Abstract
Flere metoder er blevet brugt til at registrere og evaluere gastrointestinal motilitet herunder: optagelse ændringer i muskelspændinger, intraluminale pres, og membranpotentialet. Alle disse fremgangsmåder afhænger af måling af aktivitet ved en eller flere steder langs tarmen samtidigt som derefter fortolkes for at tilvejebringe en fornemmelse af den samlede tarmmotilitetsmønstrene. For nylig har udviklingen af videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning (STmap) teknikker gjort det muligt at observere og analysere komplekse mønstre i ex vivo hele segmenter af tyktarmen og tarm. Når registreret og digitaliseret, kan videooptagelser konverteres til STmaps, hvor den luminale diameter omdannes til gråtoner eller [kort diameter kaldes (Dmaps)] farve. STmaps kan levere data om motilitet retning (dvs. stationær, peristaltisk, antiperistaltic), hastighed, varighed, hyppighed og styrke af kontraktile motilitet mønstre. Fordele ved denne fremgangsmåde omfatter: analysis af interaktion eller samtidig udvikling af forskellige motilitet mønstre i forskellige regioner i samme segment, visualisering af motilitet mønster ændrer sig over tid, og analyse af, hvordan aktiviteten i én region påvirker aktivitet i en anden region. Videooptagelser kan afspilles med forskellige tidshorisonter og analyseparametre så separate STmaps og motilitet mønstre kan analyseres nærmere. Denne protokol specifikt detaljer virkningerne af intraluminale væske distension og intraluminale stimuli, der påvirker motilitet generation. Anvendelsen af luminale receptoragonister og antagonister giver mekanistisk information om, hvordan specifikke mønstre påbegyndes og hvordan man mønster kan omdannes til et andet mønster. Teknikken er begrænset af evnen til kun måle motilitet, der forårsager ændringer i luminal diameter, uden at data om intraluminale trykændringer eller muskelspændinger, og ved genereringen af artefakter baseret på forsøgsopstilling; selv, analysis metoder kan redegøre for disse spørgsmål. Sammenlignet med tidligere teknikker videooptagelse og STmap tilgang giver en mere omfattende forståelse af gastrointestinal motilitet.
Introduction
Der er udviklet forskellige metoder til registrering og analyse af tarmens motilitet løbet af de sidste 150 år 1. Disse har varieret fra den indledende in vivo-observationer og beskrivelser af William Beaumont og Walter Cannon til de nyere metoder til måling og fortolkning af multisite registrering af muskelspændinger, intraluminale pres, og / eller membran potentiale (dvs. forbindelsesepitoper potentialer) 2 - 6. Disse sidstnævnte tilgange giver et øjebliksbillede af de samlede motilitet mønstre, men er begrænset af antallet af lokaliteter af optagelse og gyldigheden af interpolation af data til områder i mellem optagelsen websteder.
Den seneste udvikling i videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning (STmap) teknikker har gjort det muligt at observere og analysere komplekse motilitet mønstre i ex vivo hele segmenter af tyktarmen og tarm. Indledende tilgange, først beskrevet for intestinal segmenter i slutningen af 1990'erne 7,8, afhang af investigator-designet software til at analysere videooptagelse; flere grupper har nu oprettet eller modificeret software til dette formål 2,8 - 12. Mens mange grupper har genereret deres egne softwarepakker eller plugins, de alle analyserer diametre på et væv segment og konvertere disse forskellige diametre til gråtoner repræsentation. Et kommercielt tilgængeligt registrering og analyse system kaldet gastrointestinal motilitet Overvågningssystem (Gimm) indeholder en nøglefærdig tilgang, der giver mulighed for analyse af både fremaddrivende motilitet via fækal pellet hastighed beslutsomhed i marsvin distale colon 13 samt analyse af fremaddrivende og blande motilitet mønstre med en væske stimulus i intakte tarm segmenter 4,5,14 - 19. Sidstnævnte fremgangsmåde afhænger generering og analyse af STmaps og er beskrevet i dette dokument. Målet med denne fremgangsmåde er at øge tHan evne til kvalitativt og kvantitativt at analysere forskellige tarmmotilitetsmønstrene til stede i tarmen. Mens andre grupper har brugt STmap til motilitet analyse gennem deres egen software, dette er den første beskrivelse af, hvordan du bruger Gimm til at analysere motilitet mønstre ved generering af STmaps. I nærværende papir, vi giver detaljerede trin-for-trin instruktioner om: forberedelse af tarmen væv til videooptagelse, korrekte indstilling af videooptagelse parametre for at maksimere evnen til at opdage ændringer i vævet diameter, oprettelsen af STmaps, samt fortolkning og analyse af STmaps hjælp af Gimm systemet og ImageJ software.
