결합 실험에 일치하도록 두 단백질의 농도가 조절 될 수있다. (B) GDP, GTPγS없이 염기로드 GST-RAC1이 내생 PAK1 또는 과발현 GFP - TrioD1에 대한 플롯에 의해 감지 단백질 GFP - TrioD1을 표현 HEK293T에서 해물 배양과 결합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
상대 단백질의 그림 3. 웨스턴 블롯 분석을 결합. 예 출력을 경쟁 결합 분석에서. (A) RAC1 5 μL GFP - coronin-1C 프로펠러 도메인과 혼합에 적정 된 GFP - RCC2의 볼륨을 증가하고 국내 총생산 (GDP)로드.으로 GFP에 대한 웨스턴 블롯 결합 단백질, 두 단백질의 검출 시차의 문제가 회피되고, GFP 신호는 두 개의 융합 단백질 사이의 몰비를보고한다. 별표는 eithe의 경쟁 비율을 나타냅니다평형 점의 R 측. (B) 3 개의 독립적 인 실험으로부터 바운드 GFP 융합 단백질의 밴드 강도는 평형에 도달하는 데 필요한 형광 접합 된 이차 항체 및 평균 RCC2의 양을 계산하는 플롯하여 정량적 웨스턴 블롯으로 측정 하였다. (C RAC1 결합 단백질 오히려 경쟁보다는 서로에 결합 원 복합체를 형성 실험에서) 예 출력. 국내 총생산 (GDP)이 장착 된 RAC1 5 μL의 GFP - RCC2와 혼합 GFP - coronin-1C 전체 길이의 볼륨을 증가했다가에 적정 하였다. 바운드 GFP - coronin-1C의 증가를 결합 GFP - RCC2의 손실없이이 원 복합체 형성을 나타냅니다. 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
