Protocol
1. Purification de GTPase de la TPS-étiqueté
- Culture un E. coli comme BL21 transformées par pGEX-Rac1 O / N à 37 ° C, en agitant à 220 rpm, dans 500 ml de milieu de autoinduction (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM de Na 2 SO 4, MgSO 4 2 mM, CaCl2 2 mM, 0,5% de glycerol, 0,05% de glucose, 0,2% de lactose, 5 g de tryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 100 pg / ml d'ampicilline).
- Récolte de bactéries par centrifugation pendant 10 min à 10 000 xg, 4 ° C.
- Remettre en suspension culot bactérien dans 20 ml de réactif d'extraction de protéine, inhibiteur de la protéase 1x et incuber pendant 20 min à température ambiante avec inversion.
- Clarifier le lysat par centrifugation à 40 000 g pendant 30 min.
- Ajouter 2 ml de billes magnétiques de glutathion, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS: 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).
- Incuber pendant 2 h, le mélange par inversion à 4 ° C.
- Laver les billes de protéine chargée par quatre fois avec 10 ml de PBS, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape.
- Billes dans deux ml de PBS et les remettre en suspension la protéine magasin chargé à -80 ° C dans 100 ul de parties aliquotes jusqu'à utilisation.
2. Expression de protéines de liaison à GTPase
- La veille de l'expérience, des plasmides transfecter codant la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged versions de chaque protéine GTPase-contraignant dans un 75-cm 2 ballon séparé de HEK293T comme suit. Pour la validation des nucléotides chargement, transfect GFP-tagged TrioD1 dans un troisième de 75 cm 2 flacon de HEK293T.
- Diluer polyethylamine à 1 mg / ml dans 100 ul de NaCl 150 mM stérile.
- Ajouter 27 ul polyethylamine diluée à 223 ul réduits médias sériques.
- Ajouter ADN plasmidique de 12 ug à 250 pi réduits médias sériques.
- Incuber chaque tube pendant 2 minutes à température ambiante. Combinez le polyethylamine et l'ADN se mêle dans un seul tube et vortex pendant 2 min.
- Incuber pendant 15-20 min à température ambiante.
- Remplacez le support de croissance (milieu Eagle modifié Dulbecco, 10% de sérum fœtal bovin, 2 mM de L-glutamine, pas d'antibiotiques) sur 90% de confluence HEK293T avec 5 ml de milieu de croissance frais.
- Ajouter le mélange combiné polyethylamine / ADN à incuber la fiole et O / N à 37 ° C, 5% CO 2.
3. Purification des protéines de liaison à GTPase
- Rincer flacons de cellules transfectées dans du PBS et égoutter flacon pendant 5 minutes, aspirer le liquide libre.
- Racler les cellules dans 500 ul de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% de Nonidet P-40, 1x inhibiteur de protease) en tube de microcentrifugation.
- Lyse des cellules par mélange par inversion à 4 ° C pendant 30 min.
- Au cours de lyse, laver deux lots de 40 ul perles GFP-Trap trois fois avec le tampon de lyse frais, perles sédimentation à 2700 g pendant 2 min entre les lavages.
- Clarifier les lysats par centrifugation à 21 000 xg pendant 10 min.
- Transfert précisé lysat de chacune des protéines de concurrents pour séparer les perles lavées GFP-trap et permettent protéines GFP-fusion pour lier pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C. Gardez lysat de cellules GFP-TrioD1 sur la glace.
- Laver chargés perles GFP-Trap deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de NaCl, 0,7% (p / v) Nonidet P-40 et deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 2 , sédimentation perles à 2700 g pendant 2 min entre les lavages.
- Éluer les protéines de fusion GFP-40 ul en ajoutant 0,2 M de glycine (pH 2,5) et aspiration et refoulement pendant 30 sec. Immédiatement perles sédiments à 21 000 g pendant 60 s et le liquide de transfert à un nouveau tube de centrifugeuse contenant 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Le faire rapidement pour limiter les dommages à la protéine purifiée.
- Analyser 1 pi de chaque protéine purifiée par Western blot et la sonde avec un anticorps anti-GFP pour déterminer le rendement relatif en utilisant un Blott quantitativeing système selon le protocole du fabricant. En variante, la détermination des concentrations de protéines par l'acide (BCA) bicinchoninique dosage mais cela introduit des erreurs si les protéines ne réagissent pas avec le dosage d'une manière identique ou il ya protéines contaminantes.
- Égaliser la concentration molaire de la protéine par l'addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2.
4. Nucleotide chargement de GTPase
- Décongeler une aliquote de billes magnétiques TPS-Rac1, préparés à l'étape 1.
- Prendre 90 pl de billes de GST-Rac1 et laver trois fois avec 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape.
