Protocol
1. A purificação de GTPase marcado com GST
- Cultura um E. coli tal como BL21 transformada com pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitação a 220 rpm, em 500 ml de meio de auto-indução (25 mM de Na 2 HPO 4, 25 mM de KH 2 PO 4, 50 mM de NH 4 Cl, 5 mM de Na 2 SO 4, 2 mM MgSO4, 2 mM de CaCl2, 0,5% de glicerol, 0,05% de glucose, 0,2% de lactose, 5 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 100 ug / ml de ampicilina).
- Colheita bactérias por centrifugação durante 10 min a 10.000 xg, a 4 ° C.
- Ressuspender o granulado em 20 ml bacteriana reagente de extracção de proteína, 1x inibidor de protease e incuba-se durante 20 min à TA com inversão.
- Clarificar o lisado por centrifugação a 40.000 xg durante 30 min.
- Adicionar 2 mL de glutationa esferas magnéticas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS: 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM).
- Incubar durante 2 h, misturando por inversão a 4 ° C.
- Lavar os grânulos carregados de proteína-se quatro vezes com 10 ml de PBS, utilizando um classificador de partículas magnéticas para precipitar os grânulos em cada passo.
- Grânulos em 2 ml de PBS e armazenar Ressuspender proteína-carregado a -80 ° C em alíquotas de 100 ul até ser necessário.
2. Expressão de proteínas de ligação a GTPase
- O dia antes da experiência, os plasmídeos que codificam para transfectar proteína fluorescente verde (GFP) tagged versões de cada proteína de GTPase de ligação para um separado 75-cm2 de frasco HEK293T como se segue. Para a validação do carregamento de nucleotídeos, transfecção GFP-tagged TrioD1 em um terceiro de 75 cm 2 frasco de HEK293T.
- Diluir polyethylamine a 1 mg / ml em 100 ul de NaCl 150 mM estéril.
- Adicionar 27 ul diluída para 223 ul polyethylamine meio de soro reduzido.
- Adicionar 12 ug de DNA de plasmídeo a 250 ul de meio de soro reduzido.
- Incubar cada tubo durante 2 min à temperatura ambiente. Combinar o polyethylamine e mistura de ADN em um único tubo e vortex durante 2 min.
- Incubar durante 15-20 minutos à temperatura ambiente.
- Substituir o meio de crescimento (Meios de Eagle Modificado por Dulbecco, 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, sem antibióticos) em 90% confluentes HEK293T com 5 ml de meio de crescimento fresco.
- Adicionar a mistura polyethylamine / ADN combinado para o frasco e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
3. Purificação de proteínas de ligação a GTPase
- Lavar frascos de células transfectadas em PBS e escorrer balão durante 5 min, a aspiração de líquido livre.
- Raspar as células em 500 ul de tampão de lise (50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 1% de Nonidet P-40, 1x inibidor de protease) para dentro do tubo de microcentrífuga.
- Lisar as células por misturar por inversão a 4 ° C durante 30 min.
- Durante a lise, lavar dois lotes de esferas de 40 ul de GFP-Trap três vezes com tampão de lise fresco, grânulos que sedimentam em 2.700 xg durante 2 min entre as lavagens.
- Esclarecer os lisados por centrifugação a 21.000 xg durante 10 min.
- Transferir o lisado clarificado de cada uma das proteínas concorrentes para separar os grânulos de GFP-trap lavadas e permitem que as proteínas de fusão GFP-para ligar durante 2 h, misturando por inversão a 4 ° C. Manter o lisado a partir de células de GFP-TrioD1 em gelo.
- Lavar grânulos GFP-Trap carregadas duas vezes em 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), NaCl 50 mM, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 e duas vezes em 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), MgCl 20 mM 2 , sedimentando esferas a 2700 xg por 2 min entre lavagens.
- Elui-se as proteínas de fusão GFP-40 ul pela adição de 0,2 M de glicina (pH 2,5) e pipetando para cima e para baixo durante 30 seg. Imediatamente grânulos sedimento no 21.000 xg durante 60 segundos e de transferência de líquido para um novo tubo de microcentrifugadora contendo 4 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 10,4). Faça isso rapidamente para limitar os danos à proteína purificada.
- Analisar 1 ul de cada proteína purificada por transferência de Western e detecção com um anticorpo anti-GFP para estabelecer o rendimento relativamente quantitativo utilizando um Blotting sistema de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, a determinação das concentrações de proteína pelo ácido (BCA) ensaio bicinconínico mas isso introduz erros, se as proteínas não reagem com o ensaio de uma forma idêntica ou existem proteínas contaminantes.
- Equalizar a concentração molar da proteína pela adição de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2.
4. Nucleotide carregamento de GTPase
- Descongelar uma aliquota de GST-Rac1 esferas magnéticas, preparado no passo 1.
- Tomar 90 ul de esferas de GST-Rac1 e lavar três vezes com 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, utilizando um classificador de partículas magnéticas para precipitar os grânulos em cada passo.