Den her beskrevne fremgangsmåde er specifik for analyse af den luminale perfusion af væsker eller halvfaste stoffer indeholdende forbindelser, som påvirker tarmmotilitet mønstre. Fremgangsmåde til analyse af fækalt pellet fremdrift er beskrevet i en artikel af Mawe og kolleger 13. Den generelle fremgangsmåde beskrevet her kunne væreanvendes på andre rørformede glatte muskelceller organer såsom: tyndtarmen, blodkar, urinrøret, urinledere, etc. Selv om denne fremgangsmåde i sig selv ikke giver oplysninger om ændringer i tryk eller muskelspændinger, kunne det kobles sammen med brugen af pres transducere, krafttransducere eller elektrofysiologiske målinger for at give et mere fuldstændigt billede af motilitet mønstre som nogle andre grupper har vist 2,15,20,21.
Protocol
Virginia Commonwealth University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte alle dyr og eutanasi procedurer, der anvendes i denne protokol.
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered 4 l Krebs buffer (bestående af [i mM]: 118 NaCl, 4,75 KCI, 1,19 KH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 2,54 CaCl2, 25 NaHCO3, 11 glucose). Afvej passende mængder af hver fast kemikalie, lagt i passende volumen af deioniseret vand og blandes under anvendelse af en vortex indtil opløsningen er klar.
- Derefter luftes opløsningen med carboxygen (95% O 2, 5% CO2) i 30 minutter under opvarmning til 37 ° C.
- Bestemmelse af pH i opløsningen, medens ved 37 ° C (den samme temperatur som i organbadet) og justeres til pH 7,4 om nødvendigt ved anvendelse af HCI. Hold Krebs buffer kontinuerligt carboxygenated og ved 37 ° C under hele varigheden af eksperimentet.
- Sættetilgang og afgang rør fra de peristaltiske pumper ind i stødpudebeholderen og tænd for peristaltiske pumper til at begynde perfusion af bufferen hele slangen og organbadet system.
BEMÆRK: Buffer kan indledningsvis blive pumpet tilbage i den oprindelige beholder, indtil tilsætningen af enten vævet ind i organbade eller kemikalier i perfusionspufferen. Dette reducerer den samlede mængde buffer, der kræves for eksperimenter. Så udgående buffer perfusion linjer bør placeres i en tom beholder, således at indgående og udgående buffere ikke blandes. - Kalibrer temperatur varmesystem på badet cirkulationspumpen så bufferen inden for de organbade bliver og forbliver 37,0 ± 0,5 ° C under hele forsøget. Bekræft og ændre om nødvendigt pH i Krebs puffer mindst én gang før anbringelse vævssegmenter i badet i trin 2.8.
2. Forberedelse af væv
- Afliveet marsvin ved brug af kuldioxid indånding / kvælning i en forseglet kammer eller en anden eutanasi godkendt af den lokale dyr pleje og brug udvalg metode.
- Efter bekræftelse eutanasi af dyret, skar bugvæggen på langs med dissektion saks og find tarmene. Skær mesenterium knyttet til tyndtarmen for at hjælpe eksponere coecum.
BEMÆRK: For at bekræfte eutanasi udføre en sekundær procedure som bilaterale thorakotomi som er godkendt af et dyr pleje og brug udvalg. - Find den distale ende af coecum og transektere den proximale colon lige distalt for dens forbindelse til coecum. Derefter transektere den proximale colon igen ~ 8 cm distalt for den første overskæring.
- Placer tyktarmen væv ind varmet og carboxygenated Krebs-opløsning (beskrevet i afsnit 1) for yderligere dissektion. Pin kolon i dissektion bad og bruge et mindre sæt saks til at fjerne så meget mesenterium og fedt som muligt.