- Aspirer à partir du tampon de perles et ajouter 100 ul de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT, 4 mM d'EDTA.
- Selon que le PIB, GTP ou non nucléotidique chargement est nécessaire pour l'expérience de la concurrence, ajouter 12 ul PIB 100 mM, 12 mM ul gu 10anosine 5 '- [γ-thio] triphosphate (GTPyS) ou pas de nucléotides à 60 pi perles TPS-Rac1.
- Pour les contrôles nucléotidique de chargement, les billes restantes divisé en trois aliquotes de 10 ul et ajouter 2 ul de 100 mM de PIB, 2 ul de 10 mM de GTPyS non nucléotidique ou de chaque tube.
- Incuber les mélanges de billes pendant 30 min à 30 ° C avec agitation.
- Stabiliser nucléotidique liée Rac1 par addition de 1 M de MgCl2: 3 pi du mélange à expérimental (étape 4.4), 0,5 pi à chacun des mélanges de commande (étape 4.5).
5. Concurrence contraignant.
- Mettre en place 6 microtubes, contenant chacun:
200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2
10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l'étape (4.7)
5 ul de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant) - Pour chaque tube, ajouter 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 ul de protéine B de liaison à Rac1 (protéine de liaison variable). Ces volumes supposent unnviron concentrations d'achat d'actions égales des protéines de liaison constants et variables et peuvent avoir besoin d'être ajustée.
- Ajustez les volumes de protéines de liaison A et B, si il ya de grandes différences dans les affinités de liaison des deux protéines et cela devrait être déterminées empiriquement à travers les répétitions expérimentales. Porter au volume total du mélange de liaison à 235 ul par addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2.
- Mettre en place un tube de centrifugeuse contenant:
200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2
10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l'étape (4.7)
10 pi de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant) - Mettre en place le PIB, GTPyS et pas de tubes de contrôle de nucléotides:
200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2
10 pi de billes de Rac1 de contrôle chargés dans l'étape 4.5 avec le PIB, GTPyS ou non nucléotidique et stabilisées dans l'étape 4.7.
180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysat préparé comme dans l'étape 3.6
4 ul de MgCl2 1 M - Incuber le mélange pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C.
- Laver les billes trois fois avec 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2.
- Éluer les protéines liées dans 20 pi de tampon d'échantillon réducteurs (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% de SDS, 20% de glycerol, 0,02 mg / ml de bleu de bromophénol, 5% β-mercaptoethanol).
6. Analyse de la concurrence
- Résoudre 10 ul de la protéine liée (étape 5.6) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sodium (SDS-PAGE) et transfert de Western.
- Incuber la membrane à 4 ° CO / N en anticorps anti-GFP dilué 1/1000 dans un tampon bloquant dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20 pour détecter à la fois des protéines de liaison marquées GTPase.
- Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20.
- Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante dans 800 DyLight conjugué anti-lapin secanticorps secon-, dilué à 1 / 10.000 en tampon de blocage dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20.
- Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20.
- Analyser la membrane en utilisant un système d'imagerie infrarouge, en utilisant le logiciel pour mesurer l'intensité des bandes selon le protocole du fabricant.
- Tracer l'intensité de chaque bande de protéine par rapport au volume du concurrent variable (Protein B).
- Diviser le volume de concurrent variable au point où les lignes se croisent sur le volume d'concurrent constant (protéine A, 5 pi) pour déterminer le rapport de concurrent à laquelle l'équilibre est atteint.
- Pour la validation de l'état de chargement de nucleotides, des membranes de sonde pour p21-activated kinase 1 (PAK1) (un effecteur) et GFP-TrioD1 (a FEM), comme décrit dans les étapes 6.1-6.6.
Representative Results
Ce protocole est conçu pour calculer les affinités relatives des partenaires de liaison pour Rac1, sans avoir besoin de connaître la concentration précise des concurrents (Figure 1). Détermination de la concentration en protéine et introduit des erreurs lors de l'examen compétition entre les molécules dans une voie de signalisation préalable. Cependant, il est important de savoir que les deux concurrents ont la même concentration molaire dans les solutions de réserve pour permettre des rapports simples à calculer lors de l'ajout des volumes différents de l'essai. 40 ul de billes GFP-Trap ont une capacité de liaison de ~ 300 pmol de sorte qu'une confluence de 75 cm 2 flacons de très cellules exprimant se saturer les billes, de sorte que les préparations des deux protéines de liaison différents seront similaires avant l'ajustement (Figure 2A). Si l'on exprime les protéines de mal, ce problème peut être surmonté par la purification de cette protéine à partir de plus d'un flacon de cellules.