- Aspirar tampão dos grânulos e adiciona-se 100 ul de 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM.
- De acordo com o PIB se, GTP ou nenhuma carga de nucleótidos é necessária para a experiência de competição, adicionar 12 ul de PIB 100 mM, 12 ul de 10 mM de guanosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTP) ou nenhum nucleótido a 60 ul de GST-Rac1 grânulos.
- Para os controles de nucleótidos de carregamento, dividir os grânulos restantes em três alíquotas de 10 ul e adiciona-2 ul PIB 100 mM, 2 ul de 10 mM ou GTPyS não de nucleótidos para cada tubo.
- Incubar as misturas de esferas durante 30 minutos a 30 ° C com agitação.
- Estabilizar Rac1 ligados a nucleótidos por adição de 1 M de MgCl2: 3 ul à mistura experimental (passo 4.4), 0,5 ul de cada uma das misturas de controlo (passo 4.5).
5. Concorrência vinculativo.
- Configure 6 tubos de microcentrífuga, cada uma contendo:
200 ul de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2
10 jul experimentais contas de Rac1 carregado de nucleotídeo (a partir do passo 4.7)
5 jul proteína Rac1 de ligação A (proteína de ligação constante) - Para cada tubo, adicionar 0, 1, 2.5, 5, 10 ou 20 ul de proteína de ligação a Rac1 B (proteína de ligação variável). Estes volumes assumir umaproximadamente iguais concentrações banco de proteínas de ligação constante e variável e pode precisar de ser ajustada.
- Ajustar o volume de proteínas de ligação A e B se existirem grandes diferenças nas afinidades de ligação das duas proteínas e isto deve ser determinado empiricamente através das repetições experimentais. Perfazer o volume total da mistura de ligação a 235 ul, por adição de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2.
- Configurar um tubo de microcentrífuga contendo:
200 ul de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2
10 jul experimentais contas de Rac1 carregado de nucleotídeo (a partir do passo 4.7)
10 ul de proteína Rac1 de ligação A (proteína de ligação constante) - Configure o PIB, GTPyS e sem tubos de controle de nucleotídeos:
200 ul de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2
10 esferas de Rac1 controle ul carregado no passo 4.5 com o PIB, GTPyS ou nenhuma nucleotídeos e estabilizado na etapa 4.7.
180 ul de HEK293T GFP-TrioD1 lisado, preparado como no passo 3.6
4 ul de 1 M MgCl2 - Incubar a mistura durante 2 h, misturando por inversão a 4 ° C.
- Lavar as pérolas três vezes com 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2.
- Eluir proteínas ligadas, em 20 ul de tampão de amostra redutora (50 mM de Tris-HCl (pH 7), SDS a 5%, 20% de glicerol, 0,02 mg / ml de azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol).
6. Análise da concorrência
- Resolver 10 ul de a proteína ligada (passo 5.6) por electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e transferência de Western.
- Incubar a membrana a 4 ° CO / N em anticorpo anti-GFP diluído 1/1000 em tampão de bloqueio diluído em PBS 1x, 0,1% de Tween-20 para detectar ambas as proteínas de ligação a GTPase marcados.
- Lava-se a membrana três vezes durante 10 min com PBS, 0,1% de Tween-20.
- Incubar a membrana durante 30 minutos à temperatura ambiente em 800 DyLight-seg conjugado anti-coelhoanticorpo secundá-, diluído a 1 / 10.000 em tampão de bloqueio diluído em PBS 1x, 0,1% de Tween-20.
- Lava-se a membrana três vezes durante 10 min com PBS, 0,1% de Tween-20.
- Digitalizar a membrana usando um sistema de imageamento infravermelho, usando o software para medir a intensidade da banda de acordo com o protocolo do fabricante.
- Traçar a intensidade da banda de cada proteína contra volume do concorrente variável (Proteína B).
- Dividir o volume de competidor variável no ponto em que as linhas se cruzam pelo volume de competidor constante (Proteína A, 5 uL) para determinar a razão de competidor no qual é conseguido o equilíbrio.
- Para a validação do estado de carregamento de nucleótidos, para membranas de sonda activada por p21 quinase 1 (PAK1) (um efector) e GFP-TrioD1 (um GEF), conforme descrito nas etapas 6.1-6.6.
Representative Results
Este protocolo é concebido para calcular as afinidades relativas dos parceiros de ligação para Rac1, sem a necessidade de conhecer a concentração exacta dos concorrentes (Figura 1). Determinação da concentração de proteína e introduz erros quando se considera a concorrência entre moléculas de uma via de sinalização não é necessária. No entanto, é importante saber que os dois competidores têm a mesma concentração molar das soluções de reserva para permitir proporções simples para ser calculada ao adicionar diferentes volumes de ensaio. 40 ul de contas de GFP-Armadilha têm uma capacidade de ligação de ~ 300 pmol de modo confluente 75 centímetros 2 frascos de altamente células que expressam irá saturar as contas, com o resultado que os preparativos das duas proteínas de ligação diferentes será semelhante antes do ajuste (Figura 2A). Se uma das proteínas fracamente expressa, este problema pode ser superado através da purificação de proteínas a partir de que mais de um frasco de células.