- I heated dissektionsbakke, fjerne alle intraluminale indhold ved forsigtigt perfusion af Krebs-puffer gennem hulrummet ved hjælp af en sprøjte koblet til en stump ende kateter (for at forhindre perforation af vævet). Undgå overdreven udspiling af segmentet under denne proces perfusion.
- Få to brand-poleret glasrør katetre (3-mm diameter) og placere et kort stykke polyethylenrør (~ 3 mm lange og 3 mm ~ diameter) rundt om den del af røret glas indtaste væv lumen.
BEMÆRK: Dette vil tillade suturen skal placeres omkring vævet og glasrør sidde sikkert og ikke glider som fremstillingen anbringes i organbadet og under ændringer i væv længde. - Indsæt den ene kateter ind i den orale afslutningen af fremstillingen vævet og binde en sutur omkring den lille stykke slange omkring kateteret ved hjælp af en kirurg knude. Forsigtigt forsøge at trække kateteret ud igen for at sikre knuden er lun. Derefter udføre den samme handling på den anden kateter ind than aboral ende af vævet.
- Når katetrene er sikret, flytte hele forberedelse (væv plus katetre) fra dissektion bakke ind i en af organbade. Anbring præparatet i badet med den orale ende vender væk fra brugeren.
- Næste mount / sikre glasrøret katetre til organbadet af en af de to foreslåede metoder.
BEMÆRK: Sikring af glasrør forhindre vævssegment at ændre længden under forsøget eller kommer over overfladen af den Krebs buffer i badet.- Mulighed A: Fastgør øverste del af glasrøret til toppen af siden af plast organbad ved anvendelse af molder Ler eller en plast klip.
- Alternativ B: Fastgør glasrør til metalstænger, der holder kameraerne ovenstående fremstilling organbad ved anvendelse af plast klip.
- Når katetrene er fastgjort til badet, vedhæfte en 5-cm stykke rør til den åbne ende af hvert kateter. Til den mundtlige katheter, vedhæfte denne slange til en 10 ml sprøjte, som vil blive brugt til at injicere buffer i lumen i den proximale colon-segmentet. For aboral kateter, vil dette stykke slange tillade luminale udstrømning rettes i en opsamlingsbeholder (50 ml bægerglas, reservoir, etc.).
- Ved brug af sprøjten fastgjort til oral ende skylles langsomt opvarmet Krebs-puffer gennem vævet lumen for at sikre, at væsken kan strømme gennem vævet. Flow bekræftes af væske forlader aboral kateter. Kalibrere video-optagelse af systemet (protokol afsnit 3), mens vævet ligevægt i 30 min.
3. Kalibrering af video-optagelse System
- Kalibrere kameraet højde placering, video indstillingerne for lysstyrke og kontrast, og vandrette afstand ved hjælp af softwaren.
BEMÆRK: De bedste indstillinger til intraluminale perfusion opsætninger er anderledes end de indstillinger, der bruges til at bestemme hastigheden af pellet fremdrift 13. - Click på fanen eksperiment for kameraet at kalibrere. Så i menuen 'Filer' klik på 'Kalibrer. «
- Når videoen vises i "kalibrere arbejdsstation 'vinduet indstille kameraet i en højde, hvor billedet indbefatter enderne af katetre indsat i colon lumen.
- Derefter kalibrere den vandrette afstand ses i billedet ved hjælp af gennemsigtige lineal mærkat knyttet til hvert bad.
BEMÆRK: Denne kalibrering er afgørende for senere software beregninger af luminale diameter og hastighed kontraktile bølger. - I samme "kalibrere arbejdsstation 'vindue, sætte de røde lodrette retningslinjer, så de er 10 mm fra hinanden i overensstemmelse med herskeren i kameraets billede. Skriv derefter passende afstand (10 mm) i "distance markører 'vindue og klik på' CAL 'knappen.
- Dernæst justere forstærkningen, lysstyrke og lukkerhastighed skydere i "kalibrere arbejdsstation 'vinduet til at ændre kameraets billede, såvævet segment vises som en mørk silhuet på en lys baggrund.
BEMÆRK: Figur 4 viser gode og dårlige eksempler på denne kalibreringsproceduren. - Til korrekt justere billedet, også justere fokus og blænde drejeknapper på selve kameraet.
