競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

Protocol

GST標識GTPアーゼの1精製

1. 文化E.そのような220rpmで振盪しながら37℃でのpGEX-Rac1のO / Nで形質転換されたBL21として大腸菌株 、自己誘導培地500ml中（中の25mMのNa ₂ HPO _4、25mMの_KH 2 PO _4、50mMのNH _{4 Clを} 、 5ミリモル_の Na 2 SO _4、2mMの_MgSO 4を、2ミリモルのCaCl _2、0.5％グリセロール、0.05％グルコース、0.2％のラクトース、5 gでトリプトン、2.5グラムの酵母エキス、100μg/ mlのアンピシリン）。
2. 万XG、4℃で10分間の遠心分離によって収穫細菌。
3. 20 mlのタンパク質抽出試薬中に細菌ペレットを再懸濁し、1×プロテアーゼ阻害剤および逆に室温で20分間インキュベートします。
4. 30分間40,000×gで遠心分離することによって、溶解物を明確にします。
5. リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、2 mlのグルタチオン磁気ビーズ、追加（PBS：10mMののNa ₂ HPO _4、1.8mMの_KH 2 PO _4、137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム）。
6. 4℃での反転により混合、2時間インキュベートします。
7. 各ステップで、ビーズを沈殿させ、磁性粒子ソーターを使用して、10 mlのPBSでタンパク質を負荷したビーズを4回洗浄します。
8. 必要になるまで再懸濁し、100μlのアリコートで-80℃で2mlのPBS中のビーズと店をタンパク質ロードされています。

GTPアーゼ結合タンパク質の2発現

1. 次のように一日の実験の前に、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするプラスミドをトランスフェクションHEK293Tの別個の^75-cm 2のフラスコにそれぞれのGTPアーゼ結合タンパク質のバージョン-タグ。ヌクレオチド負荷の検証のために、HEK293Tの第^75-cm 2のフラスコにGFPタグTrioD1をトランスフェクション。
   1. 100μl中の1mg / mlの滅菌150mMのNaClにポリエチルアミンを希釈します。
   2. 223μlの減少血清培地に27μlの希釈したポリエチルアミンを追加します。
   3. 250μlの減少血清培地に12μgのプラスミドDNAを追加します。
   4. 室温で2分間、各チューブをインキュベートします。 ポリエチルアミンを結合し、DNAが2分間の単一の管、ボルテックスで混合します。
   5. 室温で15〜20分間インキュベートします。
   6. 5ミリリットルの新鮮な増殖培地と90％のコンフルエントHEK293Tに増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、抗生物質なし）を交換してください。
   7. フラスコに合わせたポリエチルアミン/ DNA混合物を追加し_{、37℃、5％CO} 2でO / Nインキュベートします。

GTPアーゼ結合タンパク質の精製3.

1. PBS中でトランスフェクトされた細胞のフラスコをすすぎ、5分間フラスコをドレイン、自由な液体を吸引します。
2. マイクロチューブに500μlの溶解バッファー（50 mMトリス - 塩酸（pH7.8）、1％のNonidet P-40、1×プロテアーゼ阻害剤）で細胞を削り取ります。
3. 4℃で30分間転倒混和することによって溶解細胞。
4. 溶解中に、洗浄の間に2分間2700×gで40μlのGFP-トラップビーズの2つのロットの新鮮な溶解緩衝液で3回、沈降ビーズを洗います。
5. 10分間21,000×gでの遠心分離によって溶解物を明確にします。
6. 転送は、4℃で転倒混和し、洗浄し、GFP-トラップビーズを分離し、GFP融合タンパク質は2時間結合させるための競合タンパク質のそれぞれの溶解液を明らかにしました。氷上でGFP-TrioD1細胞からの溶解物を保管してください。
7. 50mMトリス-塩酸（pHは7.8）、50mMのNaClで二回ロードされたGFP-トラップビーズを洗浄し、0.7％（W / v）のノニデットP-40及び倍の50mMのTris-HCl（pHは7.6）で、20mMの_MgCl 2を、洗浄の間に2分間2700×gでビーズを沈降。
8. 40μlの0.2 Mグリシン（pHは2.5）を追加し、30秒間上下にピペッティングにより、GFP融合タンパク質を溶出させます。 4μlの1 Mトリス塩酸（pH値10.4）を含む新しいマイクロチューブに60秒と転送液の21,000×gですぐに土砂ビーズ。精製タンパク質への損傷を制限するために迅速にこれを行います。
9. 定量blottを使用して相対収率を確立するために、抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットおよびプローブによる各精製タンパク質の1μLを分析製造業者のプロトコルに従ってシステムをる。別の方法として、ビシンコニン酸（BCA）アッセイによりタンパク質濃度を決定するが、タンパク質は同じ方法でアッセイと反応しないか、夾雑タンパク質が存在する場合、これはエラーを紹介します。
10. 50mMトリス-塩酸（pHは7.6）、20mMの_MgCl 2を添加することによってタンパク質のモル濃度を均一。

