Protocol
1.净化GST标记的GTP酶
- 文化的E.大肠杆菌菌株如大肠杆菌BL21转化的质粒pGEX-Rac1的O / N在37℃下，振荡以220rpm，在500ml自身诱导培养基（25mM的磷酸氢二钠，25mM的KH 2 PO 4，50mM的氯化铵 ， 5mM的用 Na 2 SO 4，2mM的硫酸镁 ，2毫氯化钙 ，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，5克蛋白胨，2.5克酵母提取物，100微克/毫升氨苄青霉素）。
- 收获细菌通过离心10分钟以10,000×g离心，4℃。
- 重悬细菌沉淀在20ml蛋白质提取试剂，1×蛋白酶抑制剂孵育20分钟，在室温将其与倒置。
- 澄清裂解液离心以40,000×g离心30分钟。
- 加2ml谷胱甘肽磁珠，用磷酸盐缓冲盐水（PBS：10mM的磷酸氢二钠，1.8毫KH 2 PO 4，137 mM氯化钠，2.7毫米氯化钾）。
- 孵育2小时后，通过倒转在4℃下混合。
- 用10ml PBS洗涤蛋白加载珠四次，使用磁粉分拣以沉淀珠粒在每一个步骤。
- 重悬蛋白质装载于2ml PBS中珠和储存在-80℃下在100μl等份直到需要。
GTP酶结合蛋白2的表达
- 一天实验前，转染的质粒编码绿色荧光蛋白（GFP）-tagged每个GTP酶结合蛋白的版本到一个单独的75-cm 2的烧瓶HEK293T的如下。对于核苷酸装载的验证，转染GFP标记TrioD1到第三个75厘米2瓶HEK293T的。
- 稀释polyethylamine至1mg / ml，在100μl的无菌150mM的NaCl洗涤。
- 加入27微升稀释polyethylamine至223微升减少血清的培养基。
- 加12微克质粒DNA到250微升减少血清的培养基。
- 孵育各管在室温2分钟。 结合polyethylamine和在单管中，涡旋2分钟的DNA混合。
- 下室温温育15-20分钟。
- 用5毫升新鲜生长培养基更换生长培养基（Dulbecco氏改良的Eagle介质，10％牛胎儿血清，2mM的L-谷氨酰胺，不含抗生素）上90％汇合的HEK293T。
- 将合并的polyethylamine / DNA混合物添加到该烧瓶中，并培育O / N在37℃，5％ 的 CO 2。
3.纯化GTP酶结合蛋白的
- 冲洗转染的细胞在PBS中的烧瓶和漏极烧瓶5分钟，吸出游离的液体。
- 刮去细胞在500μl裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl（pH7.8），1％的Nonidet P-40，1×蛋白酶抑制剂）到微量离心管中。
- 裂解细胞通过倒置，在4℃下进行30分钟的混合。
- 在裂解，洗两批40微升GFP-陷阱珠三次新鲜的裂解液，沉淀的珠2,700 XG的洗涤之间2分钟。
- 澄清的裂解物通过离心21,000×g离心10分钟。
- 转印澄清每个参赛者的蛋白质分离洗涤GFP-陷阱珠和允许的GFP融合蛋白结合2小时的裂解物，由倒置，在4℃下混合。保持溶胞产物从GFP-TrioD1细胞在冰上。
- 在50mM的Tris-HCl（pH值7.8），50mM NaCl中洗两次加载GFP-陷阱珠，0.7％（重量/体积）的Nonidet P-40的和两次在50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的，2,700 xg离心洗涤之间2分钟沉降珠。
- 通过加入40微升的0.2M甘氨酸（pH值2.5）和移液器上下吹吸30秒洗脱GFP的融合蛋白。立即沙珠在21000 XG为60秒和转让液含有4微升的1M的Tris-HCl（pH值10.4），一个新的离心管中。做到这一点很快，限制损坏纯化蛋白。
- 分析1微升通过Western印迹和探针用抗GFP抗体每种纯化蛋白的使用定量blott建立相对产量根据制造商的协议的系统上。可替代地，确定的蛋白浓度通过二辛可宁酸（BCA）测定法但这会引入错误，如果蛋白质不与化验反应中以相同的方式或有污染蛋白质。
- 通过加入50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的摩尔相等蛋白质浓度。
GTP酶的4核苷酸装
- 解冻的GST-Rac1的磁珠，在步骤1中制备一个等份。