- Kalibrering er nu færdig. Klik på 'Gem', og klik derefter på 'OK' i pop-up, og til sidst klik på knappen "EXIT".
4. Generelt Eksperimentelle Procedurer
- Efter kalibreringsprocedurer kamera og 30 min af væv ligevægt er færdige, navngive forsøg i hver forsøgsprotokol. Prøve navne kan være baseret på navnet og koncentrationen af forbindelsen og mængden af væske, der intraluminalt perfunderet ind i vævet segment i den del af eksperimentet.
- Derefter lukke slangen rager ud fra aboral kateter ved anvendelse af en slangeklemme.
BEMÆRK: Dette forhindrer luminale væske forlader aboral slutningen under further eksperimenter, der tillader anvendelse af særlige dele i hulrummet at provokere forskellige distension (figur 1). - Injicer ca. 0,7 ml Krebs-buffer i den proximale colon lumen at give tilstrækkelig distension at indlede fremaddrivende kontraktioner i marsvin ex vivo forberedelse.
BEMÆRK: Denne mængde kan variere en smule (0,1 - 0,2 ml) afhængigt af længden af den intakte segment samlede og mængden af stretch påføres segmentet i organbadet. - Når segmentet er udspilet af luminal væske, tænde kameraet og derefter optage motilitet for en forudbestemt periode (fx 10 min).
- Konkret skal du dobbeltklikke på passende navn forsøg at åbne den eksperimentelle kamera visning og derefter klikke på vippekontakten til positionen "ON" for at se kameraets feltet. Klik derefter på knappen Optag for at starte optagelse (optage-knappen forbliver rødt, mens kameraet er optagelse) ennd klik på optageknappen igen for at stoppe optagelsen.
- Ved afslutningen af denne første kontrol udspiling forsøg, løsnes / fjernes klemmen okkluderende kateter aboral at tillade vævssegment at drive udspænding væske ud af hulrummet.
- Efter en 10 min reækvilibrering periode, gentages denne procedure med enhver af en række af næringsstoffer, bioaktive midler, lægemidler eller agonister / antagonister i den luminale fluid at ændre fremaddrivende motilitet af segmentet (f.eks kortkædede fedtsyrer eller decansyre syre) 10,18.
- At hjælpe gauge, når den nye eksperimentelle fluid ind i colon-segmentet, efterlade en luftboble nær havnen i sprøjten således at der ved perfusion af den nye løsning i colon lumen forløbet af boblen vil tillade brugeren at vide, hvornår den eksperimentelle væske har nået lumen.
- Fortsæt intraluminal perfusion med aboral kateter åben indtil boblen er blevet skubbet helt igennemluminal perfusionssystem (kan kræve 2-3 ml perfusat). Derefter tillade vævssegment for at uddrive fluid gennem den åbne aboral kateter i op til 5 min.
BEMÆRK: Efter denne procedure vil hulrummet indeholde en ubetydelig mængde af fluid, så perfusion af en kendt mængde væske i hulrummet.
- Re-okkludere aboral luminale kateterrøret ved hjælp af en slangeklemme (som i trin 4.3) indsprøjtes den samme mængde af udspænding fluid som i kontrolgruppen tilstand gennem sprøjten. Registrerer tarmmotilitetsmønstrene i forsøgsperioden for senere analyse og sammenligning med kontrollen Krebs tilstand (som i trin 4.5).
- Gentag afsnit 4.4 - 4.7 i protokollen med forskellige luminale forbindelser eller forskellige koncentrationer af det samme luminale sammensatte.
5. Konstruktion af Maps Spatiotemporal (STmaps)
- Efter afslutningen af optagelsen eksperimentet, skal du dobbeltklikke på navnet på en specifik retssag for at åbne analysen vindenow til opførelse af en STmap.
- Inden for videoafspilning område, justere kontrast og lysstyrke skydere i analysen vinduet for at gøre billedet passende for analyse (sort væv silhuet på lys baggrund, figur 4).
BEMÆRK: Hvis kameraet kalibreringen ikke blev udført korrekt, før du begynder eksperimentet billedet kan kun ændres i mindre omfang på dette punkt. - Når billedet er i kontrast korrekt, indstille de vandrette og lodrette røde retningslinjerne for videobilledet at isolere vævsområde til analyse og fjern områder med artefakter. Også, skal du vælge det rette tidspunkt segment fra optagelsen ved at bestemme start og stop tidspunkter til analyse.
