Protocol
1. Rening av GST-märkt GTPas
- Kultur en E. coli-stam såsom BL21 transformerad med pGEX-RAC1 O / N vid 37 ° C under skakning med 220 varv per minut, i 500 ml autoinduktion media (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH4CI, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 0,5% glycerol, 0,05% glukos, 0,2% Laktos, 5 g trypton, 2,5 g jästextrakt, 100 ^ g / ml ampicillin).
- Harvest bakterier genom centrifugering under 10 min vid 10000 xg, 4 ° C.
- Resuspendera bakteriell pelleten i 20 ml proteinextraktion reagens, 1x proteasinhibitor och inkubera i 20 minuter vid RT med inversion.
- Klargöra lysatet genom centrifugering vid 40 tusen xg i 30 minuter.
- Lägg 2 ml glutation magnetiska pärlor, tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI).
- Inkubera i 2 h, blandning genom inversion vid 4 ° C.
- Tvätta protein pärlor fyllda fyra gånger med 10 ml PBS, med användning av en magnetisk partikelsorterare för att fälla ut pärlorna vid varje steg.
- Resuspendera proteinladdade pärlor i 2 ml PBS och lagra vid -80 ° C i 100 | il alikvoter tills det behövs.
2. Expression av GTPas-bindande proteiner
- Dagen före försöket, transfektera plasmider kodande grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt versioner av varje GTPas-bindande protein till en separat 75-cm 2 kolv med HEK293T enligt följande. För validering av nukleotid lastning, transfektera GFP-märkta TrioD1 i en tredje 75-cm 2 kolv HEK293T.
- Späd polyethylamine till 1 mg / ml i 100 ul steril 150 mM NaCI.
- Lägg 27 pl utspädd polyethylamine till 223 pl minskade serum media.
- Lägg 12 ug plasmid-DNA till 250 pl minskade serum media.
- Inkubera varje rör för 2 min vid rumstemperatur. Kombinera polyethylamine och DNA blandar i ett enda rör och vortexblanda i 2 minuter.
- Inkubera under 15-20 min vid RT.
- Ersätt tillväxtmediet (Dulbeccos modifierade Eagles media, 10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, inga antibiotika) på 90% konfluenta HEK293T med 5 ml färskt tillväxtmedium.
- Lägg den kombinerade polyethylamine / DNA-blandningen till kolven och inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
3. Rening av GTPas-bindande proteiner
- Skölj kolvar med transfekterade celler i PBS och dränera kolv under 5 minuter, aspire fri vätska.
- Skrapa av celler i 500 | il lysbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1 x proteasinhibitor) i mikrofugrör.
- Lyse cellerna genom att blanda genom inversion vid 4 ° C under 30 minuter.
- Under lys, tvätta två massor av 40 pl GFP-Trap pärlor tre gånger med färsk lysbuffert, sedimente pärlor vid 2700 xg under 2 min mellan tvättar.
- Klargöra lysaten genom centrifugering vid 21 tusen xg i 10 min.
- Överföring klar lysat av vart och ett av de konkurrerande proteiner för att separera tvättade GFP-fälla pärlor och tillåter GFP-fusionsproteiner att binda under 2 h, blanda genom inversion vid 4 ° C. Håll lysat från GFP-TrioD1 celler på is.
- Tvätta laddade GFP-Trap pärlorna två gånger i 50 mM tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCI, 0,7% (vikt / volym) Nonidet P-40 och två gånger i 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 , sedimente pärlor vid 2700 xg under 2 minuter mellan tvättar.
- Eluera GFP-fusionsproteiner genom tillsats av 40 pl 0,2 M glycin (pH 2,5) och pipettera upp och ned under 30 sekunder. Omedelbart sediment pärlor vid 21 tusen xg under 60 s och överföringsvätska till en ny mikrofugrör innehållande 4 | j, l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Gör detta snabbt att begränsa skadorna på det renade proteinet.
- Analysera 1 | il av varje renat protein genom Western blöt och sond med en anti-GFP-antikropp för att fastställa relativ utbyte med användning av en kvantitativ blotting system enligt tillverkarens protokoll. Alternativt, bestämmer proteinkoncentrationer av bicinkoninsyra (BCA) analys men detta introducerar fel om proteinerna inte reagerar med analysen på ett identiskt sätt eller om det finns kontaminerande proteiner.
- Utjämna molära proteinkoncentrationen genom tillsats av 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
4. Nukleotid lastning av GTPas
- Tina en alikvot av GST-RAC1 magnetiska pärlor, som framställts i steg 1.
- Ta 90 | il GST-RAC1 pärlorna och tvätta tre gånger med 20 mM tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, med användning av en magnetisk partikelsorterare för att fälla ut pärlorna vid varje steg.