8 (figure 2B). GEFS lier préférentiellement au nucléotide sans GTPase de stabiliser l'état de transition. Comme GEF sont de faible abondance, habituellement inactifs et éponger souvent mal, il est préférable de surexprimer une FEM ou d'un fragment du FEM à l'essai gratuitement GTPase nucléotides. Nous utilisons souvent le premier homologie Dbl du Trio, exprimé comme une fusion GFP (GFP-TrioD1 9) (figure 2B), mais toute FEM travailler. Les protéines qui se lient à la GTPase de PIB chargé sont plus rares. Nous avons récemment rapporté RCC2 comme l'une telle protéine 7, ou le PIB de chargement peut être validé simplement comme binding à FEM ni ni effecteur.
La sortie à partir de l'expérience sera un transfert de Western illustrant les deux partenaires de liaison marqués GFP liés à la GTPase. En utilisant un seul anticorps pour détecter les deux protéines, les concentrations auxquelles des quantités similaires des deux concurrents se lient peuvent être déterminées et donc les affinités relatives déduites. Dans cet exemple, la concurrence entre le domaine de l'hélice de la protéine Rac1-trafic, coronine-1C (Rac1-binding protein A), et la protéine Rac1-séquestrant, RCC2 (Rac1-binding protein B), est démontré (figure 3A). En utilisant un volume constant de coronine-1C hélice (5 pi), et en ajoutant des volumes croissants de RCC2, nous pouvons voir de la GFP efface que l'équilibre est atteint à 1,25-2,5 ul de RCC2 (astérisque), démontrant que RCC2 a une plus forte affinité pour Rac1 que coronine-1C. En mesurant l'intensité des bandes en utilisant quantitative Western blot, et le tracé des valeurs moyennes pour chaque competitor, le point d'équilibre peut être calculée avec précision, en identifiant les volumes à laquelle se coupent les courbes (figure 3B).
L'un des obstacles possibles à un dosage de compétition est réussie si les partenaires de liaison se lient les uns aux autres ainsi que la liaison à Rac1. Dans la figure 3A + B nous démontrons la concurrence entre RCC2 et le domaine de l'hélice de coronine-1C, plutôt que sur toute la longueur coronine-1C. La raison pour utiliser le coronine tronquée est que coronine-1C se lie également RCC2 à travers le domaine de la queue. Lorsque pleine longueur coronine-1C est titré contre RCC2, la liaison de deux protéines est détectée, en raison de la formation complexe ternaire, plutôt que la concurrence (figure 3C). Si la concurrence est en cours, la liaison d'une protéine va augmenter tandis que les autres baisses, et lié total GFP-fusion restera constant. Dans les cas où un complexe ternaire se forme, il est nécessaire de tronquer une de la protéine GTPase se liant de sorte que la competvisi- plus interagir.
Figure 1. Workflow. Représentation schématique du flux de travail pour déterminer l'affinité des protéines de GTPase liaison en utilisant des analyses de la concurrence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La validation des protéines purifiées. (A) purifiée GFP-étiqueté protéines analysées par transfert de Western de liaison, sondant avec anti-GFP pour déterminer le rendement relatif des deux protéines Rac1. Ce type d'égalisation pendant l'expérience permet la concentration des deux protéines à être réglé de façon qu'ils correspondent à l'expérience de liaison. (B) GDP, GTPyS et aucun nucléotide chargé TPS-Rac1 a été incubé avec un lysat de HEK293T exprimant la GFP-TrioD1 et protéines détectées en traçant pour PAK1 endogène ou surexprimé GFP-TrioD1 liés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse par Western blot de la protéine par rapport Exemple sorties contraignant. À partir des essais de compétition de liaison. (A) PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-coronine-1C domaine de l'hélice et de l'augmentation des volumes de GFP-RCC2 ont été titrés en jeu. En Western blot des protéines liées à GFP, des problèmes avec détection différentielle des deux protéines sont évités et le signal de la GFP indique le rapport molaire entre les deux protéines de fusion. Les astérisques indiquent les rapports de concurrence sur eithecôté r du point d'équilibre. (B) des intensités de bande des protéines liées à la GFP de fusion de trois expériences indépendantes ont été mesurées par quantitative Western Blot, en utilisant des anticorps et moyennes secondaires fluorophores conjugué comploté pour calculer le montant de RCC2 nécessaire pour atteindre l'équilibre. (C ) Exemple de sortie à partir d'une expérience dans laquelle des protéines de liaison à Rac1 lient les unes aux autres et forment un complexe ternaire, au lieu de la compétition. PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-RCC2 et l'augmentation des volumes de GFP-coronine-1C pleine longueur ont été titrés. L'augmentation liée GFP-coronine-1C sans perte de borne GFP-RCC2 indique formation d'un complexe ternaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
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