- Konkret skal du vælge start- og slutpunkter i videoen ved hjælp af den grønne 'A' og gule 'B' knapper i analyse software. Indstil tiden skyderen til starten af videoen segmentet til at analysere ogn klik på 'A' knappen grøn. Derefter indstilles skyderen til slutningen af segmentet til at analysere og klik på den gule knap "B".
- Klik derefter på fanen 'motordrevne analyse "for at åbne STmap vinduet, og klik på knappen" stopuret ". Når du har klikket stopuret, næste klikke på sigtekornet markøren inden for det sorte silhuet af væv i indspillede film til at begynde STmap generation.
- Når du har klikket trådkorset i vævet silhuet, softwaren genererer og viser STmap for denne region af video.
BEMÆRK: Dette kan tage et par minutter afhængig af længden af videoen udvalgt til analyse. - Klik på 'zoom "for at se et forstørret billede af STmap og kontroller til at justere billedet.
- Klik på 'farve' i den nyoprettede vinduet for at se den STmap som farven i stedet for gråtoner. Klik også på 'Aktiver' muligheden for at kunne placere en markør på specifikke pixel i kort og view en sporing af ændringen i luminaldiameteren for den specifikke vævsområde. Klik på 'Afslut', når du er færdig.
- Eksportere en STmap til brug i papirer eller præsentationer eller til at analysere yderligere i ImageJ ved at vælge menuen 'Filer', efterfulgt ved at vælge "Eksporter data 'og derefter' Meta File '. Så navngive STmap, som vil blive gemt som en .emf fil, og klik på knappen 'Gem'.
- Alternativt gemme billeder af STmap ved at erobre et skærmbillede. Dette er nødvendigt for at redde pseudo-farve versioner af STmap.
6. Analyse af kontraktile Wave Velocity i STmaps
- For at analysere hastigheden af kontraktile formering eller sammentrækning varighed, først konvertere STmap .emf filen til .tiff, .gif, .jpg eller .bmp formater, der er acceptable for ImageJ gennem en fil konvertering program af valg.
BEMÆRK: ImageJ åbner ikke .emf format output af STmaps fra softwaren.- AlternativEly, brug screenshot capture software til at tage et billede af et STmap på skærmen og gemme det i et passende filformat.
- Åbn derefter re-formateret STmap i ImageJ og åbn derefter GIMMProcessor plugin ved at åbne "Plugins" menuen og vælge "GIMMProcessor«. Dette vil åbne både 'GIMMProcessor "og" Målinger Tabel' vinduer.
- Klik på 'rektangulære markeringsværktøj «i ImageJ vinduet og derefter bruge den til at skitsere, ved at klikke og trække hele området af scalebar i øverste højre hjørne af STmap. Efter denne region er valgt, skal du klikke på knappen 'sæt kalibrering "i plugin. Endelig indsætte passende afstand (mm) og tid (sek) i kalibreringen boksen overensstemmelse med værdierne på scalebar og klik på 'Udført'.
- Klik derefter på den linje tegneværktøj i ImageJ vinduet. Tegn en linje på STmap gennem centrum af en formerings sammentrækning langs vinkel på the hældning ved at klikke og trække på STmap billedet. Alternativt, tegne en lodret linje gennem et bånd af ikke-formerings sammentrækning at bestemme sammentrækning varighed.
- Efter linje tegnes korrekt (kun én linje kan trækkes på et tidspunkt), skal du klikke på knappen "tage måling" i plugin til at generere en udlæsning af den vandrette afstand, lodrette afstand, og hældningen af linjen; som svarer til længden (mm), tid (sek) og hastighed (mm / sek) henholdsvis. Disse data vises i "Målinger Table" vinduet.
- Gentag stregtegning og analyse trin flere gange inden for en given STmap og gemme data som en .gmd fil. Klik på "Gem" knappen i plugin og navngive filen. Klik derefter på 'Gem' igen for at fuldføre processen. Disse data kan senere sammenlignes med andre data forsøg eller anvendes til at re-tegne linjer på en STmap.
