Protocol
1. Reinigung von GST-tagged GTPase
- Kultur ein E. coli-Stamm, wie beispielsweise BL21 mit pGEX-Rac1 O / N transformierten bei 37 ° C, bei 220 Upm Schütteln in 500 ml Autoinduktion Medium (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 0,5% Glycerin, 0,05% Glucose, 0,2% Lactose, 5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 100 ug / ml Ampicillin).
- Ernte Bakterien durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 × g, 4 ° C.
- Resuspendieren Bakterienpellet in 20 ml Protein Extraktionsreagens, 1x Proteaseinhibitor und Inkubation für 20 min bei RT mit Inversion.
- Klärung des Lysats durch Zentrifugation bei 40.000 xg für 30 min.
- 2 ml Glutathion-magnetische Kügelchen, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Inkubation für 2 h, das Mischen durch Inversion bei 4 ° C.
- Viermal Waschen Kügelchen proteinbeladene mit 10 ml PBS unter Verwendung eines magnetischen Teilchens Sortierer, um die Perlen in jedem Schritt auszufällen.
- Resuspendieren Protein beladenen Kügelchen in 2 ml PBS und bei -80 ° C in 100 ul Aliquots bis sie benötigt.
2. Expression von GTPase-bindenden Proteinen
- Am Tag vor dem Experiment Transfektion Plasmide grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert -markierte Versionen jedes GTPase-bindenden Proteins in einem separaten 75-cm 2 -Kolben von HEK293T wie folgt. Zur Validierung von Nukleotid-Laden, transfizieren GFP-markierten TrioD1 in ein drittes 75-cm 2-Kolben von HEK293T.
- Verdünnter polyethylamine bis 1 mg / ml in 100 & mgr; l sterilem 150 mM NaCl.
- In 27 ul verdünnt polyethylamine bis 223 & mgr; l reduziert Serum Medien.
- In 12 & mgr; g Plasmid-DNA zu 250 & mgr; l reduziert Serum Medien.
- Inkubieren jedes Röhrchen für 2 min bei RT. Kombinieren Sie die polyethylamine und DNA vermischt sich in einem einzigen Rohr und Vortex für 2 min.
- Inkubieren Sie für 15-20 min bei RT.
- Ersetzen Sie das Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, keine Antibiotika), die auf 90% konfluent HEK293T mit 5 ml frisches Wachstumsmedium.
- In der kombinierten polyethylamine / DNA-Gemisch in den Kolben und Inkubation O / N bei 37 ° C, 5% CO 2.
3. Reinigung der GTPase-bindenden Proteinen
- Spülen Sie die Flasche aus transfizierten Zellen in PBS und Drain-Kolben für 5 min, Absaugen freie Flüssigkeit.
- Abzukratzen Zellen in 500 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x Proteaseinhibitor) in Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zellen lysieren durch Mischen durch Inversion bei 4 ° C für 30 min.
- Während der Lyse, waschen zwei Lose von 40 ul GFP-Trap-Kügelchen dreimal mit frischem Lysepuffer, sedimentierenden Perlen bei 2700 × g für 2 Minuten zwischen den Waschvorgängen.
- Klärung Lysate durch Zentrifugation bei 21.000 × g für 10 min.
- Übertragungs geklärte Lysat eines jeden der Wettbewerber Proteine gewaschen GFP-trap Perlen abzutrennen und zu ermöglichen GFP-Fusionsproteine, für 2 h binden, Mischen durch Umdrehen bei 4 ° C. Halten Lysat aus GFP-TrioD1 Zellen auf Eis.
- Zweimal waschen geladen GFP-Trap-Perlen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 und zweimal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 , sedimentierenden Perlen bei 2700 × g für 2 Minuten zwischen den Waschgängen.
- Eluieren GFP-Fusionsproteinen durch Zugabe von 40 ul 0,2 M Glycin (pH 2,5) und Auf- und Abpipettieren für 30 sec. Sofort Sediment Kügelchen bei 21.000 × g für 60 s und Transferflüssigkeit auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 4 & mgr; l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Tun dies schnell zur Beschädigung des gereinigten Proteins zu begrenzen.