GTPアーゼの4ヌクレオチドの読み込み

1. ステップ1で調製したGST-Rac1の磁気ビーズの1つのアリコートを解凍します。
2. GST-Rac1のビーズの90μLを取り、20mMのトリス-HCl（pHは7.6）で3回洗浄し、各ステップでビーズを沈殿させ、磁性粒子ソーターを使用して、25mMの塩化ナトリウム、0.1mMのDTT、4mMのEDTA、。
3. 吸引除去ビーズからのバッファおよび25mMのNaCl、0.1mMのDTT、4 mMのEDTA、100μlの20 mMトリス - 塩酸（pHは7.6）を追加します。
4. GDP、GTP又は全くヌクレオチド負荷が競合実験のために必要とされているかどうかによると、12μlの100 mMのGDP、12μlの10 mMのGUを追加anosine 5 ' - [γ-チオ]三リン酸（GTPγS）または60μlのGST-Rac1のビーズに無ヌクレオチド。
5. ヌクレオチドローディングコントロールの場合、3 10-μlのアリコートに、残りのビーズを分割し、各チューブに2μlの100 mMのGDP、2μlの10 mMのGTPγSまたは全くヌクレオチドを​​追加します。
6. ビーズを攪拌しながら30℃で30分間混合しインキュベートします。
7. 制御ミックス（ステップ4.5）のそれぞれに実験ミックス（ステップ4.4）に3μL、0.5μlの1 MのMgCl ₂を添加することにより塩基結合するRac1を安定させます。

5.競争が結合します。

1. 6マイクロチューブを設定し、それぞれ含みます：
   200μlの50mMトリス-塩酸（pHは7.6）、20mMの_MgCl 2を
   （ステップ4.7）10μlの実験ヌクレオチドロードRac1のビーズ
   5μlのRac1の結合タンパク質A（定数結合タンパク質）
2. 各チューブに、0、1、2.5、5、10または20μlのRac1の結合タンパク質B（可変結合タンパク質）を追加します。これらのボリュームは前提としていpproximately同等の株式定数と変数の結合タンパク質の濃度と調整する必要があります。
   1. そこに2つのタンパク質の結合親和性に大きな差があり、これは実験の繰り返しを通じて、経験的に決定する必要がある場合は結合タンパク質AとBのボリュームを調整します。 50mMトリス-塩酸（pHは7.6）の添加によって235μlに結合混合物の全量を、20mMの_MgCl 2を。
3. 含むマイクロチューブを設定します。
   200μlの50mMトリス-塩酸（pHは7.6）、20mMの_MgCl 2を
   （ステップ4.7）10μlの実験ヌクレオチドロードRac1のビーズ
   10μlのRac1の結合タンパク質A（定数結合タンパク質）
4. GDP、GTPγSなしヌクレオチド対照チューブを設定します。
   200μlの50mMトリス-塩酸（pHは7.6）、20mMの_MgCl 2を
   10μlの制御Rac1のビーズは、GDP、GTPγSまたは無ヌクレオチドでステップ4.5でロードされ、ステップ4.7で安定しました。
   180μlのHステップ3.6のように調製しEK293T GFP-TrioD1溶解物を、
   4μlの1 MのMgCl ₂
5. 4℃での反転により混合、2時間混合物をインキュベートします。
6. 50mMトリス-塩酸（pHは7.6）でビーズを3回洗浄し、20mMの_MgCl 2を。
7. 溶出サンプルバッファーを減らす20μlのタンパク質を結合した​​（50mMのトリス-HCl（pHが7）、5％SDS、20％グリセロール、0.02 mg / mlのブロモフェノールブルー、5％βメルカプトエタノール）。

競争の6分析

1. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）およびウェスタンブロットによって、結合したタンパク質（ステップ5.6）の10μLを解決します。
2. ブロッキング緩衝液中で1/1000に希釈した抗GFP抗体で4°CO / Nで膜をインキュベートすると、タグ付けされたGTPアーゼ結合タンパク質の両方を検出するために、PBS中0.1％のTween-20を1倍に希釈しました。
3. PBS、0.1％のTween-20で10分間、膜を3回洗浄します。
4. DyLight 800結合抗ウサギ秒で室温で30分間、膜をインキュベートブロッキング緩衝液中で1 /万希釈次側抗体は、PBS中の0.1％のTween-20を1倍に希釈しました。
5. PBS、0.1％のTween-20で10分間、膜を3回洗浄します。
6. 製造業者のプロトコルに従ってバンド強度を測定するためのソフトウェアを使用して、赤外線イメージングシステムを用いて膜をスキャンします。
7. 変数競争相手（タンパク質B）の体積に対する各タンパク質のバンド強度をプロットします。
8. 線は平衡が達成された競技者の割合を決定するために、一定の競争相手（プロテインA、5μL）の体積交差する点で可変競技者の容積を分割します。
9. ステップ6.1から6.6に記載されているように、ヌクレオチドローディング状態の検証については、p21活性化キナーゼ1（PAK1）（エフェクター）およびGFP-TrioD1（GEF）のための膜を探査。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE protease inhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathione magnetic beads	Pierce	88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antibody	Living Colors	632592	Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antibody	Cell Signaling	2602S	Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System	Li-cor	9260-11PC