Representative Results
Forståelse Spatiotemporal Maps (STmaps) som Maps Diameter (Dmaps)
Mens de kort, der genereres ved denne teknik er spatiotemporale, ændring i den luminale diameter af vævet er den parameter specifikt visualiseret i både afstand og tid. Den STmap skildrer vandrette afstand langs vævssegment på x-aksen (i mm) og tid på y-aksen (i sek) med starttidspunktet foroven og sluttidspunkt nederst. I øverste højre hjørne er en legende, som viser minimum og maksimum luminale diameter samt skalering for både x- og y-akser (figur 1-4). Således forskellige pixel nuancer inden gråtonebilledet svarer til forskellige luminale diametre. Mørkere pixels svarer til bredere diametre og lettere pixels svarer til mindre diametre. Således vil kontraktile bølger af ringmuskel fremtræder som regioner lettere pixelation på grund af reduktionen i luminale diameter (
Luminal Udspiling-induceret Plantemateriale Sammentrækninger
I figur 1 blev marsvin proximale colon udspilet med 0,5, 1,0, 1,5 og 2,0 ml Krebs-puffer i 5 minutter ved hver volumen. Formerings kontraktioner fremkaldt af alle mængder ≥1.0 ml og vises som tynde hvide bånd i STmap (figur 1). Udspiling af tarmlumen forårsager indledningen af formerings sammentrækninger. Som vist i figur 1 er diameteren af lumenet stiger med større intraluminale mængder, og pixlerne i STmapsvarende til denne diameter bliver mørkere skabe en overordnet mørkere baggrund. På et eller andet niveau af udspiling den peristaltiske refleks er aktiveret (1,0 ml; figur 1), der initierer fremaddrivende bølger af sammentrækning ved den mundtlige ende, der reducerer diameteren af lumenet og bevæge sig mod den anale ende af segmentet (vist som et hvidt bånd i figur 1 og 4). Den hvide bånd repræsenterer kontraktion forudgås ofte af et mørkt bånd, som repræsenterer aboral afslapning forud for den peristaltiske bølge (figur 1C hvide pile). Disse hvide og mørke pixel svarer til opstigende sammentrækning og afslapning faldende komponenter af den peristaltiske refleks, henholdsvis 22,23. I STmap i figur 1 panel A, er der 0 fremaddrivende bølger på 0,0 ml, 0 fremaddrivende bølger på 0,5 ml udspiling, 3 fremaddrivende bølger på 1,0 ml udspiling, 6 fremaddrivende bølger på 1,5 ml udspiling, og 5 fremaddrivende bølger ent 2,0 ml distension.
Næringsstof-induceret Stationære / Mixing Sammentrækninger
Bølger af formeringsmateriale sammentrækning er ikke den eneste motilitet mønster, der kan visualiseres ved STmaps. Blanding mønstre af motilitet såsom segmentering kan også ses i STmaps og den tilsvarende billede (figur 2A). Dette mønster er anderledes end formerings sammentrækninger. Under blanding mønstre mange små, stationære sammentrækninger optræder i forskellige områder på samme tid (visualiseret som flere små hvide firkanter i samme vandrette linie, men ikke rører hinanden). Mens hver segmental kontraktion er stationært og ikke bevæger sig i den orale til anal måde som beskrevet for formerings sammentrækninger, evne til STmaps at illustrere komplekse kontraktile mønstre over lange tidsperioder tillader visualisering af den langsomme progression af sammentrækninger analt over tid (figur 2A sort pil). Varigheden afenkelte kontraktion kan også bestemmes ved at trække en lodret linje gennem det hvide sammentrækning offentlig hjælp ImageJ og den tilhørende plugin (figur 2A). I dette særlige STmap genereret fra intra-colon perfusion af kortkædede fedtsyrer, den gennemsnitlige stationære sammentrækning varighed er ~ 2 sek (interval: 1,9 til 2,1 sek). Mens mesenterium tilbage på et væv segment kan forårsage artefakter i analysen, kan den lodrette linje artefakter genereret af mesenteriet (1B, 2B) anvendes til at bestemme langsgående muskelbevægelser. I figur 1B og 2B den vandrette bevægelse af den sorte lodrette linje skyldes sammentrækning og afslapning af langsgående muskel. Denne sideværts bevægelse af den longitudinale muskel kan visualiseres på STmaps som horisontale bevægelser af lodrette bånd genereret af mesenterium artefakter (figur 1B, 2B).