8 (Figura 2B). GEFs ligam-se preferencialmente ao nucleótido-livre GTPase para estabilizar o estado de transição. Como GEFs são de baixa abundância, normalmente inativo e freqüentemente apagar mal, é melhor para sobre-expressar uma GEF GEF ou fragmento de teste GTPase livre de nucleótido. Nós freqüentemente usam o primeiro homologia Dbl de Trio, expresso como uma fusão GFP (GFP-TrioD1 9) (Figura 2B), mas qualquer GEF iria funcionar. As proteínas que se ligam ao GTPase carregado-PIB são mais raros. Recentemente, relatou RCC2 como uma tal proteína 7, ou PIB-carregamento pode ser validado como simplesmente binding a GEF nem nem efectora.
A saída a partir da experiência será uma mancha de Western que descreve os dois parceiros de ligação marcado com GFP ligados ao GTPase. Ao utilizar um único anticorpo para detectar ambas as proteínas, as concentrações em que quantidades similares de ambos os competidores se ligam podem ser determinados e, por conseguinte, as afinidades relativas inferida. Neste exemplo, a competição entre o domínio de hélice da proteína Rac1 de tráfico, coronin-1C (Rac1 de ligação de proteína A), e a proteína Rac1-sequestrante, RCC2 (Rac1 proteína de ligação B), é demonstrada (Figura 3A). Usando um volume constante de hélice coronin-1C (5 mL), e adicionando volumes crescentes de RCC2, podemos ver a partir da GFP blot que o equilíbrio é alcançado em 1,25-2,5 l de RCC2 (asterisco), demonstrando que tem um forte RCC2 afinidade para Rac1 que coronin-1C. Ao medir a intensidade das bandas utilizando transferência de Western quantitativa, e traçando os valores médios para cada competitoR, o ponto de equilíbrio pode ser calculada com precisão, identificando os volumes em que as curvas cruzam (Figura 3B).
Um dos possíveis obstáculos a um ensaio de competição é bem sucedido se os parceiros de ligação se ligam uns aos outros, bem como a ligação a Rac1. Na Figura 3A + B demonstramos concorrência entre RCC2 eo domínio hélice de coronin-1C, em vez de full-length coronin-1C. A razão para o uso do coronin truncado que é coronin-1C, também se liga RCC2 através do domínio da cauda. Quando full-length coronin-1C é titulada contra RCC2, a ligação de ambas as proteínas for detectada, devido à formação de complexo ternário, em detrimento da concorrência (Figura 3C). Se a concorrência está ocorrendo, a ligação de uma proteína irá aumentar, enquanto o outro diminui, e total ligada GFP-fusão permanecerá constante. Nos casos em que um complexo ternário forma que é necessário para truncar uma das proteínas de ligação de modo a que a GTPase competitors não interagem.
Figura 1. Fluxo de Trabalho. Representação esquemática do fluxo de trabalho para determinar a afinidade de proteínas de ligação GTPase usando ensaios de competição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Validação de proteínas purificadas. (A) purificada Rac1 proteínas analisadas por Western blot de ligação, sondagem com anti-GFP para determinar o rendimento relativo das duas proteínas GFP. Este tipo de equalização durante a experiência permite que a concentração das duas proteínas de ser ajustada de modo a que eles correspondem na experiência de ligação. (B) GDP, GTPyS e não carregado de nucleotídeo GST-Rac1 foi incubado com ligado de HEK293T expressando GFP-TrioD1 e proteínas detectadas por conspirar para PAK1 endógena ou overexpressed GFP-TrioD1 obrigado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de Western blot de proteínas em relação vinculativa. Saídas Exemplo de ensaios de ligação da concorrência. (A) GDP-carregado Rac1 foi misturado com 5 jul GFP-coronin-1C domínio hélice e volumes crescentes de GFP-RCC2 foram titulados. Por proteínas ligadas Western blotting para GFP, problemas com a detecção diferencial das duas proteínas são evitados e o sinal GFP relata a proporção molar entre as duas proteínas de fusão. Os asteriscos indicam as relações de concorrência no eithelado r do ponto de equilíbrio. (B) intensidades das bandas de proteínas de fusão GFP encadernados de três experimentos independentes foram medidos por Western blot quantitativa, utilizando anticorpos e médias secundárias fluoróforos conspiraram para calcular a quantidade de RCC2 necessário para alcançar o equilíbrio. (C ) Exemplo de saída a partir de uma experiência em que as proteínas de ligação a Rac1 ligar uma à outra e formam um complexo ternário, em vez de competir. Rac1 foi misturado com 5 jul GFP-RCC2 e volumes crescentes de GFP-coronin-1C full-length carregado PIB foram titulados. O aumento no limite GFP-coronin-1C sem perda de limite GFP-RCC2 indica a formação do complexo ternário. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
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