- Analyse 1 ul jedes gereinigten Proteins durch Western-Blot und die Sonde mit einem anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute herzustellen unter Verwendung eines quantitativen Blotting System gemäß dem Protokoll des Herstellers. Alternativ bestimmen Proteinkonzentrationen von Bicinchoninsäure (BCA) Assay aber dies führt Fehler, wenn die Proteine nicht mit dem Assay in einer identischen Weise reagiert oder es kontaminierende Proteine.
- Leichen molaren Proteinkonzentration durch die Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2.
4. Nucleotide Belastung der GTPase
- Tauwetter ein Aliquot von GST-Rac1 magnetische Kügelchen, die in Schritt 1 hergestellt.
- Nehmen 90 ul von GST-Rac1 Perlen und dreimal mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, unter Verwendung eines magnetischen Partikelsortierer, um die Perlen in jedem Schritt auszufällen.
- Saugen Sie Puffer aus Perlen und fügen Sie 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
- Je nachdem, ob das BIP, GTP oder keine Nukleotid-Belastung für den Wettbewerb Experiment erforderlich, fügen Sie 12 ul 100 mM BIP, 12 & mgr; l 10 mM guanosine 5 '- [γ-thio] Triphosphat (GTP & ggr;) oder keine Nukleotid bis 60 & mgr; l GST-Rac1 Perlen.
- Für die Nukleotid-Ladesteuerungen, teilen Sie die restlichen Perlen in drei 10-ul-Aliquots und fügen Sie 2 ul 100 mM GDP, 2 & mgr; l 10 mM GTPyS oder keine Nukleotid in jedes Röhrchen.
- Inkubieren Wulst Mischungen für 30 Minuten bei 30 ° C unter Rühren.
- Stabilisierung Nucleotid gebundene Rac1 durch Zugabe von 1 M MgCl 2: 3 & mgr; l auf die Versuchsmischung (Schritt 4.4), 0,5 & mgr; l zu jeder der Kontrollmischungen (Schritt 4.5).
5. Wettbewerb bindend.
- Einrichten 6 Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils:
200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2
10 & mgr; experimentelle Nukleotid-beladenen Rac1-Perlen (ab Schritt 4.7)
5 ul Rac1-bindenden Protein A (Konstante Bindungsprotein) - Zu jedem Röhrchen hinzu 0, 1, 2,5, 5, 10 oder 20 ul Rac1-bindendes Protein B (variable Bindungsprotein). Diese Bände davon ausgehen, approximately gleich stock Konzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine und muss unter Umständen angepasst werden.
- Einstellen Volumina bindende Proteine A und B, wenn es große Unterschiede in den Bindungsaffinitäten der beiden Proteine und dies sollte empirisch durch die Versuchswiederholungen bestimmt werden. Bilden das Gesamtvolumen des Bindungsgemisch auf 235 & mgr; l durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2.
- Einrichtung eines Mikrozentrifugenröhrchen enthält:
200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2
10 & mgr; experimentelle Nukleotid-beladenen Rac1-Perlen (ab Schritt 4.7)
10 ul Rac1-bindenden Protein A (Konstante Bindungsprotein) - Einrichten des BIP, GTPyS und keine Nukleotid-Kontrollröhrchen:
200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2
10 ul Steuer Rac1 Perlen in Schritt 4.5 mit dem BIP, GTPyS oder kein Nukleotid geladen und in Schritt 4.7 stabilisiert.
180 ul HEK293T GFP-TrioD1 Lysat, wie in Schritt 3.6 hergestellten
4 & mgr; l 1 M MgCl 2 - Inkubieren der Mischung für 2 h, das Mischen durch Inversion bei 4 ° C.
- Dreimal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 Waschen der Kügelchen.
- Eluieren die gebundenen Proteine werden in 20 ul reduzierendem Probenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% Glycerin, 0,02 mg / ml Bromphenolblau, 5% β-Mercaptoethanol).
6. Analyse der Wettbewerbs
- Beheben 10 ul des gebundenen Proteins (Schritt 5.6), bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot.