ImageJ og Plugin Analyse af STmaps
Både hastigheden af bølgen, der udbreder en (figur 3) samt varighed kontraktion (figur 2) kan bestemmes ved hjælp ImageJ og GIMMProcessor plugin. I figur 3, udbredelseshastigheden af både ortograde og retrograd bølger var ca. 0,25 mm / sek (interval: 0,21-0,35 mm / sek). Som det kan ses i videobilledet ovenfor ST kortet, blev analyselinjerne (røde linjer danner en kasse på videobilledet) indstilles præcist omkring en kant af vævssegment i stedet for rundt om hele segmentet. Dette er en vigtig anvendelse af retningslinjerne i softwaren. Præcis indstilling af disse retningslinjer er afgørende for en ordentlig analyse af videoen som yderligere analyseret i diskussionen afsnit. Dette giver mulighed for generering af en STmap der visualiserer myogene ripple sammentrækninger 24. Disse sammentrækninger er myogen oprindelse og ikke ændre luminale diameter i høj grad. Også forskellige dirtninger af opformering (ortograde eller retrograd), som er fælles for krusninger, kan analyseres ved hjælp af denne teknik (figur 3). Som vist i figur 2 varigheden af sammentrækning kan variere i forskellige regioner i vævet segment.
Korrekt Analyse af STmaps
Et potentielt problem med oprettelsen af STmaps er mulig generation artefakt på grund af den eksperimentelle metode. For eksempel vil mesenteriet efterladt på ydersiden af vævet øge diameteren læsning for dette segment af vævet skaber en lodret sort streg på STmap (figur 1, 2B). Tilstedeværelsen af mesenterium også kunstigt udvider gråtoner kort ved at øge den bredeste luminale måling, hvilket resulterer i en afstumpning af kontrastmidlet målinger af skalaen. Af denne grund er det bedst at fjerne mesenterium så fuldstændigt som muligt fra det segment, uden at perforere vævet. En andre mulige STmap artefakt er en hvid lodret linje på grund af bobler inden den luminale væske, der ikke kan ses i modsætning til sort (figur 4B). Disse bobler kan gøre den luminale diameter synes mindre til analysen software eller overlay hvid / lys regioner på motilitet mønstre i STmap. Derfor opsætning af vævet segmentet og korrekt kontrasterende af videooptagelsen inden analyse er helt afgørende for succes i opbygningen STmaps (figur 4). Ægte og uægte kontrasterende opsætninger er vist i figur 4. Det er vigtigt at bemærke, at video justering i både præ-eksperimentet kamerakalibrering og post-eksperiment analysevinduesfunktion er afgørende for korrekt STmap generering og analyse. Forkert billede kalibrering kan føre til STmaps med ubrugelige data (figur 4A).
700 "/>
Figur 1. Plantemateriale Waves i den proksimale Colon. (A) En udspiling-responskurve (udført i marsvine proximale colon) blev anvendt til at bestemme den passende væskevolumen intraluminale at indlede formerings bølger i dette segment (hvide vandrette bånd). Sorte pile illustrerer eksempler på fuld længde formerings bølger. Hvide pile illustrerer den linje artefakt forårsaget af ufuldstændig mesenterium fjernelse. (B) En nærmere betragtning af formeringsmateriale sammentrækninger opnået af STmap generation fra et forsøg ligner panel A, men en video af kortere varighed. Det er lettere at bemærke, at de sammentrækninger fremskridt i den mundtlige til anal retning og til at identificere den foregående aboral afslapning repræsenteret som et mørkt område foran den hvide bånd i forhold til panelet A. Dette kort giver også en anden visning af mesenterium artefakter. Det røde felt identificerer området af denne STmap udvidet i panel C. (C) Dette panel viser et endnu tættere visning of den samme video og kortlægge som i panel B. hvide pile mærket "Fluid Udspiling" punkt til mørke pixels, der skyldes luminale udspiling af væske aboral til formerings bølge. Disse er områder, hvor cirkulære muskelafspænding sker aboral til cirkulær muskel sammentrækning. Bemærk, at formerings sammentrækninger ligner helt vandrette linjer i panel A grund af den lange tidshorisont på kortet. I paneler B og C den tid skalaer er gradvis mindre, så den kontraktile bølgen har en hældning, der kan måles og rapporteres som hastigheden af bølgebevægelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Bestemmelse