- 采取90微升的GST-Rac1的珠和洗涤三次用20mM的Tris-HCl（pH为7.6），25 mM氯化钠，0.1mM的DTT，4mM EDTA的，使用磁性粒子分选器以沉淀珠粒在每一个步骤。
- 从珠吸缓冲区，并添加100微升20毫米的Tris-HCl（pH值7.6），25毫米氯化钠，0.1毫米DTT，4毫摩尔EDTA。
- 根据国内生产总值，GTP或没有加载核苷酸是否需要竞争的实验中，加入12微升100毫米的GDP，12微升10毫区anosine 5' - [γ-硫代]三磷酸（GTPγS）或无核苷酸到60微升的GST-Rac1的珠。
- 对于核苷酸负荷控制，分割剩余的珠串成三个10微升等份，并添加2微升100毫米GDP，2微升10毫米GTPγS或无核苷酸，每管。
- 孵育珠混合物30分钟，在30℃下搅拌。
- 稳定通过加入1M MgCl 2的核苷酸结合的Rac1：3μl到实验混合物（步骤4.4），0.5微升至每个控制混合（步骤4.5）的。
5.竞争结合。
- 设立了6个离心管，每片含：
200微升的50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的
10微升试验核苷酸加载Rac1的珠（来自步骤4.7）
5微升Rac1的结合蛋白A（常结合蛋白） - 到各管中，加入0,1，2.5，5，10或20微升的Rac1结合蛋白B（可变结合蛋白）。这些卷假设pproximately等于库存浓度恒定和可变结合蛋白的，并可能需要调整。
- 调节结合蛋白A和卷乙如果在两种蛋白质的结合亲和力大的差异，这应根据经验通过实验重复来确定。补结合混合物与235微升的总体积通过加入50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的。
- 建立含有微量离心管：
200微升的50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的
10微升试验核苷酸加载Rac1的珠（来自步骤4.7）
10微升Rac1的结合蛋白A（常结合蛋白） - 成立了国内生产总值，GTPγS无核苷酸对照管：
200微升的50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的
10微升控制Rac1的珠子装入步骤4.5与GDP，GTPγS或无核苷酸和稳定步骤4.7。
180微升水中EK293T GFP-TrioD1裂解物，制备如步骤3.6
4微升1M的氯化镁 - 2小时孵育该混合物中，通过倒转在4℃下混合。
- 用50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的MgCl 2的洗珠三次。
- 洗脱结合的蛋白于20μl还原样品缓冲液（50mM的Tris-HCl（pH 7）中，5％的SDS，20％甘油，0.02毫克/毫升溴酚蓝，5％β巯基乙醇）。
竞争6.分析
- 解决将10μl结合蛋白（步骤5.6）的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹。
- 孵育该膜在4℃的CO / N的抗GFP抗体在封闭缓冲液稀释1/1000稀释于PBS 1倍，0.1％Tween-20的同时检测标记的GTP酶结合蛋白。
- 10分钟，用PBS，0.1％Tween-20的洗膜三次。
- 在DyLight孵育膜在室温30分钟800缀合的抗兔秒ondary抗体，稀释1 / 10,000中的封闭缓冲液稀释在PBS，0.1％Tween-20的1倍。
- 10分钟，用PBS，0.1％Tween-20的洗膜三次。
- 扫描使用红外成像系统的膜，使用该软件根据制造商的协议来测量带强度。
- 图中的每个蛋白的带强度对变量的竞争对手（蛋白B）的量。
- 除以变量竞争者的体积在的点上的线相交由恒定竞争者（蛋白A，5微升）的容积，以确定在哪些达到平衡的竞争者比率。
- 为了验证核苷酸负荷状态，探测膜的按照步骤6.1-6.6中描述的p21激活激酶1（PAK1）（效应）和GFP-TrioD1（全球环境基金）。
Representative Results