- Inkubieren der Membran bei 4 ° CO / N im anti-GFP-Antikörper, verdünnt 1/1000 in Blockierungspuffer verdünnt, in PBS 1X, 0,1% Tween-20 auf die beiden markierten GTPase-bindende Proteine erkennen.
- Dreimal 10 min mit PBS, 0,1% Tween-20 waschen der Membran.
- Inkubieren der Membran für 30 min bei RT in 800 DyLight konjugiertem Anti-Kaninchen-secondary Antikörper, verdünnt 1 / 10.000 in Blockierungspuffer verdünnt, in PBS, 0,1% Tween-20 1 x auf.
- Dreimal 10 min mit PBS, 0,1% Tween-20 waschen der Membran.
- Scannen der Membran unter Verwendung eines Infrarot-Abbildungssystem mit der Software, um die Bandintensität nach dem Protokoll des Herstellers gemessen.
- Zur Erstellung der Bandintensität jedes Proteins vor der Verstellpumpe Konkurrent (Protein B).
- Teilen das Volumen der variable Konkurrent an dem Punkt, an dem die Linien sich durch das Volumen konstant Konkurrent (Protein A, 5 & mgr; l), um den Konkurrenzverhältnis, bei dem ein Gleichgewicht erreicht bestimmen.
- Zur Validierung der Nukleotid-Ladezustand, Sondenmembranen für p21-activated kinase 1 (PAK1) (ein Effektor) und GFP-TrioD1 (a GEF), wie in den Schritten 6.1-6.6 beschrieben.
Representative Results
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für Rac1 zu berechnen, ohne die Notwendigkeit, die genaue Konzentration der Wettbewerber zu geben (Abbildung 1). Bestimmung der Proteinkonzentration führt Fehler und bei der Betrachtung der Wettbewerb zwischen Molekülen in einem Signalweg, ist nicht erforderlich. Jedoch ist es wichtig zu wissen, dass die beiden Wettbewerber haben die gleiche molare Konzentration in der Stammlösungen für einfache, Verhältnisse berechnet werden, wenn die Zugabe verschiedener Volumina auf den Test. 40 ul von GFP-Trap-Perlen eine Bindungskapazität von ~ 300 pmol so eine konfluente 75 cm 2-Kolben hoch exprimierenden Zellen werden die Perlen zu sättigen, mit dem Ergebnis, dass die Vorbereitungen der beiden unterschiedlichen Bindungsproteine ähnlich vor Anpassung (Abbildung 2A). Wenn eines der Proteine schlecht exprimiert, kann dieses Problem durch Reinigen dieses Proteins aus mehr als einem Kolben von Zellen überwunden werden können.
8 (2B) erfasst werden. GEFs Substanzen binden Nukleotid freien GTPase den Übergangszustand zu stabilisieren. Wie GEFs sind von geringer Menge, in der Regel nicht aktiv und häufig schlecht auslöschen, ist es besser, ein GEF oder GEF-Fragment zu Test Nukleotid-freien GTPase überexprimieren. Wir verwenden häufig die erste Dbl Homologie von Trio, ausgedrückt als GFP-Fusions (GFP-TrioD1 9) (2B) aber jede GEF funktionieren würde. Proteine, die an der BIP-geladen GTPase binden, sind seltener. Vor kurzem berichteten wir RCC2 als eine solche Protein 7 oder BIP-Belastung kann einfach als bindi validiert werdenng bis weder GEF noch Effektorzellen.