- Aspirera buffert från pärlor och tillsätt 100 | il 20 mM tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
- Beroende på om BNP GTP eller ingen nukleotid lastning krävs för tävlingen experimentet, tillsätt 12 pl 100 mM BNP, 12 pl 10 mM guanosine 5 '- [γ-tio] trifosfat (GTPyS) eller ingen nukleotid till 60 pl GST-RAC1 pärlor.
- För nukleotid-belastningskontroller, dela de återstående kulorna i tre 10-l alikvoter och tillsätt 2 pl 100 mM BNP, 2 | il 10 mM GTPyS eller ingen nukleotid till varje rör.
- Inkubera bead Blandningar 30 min vid 30 ° C under omröring.
- Stabilisera nukleotid bundna RAC1 genom tillsats av 1 M MgCl2: 3 ul till experimentell blandning (steg 4,4), 0,5 mikroliter till varje kontrollpunkt blandningar (steg 4,5).
5. Konkurrens bindande.
- Ställ upp 6 mikrofugrör, vardera innehållande:
200 | il 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 il experimentella nukleotid belastade RAC1 pärlor (från steg 4,7)
5 pl RAC1 bindande protein A (konstant bindande protein) - Till varje rör till 0, 1, 2,5, 5, 10 eller 20 | il RAC1-bindande protein B (variabel bindande protein). Dessa volymer antaga enpproximately lika stock koncentrationer av de konstanta och variabla bindande proteiner och kan behöva justeras.
- Justera volymer bindande proteiner A och B om det finns stora skillnader i bindningsaffiniteter av de två proteinerna och detta bör bestämmas empiriskt genom experimentella upprepningarna. Fyll på den totala volymen av bindningsblandningen till 235 ^ il genom tillsats av 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Inrätta ett mikrofugrör innehåller:
200 | il 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 il experimentella nukleotid belastade RAC1 pärlor (från steg 4,7)
10 pl RAC1 bindande protein A (konstant bindande protein) - Konfigurera BNP GTPyS och ingen nukleotid kontrollrören:
200 | il 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 il kontroll RAC1 pärlor laddade i steg 4,5 med BNP, GTPyS eller ingen nukleotid och stabiliseras i steg 4.7.
180 | j, l HEK293T GFP-TrioD1 lysat, framställd som i steg 3,6
4 | il 1 M MgCl2 - Inkubera blandningen under 2 h, blandning genom inversion vid 4 ° C.
- Tvätta pärlorna tre gånger med 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Eluera Bundna proteiner i 20 ^ reducerande provbuffert (50 mM tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glycerol, 0,02 mg / ml bromfenolblått, 5% β-merkaptoetanol).
6. Analys av konkurrens
- Lösa 10 | il av det bundna proteinet (steg 5,6) genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och Western blöt.
- Inkubera membranet vid 4 ° CO / N anti-GFP-antikropp utspädd 1/1000 i blockeringsbuffert späddes till 1x i PBS, 0,1% Tween-20 för att detektera båda de märkta GTPas-bindande proteiner.
- Tvätta membranet tre gånger under 10 min med PBS, 0,1% Tween-20.
- Inkubera membranet under 30 min vid RT i DyLight 800-konjugerad anti-kanin-sekhands antikropp, utspädd 1 / 10.000 i blockeringsbuffert späddes till 1x i PBS, 0,1% Tween-20.
- Tvätta membranet tre gånger under 10 min med PBS, 0,1% Tween-20.
- Skanna membranet med hjälp av en infraröd avbildningssystem, med hjälp av programvaran för att mäta bandintensitet enligt tillverkarens protokoll.
- Rita bandet intensiteten hos varje protein mot volym av den rörliga konkurrent (Protein B).
- Dividera volymen variabel konkurrent vid den punkt vid vilken linjerna skär varandra med volymen av konstant konkurrent (Protein A, 5 | j, l) för att bestämma den tävlande förhållandet vid vilken jämvikt uppnås.
- För validering av nukleotid-laddningsstatus, sondmembran för p21-aktiverat kinas 1 (Pak1) (ett effektor) och GFP-TrioD1 (a GEF), som beskrivs i steg 6.1-6.6.
Representative Results
Detta protokoll är utformad för att beräkna de relativa affiniteterna hos bindningspartner för RAC1, utan att behöva känna till exakt koncentration av konkurrenterna (Figur 1). Fastställande av proteinkoncentration introducerar fel och behövs inte när man överväger konkurrensen mellan molekyler i en signalväg. Det är dock viktigt att veta att de två konkurrenter har samma molkoncentration i lagerlösningar för att möjliggöra enkla förhållanden beräknas när du lägger till olika volymer till analysen. 40 fil GFP-Trap pärlor har en bindningskapacitet på ~ 300 pmol så en sammanhängande 75 cm 2 flaskor med mycket uttryckande celler kommer att mätta pärlorna, vilket resulterar i att förberedelserna för de två olika bindningsproteiner kommer att likna före justering (Figur 2A). Om ett av proteinerna uttrycker dåligt kan detta problem övervinnas genom att rena detta protein från mer än en kolv med celler.