这个协议设计为计算Rac1的结合伴侣的相对亲和力，而不需要知道的竞争者的精确浓度（ 图1）。蛋白浓度的测定将错误引入并考虑分子之间竞争时在一个信号通路是不需要的。但是，重要的是要知道，两个竞争者具有相同摩尔浓度的储备溶液，以允许简单的比率来计算的添加不同量的测定时。 40微升的GFP-陷阱珠具有的〜300皮摩尔如此汇合75厘米2烧瓶高度表达细胞将饱和的珠子，其结果是在两个不同的结合蛋白的制剂将是调整前相似的结合能力（图2A）。如果蛋白质之一表示较差，这个问题可以通过纯化蛋白质从细胞中的一个以上的烧瓶被克服。
8（图2B）进行检测。 GEFS优先结合到核苷酸的无GTP酶稳定过渡状态。由于全环基金是丰度低，通常不活跃的，经常涂抹不好，最好是过表达或全球环境基金GEF片段的核苷酸检测无GTP酶。我们经常使用第一张双人同源重奏的，表示为GFP融合（GFP-TrioD1 9）（图2B），但任何环基金会工作。结合对GDP加载GTP酶蛋白质是罕见的。我们最近报道RCC2作为一个这样的蛋白7，占GDP加载可以简单地为宾迪验证纳克既不全球环境基金，也不效应。
从实验的输出将是一个Western印迹描绘绑定到GTP酶两个GFP标记的结合伴侣。通过使用单一抗体来检测两种蛋白质，在该类似量既是竞争对手的结合浓度可被确定，因此，相对亲和力推断。在Rac1的拐蛋白的螺旋桨结构域之间的这种实施例的竞争，coronin-1C（Rac1的结合蛋白A）中，和Rac1的-截存蛋白，RCC2（Rac1的结合蛋白B）证明（图3A）。通过使用coronin-1C螺旋桨（5微升）的恒定体积，并加入RCC2体积增加，我们可以从GFP看到涂抹达到平衡在1.25-2.5微升RCC2（星号）的，这表明RCC2具有更强对于Rac1的比coronin-1C亲和力。通过测量用定量免疫印迹条带的强度，并绘制平均值为每个competitoR，平衡点可以准确地通过识别在该曲线相交（图3B）的卷来计算。
其中一个可能的障碍一个成功的竞争测定法是，如果结合伴侣结合到彼此以及结合Rac1的。在图3A + B我们证明RCC2和coronin-1C的螺旋桨域之间的竞争，而不是全长coronin-1C。之所以使用截短coronin是coronin-1C还通过尾域结合RCC2。当全长coronin-1C滴定针对RCC2，两种蛋白的结合进行检测，由于三元复合物形成，而不是竞争（图3C）。如果竞争的现象发生，一种蛋白质结合会增加，而其他的减少，总的约束GFP融合将保持不变。的情况下一个三元复合物形成，有必要截断GTP酶结合蛋白之一，使得competitors不再进行交互。
图1.工作流程。工作流程来确定使用竞争性试验GTP酶结合蛋白的亲和力的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.验证纯化的蛋白质。 （A）纯化 GFP标记的Rac1结合通过蛋白质印迹分析的蛋白质，具有抗GFP探测，以确定两个蛋白的相对产率。这在实验期间类型均衡允许调整两种蛋白质的浓度，以便它们在结合实验匹配。（B）中的GD磷，GTPγS无核苷酸加载GST-Rac1的培养与HEK293T裂解表达GFP-TrioD1和约束绘制了内源性PAK1或过表达GFP-TrioD1检测蛋白质。 请点击此处查看该图的放大版本。
相对蛋白质的图3.蛋白质印迹分析 ，从竞争结合测定结合。实施例输出。（A）中的GDP加载的Rac1中加入5微升的GFP-coronin-1C螺旋桨域和增加的GFP-RCC2的体积滴定，通过Western印迹结合的蛋白质的GFP，与差分检测两种蛋白质的问题被避免和GFP信号报告两个融合蛋白之间的摩尔比。星号表示在eithe竞争比例平衡点的R侧。（B）的来自三个独立实验结合GFP融合蛋白的谱带强度通过定量蛋白质印迹法测定，使用荧光标记的二抗和平均数作图来计算RCC2的量需要以达到平衡。（℃从一个实验，其中Rac1的结合蛋白结合到彼此并形成三元复合物，而不是竞争）实施例输出。 GDP-加载 的Rac1中加入5微升的GFP-RCC2和增加的GFP-coronin-1C全长的体积滴定。在结合的GFP-coronin-1C的增加没有约束的GFP-RCC2的损耗表示三元复合物的形成。 请点击此处查看该图的放大版本。
Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
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