Der Ausgang aus dem Experiment wird ein Western-Blot-Darstellung die beiden GFP-markierten Bindungspartner für die GTPase gebunden sein. Durch die Verwendung eines einzelnen Antikörpers, beide Proteine zu erkennen, können die Konzentrationen, bei denen gleiche Mengen der beiden Wettbewerber binden bestimmt und daher die relativen Affinitäten abgeleitet. In diesem Beispiel ist der Wettbewerb zwischen dem Propeller-Domäne des Rac1-Trafficking-Protein Coronin-1C (Rac1-bindenden Protein A) und die Rac1 sequestrierenden Protein RCC2 (Rac1-bindendes Protein B) wird nachgewiesen (3A). Unter Verwendung eines konstanten Volumens Coronin 1C Propeller (5 ul), und das Hinzufügen von steigenden Mengen von RCC2, wir von der GFP sehen auslöschen, dass ein Gleichgewicht bei 1,25-2,5 ul RCC2 (Sternchen) erreicht ist, was zeigt, dass RCC2 hat eine stärkere Affinität für Rac1 als Coronin-1C. Durch Messen der Intensität der Banden mittels quantitativer Western Blot und Aufzeichnen der Mittelwerte für jede competitor kann der Gleichgewichtspunkt genau durch Ermittlung der Mengen an denen die Kurven schneiden (3B) berechnet werden.
Eine der möglichen Hindernisse für eine erfolgreiche Konkurrenz-Assay ist, wenn die Bindungspartner miteinander sowie die Bindung an Rac1 binden. In 3A + B zeigen wir den Wettbewerb zwischen RCC2 und Propeller-Domäne von Coronin-1C, anstatt voller Länge Coronin-1C. Der Grund für die Verwendung des trunkierten Coronin dass Coronin 1C bindet ebenfalls RCC2 durch die Schwanzdomäne. Bei voller Länge Coronin-1C gegen RCC2 titriert, Bindung beider Proteine erkannt wird, aufgrund von ternären Komplexbildung, anstatt den Wettbewerb (3C). Wenn Konkurrenz auftritt, wird Bindung eines Proteins, während das andere abnimmt erhöhen und gesamte gebundene GFP-Fusions konstant. In Fällen, in denen ein ternärer Komplex bildet es notwendig ist, eine der GTPase-bindendes Protein abzuschneiden, so dass der competitors nicht mehr interagieren.
Abbildung 1. Arbeitsablauf. Schematische Darstellung der Arbeitsablauf zur Bestimmung der Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Konkurrenz-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Validierung von gereinigten Proteinen. (A) gereinigtes GFP-markierten Rac1 bindenden Proteinen durch Western-Blot analysiert, Sondierung mit Anti-GFP, um die relative Ausbeute der beiden Proteine zu bestimmen. Diese Art von Entzerrung während des Experiments kann die Konzentration der beiden Proteine angepasst werden, so dass sie in dem Bindungsexperiment übereinstimmen. (B) GDP, GTPyS und keine Nukleotid-beladenen GST-Rac1 mit Lysat aus HEK293T, die GFP-TrioD1 Proteine durch Auftragen einer endogenen PAK1 oder überexprimiert GFP-TrioD1 erkannt inkubiert und gebunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Western-Blot-Analyse der relativen Proteinbindung. Beispiel Ausgaben von Konkurrenz-Bindungs-Assays. (A) BIP belasteten Rac1 wurde mit 5 ul GFP-Coronin-1C-Propellerdomäne gemischt und steigenden Mengen von GFP-RCC2 wurden titriert. Durch Westernblot gebundenen Proteine GFP, sind Probleme mit der Differenzerfassung der beiden Proteine vermieden und das GFP-Signal meldet das Molverhältnis zwischen den beiden Fusionsproteinen. Sternchen zeigen die Wettbewerbsverhältnisse auf either Seite des Gleichgewichtspunkt. (B) Bandenintensitäten von gebundenem GFP-Fusionsproteinen aus drei unabhängigen Experimenten wurden durch quantitative Western-Blotting gemessen, wobei Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern und Mittelwerte aufgetragen, um die Menge an RCC2 Berechnung erforderlich, um das Gleichgewicht zu erreichen. (C ) Ausgabe aus einem Experiment, wo Rac1-bindende Proteine binden aneinander und bilden einen ternären Komplex, anstatt konkurrierende. BIP belasteten Rac1 wurde mit 5 ul GFP-RCC2 gemischt und steigenden Mengen von GFP-Coronin-1C in voller Länge wurden ohne Verlust an gebundenem GFP-RCC2 titriert. Der Anstieg der gebundenen GFP-Coronin-1C zeigt ternären Komplexbildung. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