8 (figur 2B). GEFs binder företrädesvis till nukleotid fritt GTPas att stabilisera övergångstillståndet. Som GEFs har låg förekomst, vanligen inaktiv och ofta blot dåligt, är det bättre att överuttrycka en GEF eller GEF fragmentet till prov nukleotid fria GTPas. Vi använder ofta den första Dbl homologin i Trio, uttryckt som en GFP fusions (GFP-TrioD1 9) (figur 2B) men något GEF skulle fungera. Proteiner som binder till BNP belastade GTPase är ovanligare. Vi rapporterade nyligen RCC2 som ett sådant protein 7, eller BNP-lastning kan valideras helt enkelt som Binding varken GEF eller effektor.
Utsignalen från experimentet kommer att vara en Western blöt som visar de två GFP-märkta bindningspartners bundna till GTPas. Genom att använda en enda antikropp för att detektera båda proteinerna, kan de koncentrationer vid vilka liknande mängder av både konkurrenter binder bestämmas och därför relativa affinitet sluta. I detta exempel konkurrens mellan propellerdomänen av RAC1-trafficking protein, coronin-1C (RAC1-bindande protein A) och den RAC1-sekvestrerande protein, RCC2 (RAC1-bindande protein B), påvisas (figur 3A). Genom att använda en konstant volym av coronin-1C propeller (5 pl), och tillsats av ökande volymer av RCC2, kan vi se från GFP blot att jämvikt uppnås vid 1,25-2,5 il RCC2 (asterisk), vilket visar att RCC2 har en starkare affinitet för RAC1 än coronin-1C. Genom att mäta intensiteten hos banden med användning av kvantitativ Western blotting, och plottning genomsnittsvärden för varje competitor, kan jämviktspunkten beräknas noggrant genom att identifiera de volymer där kurvorna skär (Figur 3B).
En av de möjliga hinder för en framgångsrik konkurrensanalys är om bindningspartners binda till varandra samt bindning till RAC1. I fig 3A + B visar vi konkurrens mellan RCC2 och propellern domänen av coronin-1C, snarare än full längd coronin-1C. Skälet till att använda den stympade coronin är att coronin-1C binder även RCC2 genom svansdomän. När fullängds coronin-1C titreras mot RCC2, bindning av båda proteinerna detekteras, på grund av temärt komplex bildning, snarare än konkurrens (fig 3C). Om konkurrensen sker, kommer bindning av ett protein ökar medan den andra minskar, och den totala bundna GFP-fusion kommer att förbli konstant. I de fall då ett ternärt komplex bildas är det nödvändigt att trunkera en av GTPas-bindande proteinet så att konkurnärer inte längre samverkar.
Figur 1. Arbetsflöde. Schematisk bild av arbetsflödet för att bestämma affiniteten hos GTPas-bindande proteiner med hjälp av konkurrensanalyser. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Validering av renade proteiner. (A) Renat GFP-märkta RAC1 bindande proteiner analyserades genom Western blöt, sondering med anti-GFP-att bestämma den relativa utbytet av de två proteinerna. Denna typ av utjämning under experimentet tillåter koncentrationen av de två proteiner som skall justeras så att de matchar i bindningsexperiment. (B) GDP, GTPyS och ingen nukleotid belastad GST-RAC1 inkuberades med lysat från HEK293T uttrycker GFP-TrioD1 och bundna proteiner detekteras genom att avsätta för endogen Pak1 eller överuttryckt GFP-TrioD1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Western blot-analys av relativ proteinbindning. Exempel utgångar från konkurrensbindningsanalyser. (A) BNP-laddad RAC1 blandades med 5 pl GFP-coronin-1C propeller domän och ökande volymer av GFP-RCC2 titrerades i. Genom Western blotting bundna proteiner för GFP, är problem med differentiell detektering av de två proteinerna undvikas och GFP-signal rapporterar det molära förhållandet mellan de två fusionsproteinerna. Asterisker indikerar konkurrensförhållandena på either sidan av jämviktspunkten. (B) bandintensiteter av bundna GFP fusionsproteiner från tre oberoende experiment mättes genom kvantitativ Western blotting med användning av fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar och medelvärden ritas för att beräkna mängden RCC2 behövs för att nå jämvikt. (C ) Exempel som matas ut från ett experiment där RAC1-bindande proteiner binder till varandra och bildar ett ternärt komplex, stället för att konkurrera. BNP-laddad RAC1 blandades med 5 pl GFP-RCC2 och ökande volymer av GFP-coronin-1C fullängds titrerades i. Ökningen i bunden GFP-coronin-1C utan förlust av bundet GFP-RCC2 indikerar ternära komplexbildning. Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