af Sammentrækning Varighed af STmap. (A) Marsvin proximale colon shOWS en blandings / segmental motilitet mønster som reaktion på intraluminal perfusion af kortkædet fedtsyre (butyrat). Lodrette røde linjer er blevet trukket gennem perioder af sammentrækning til at bestemme sammentrækning varighed hjælp Billede J og GIMMProcessor plugin. Den sorte pil viser aboral retning for spredning af de stationære sammentrækninger. (B) Formeringsmateriale sammentrækninger i mus ileum viser ofte regioner af vedvarende sammentrækning. Lodrette pile trukket på dette kort viser, at mere orale regioner forblev indgået for en længere varighed. I dette præparat blev den anale afslutningen af fremstillingen lukket for at forhindre fluidum i at forlade det lukkede system i væv sammentrækninger. Billedet øverst viser panelet et tidspunkt, hvor hele oral ende af vævet er indgået (hvidt på STmap), mens hele anal ende er udspilet af væske (sort på STmap). Den vandrette / sideværts bevægelse af den lodrette sorte i midten af panelet B STmap viser bevægelse aflangsgående muskel lag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Tovejs Motilitet Patterns. Plantemateriale bølger kan bevæge sig i både ortograde (oral til anal) og retrograd (anal til oral) retninger. Solid sorte pile viser normal ortograde formering og stiplede sorte pile viser retrograd formering. Udbredelseshastigheden af både ortograde og retrograd sammentrækninger i denne STmap blev bestemt ved ImageJ analyse og var ~ 0,25 mm / sek. Billedanalyse linjer (røde linjer, der danner en boks på videobilledet over STmap) blev sat tæt på en kant af vævet til at visualisere myogene ripple sammentrækninger, som er lav amplitude, lavvandede sammentrækninger ofte orienteret i ortograde, retrograde, eller begge retninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Vigtigheden af korrekt billede Kontrast til STmap Generation. (A) viser en ukorrekt kontrast billede og STmap, mens felt B viser en korrekt kontrast billede og STmap. I (A) de vandrette hvide striber er genereret fra det korrekt kontrast billede (B), er ikke så indlysende, og der er flere artefakter (hvid skygge) på grund af den oprindelige billede er i gråtoner. I STmap genereret fra det korrekt kontrast billede (B) de hvide skygge artefakter for gråtoner forsvinde og de formerings bølger er mere udtalt. Også den sorte skygger repræsenterer afslapning ahEAD af formeringsmateriale kontraktile bølge kan ses i den anale ende af STmap med hver runde af kontraktion. I panel B de hvide pile illustrerer en STmap artefakt genereret af et område af billedet, som ikke kunne korrekt kontrast. Denne type artefakt skyldes hovedsagelig intraluminale bobler der lejlighedsvis opstår i forberedelsen i løbet af forsøgsprotokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Tarmmotilitet er blevet set og beskrevet ud fra en række perspektiver baseret på arten af de parametre registreres. Videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning har vist sig et værdifuldt værktøj, der giver en analyse af den samlede bevægelse og / eller fremdrift over lange segmenter af tarmen samt analyse af aktiviteten på bestemte punkter langs segmentet. Tilgangen til videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning kan være to, og er reflekterende af det undersøgte område, og arten af de luminale indhold. I intestinale segmenter, hvor luminale indhold er mere flydende og i proximal colon, hvor indholdet er mere halvfast, er aktiviteten induceret af intraluminale indførelse af væske ved bolus eller infusion. Spatiotemporale kort fremstillet af disse videooptagelser er designet til at repræsentere bevægelsen af hele segmentet som beskrevet ovenfor. I modsætning hertil i midten til den distale colon, hvor indholdet er mere solide, er aktivitet initieres ved indsættelse af en fækal pellet (epoxy coated pellet naturlige eller kunstigt pellet) og spatiotemporale kort er designet til at afspejle bevægelsen af pelleten gennem tyktarmen som illustreret i JOVE artikel i Hoffman et al. 13. Således opsætningen af eksperimentet og analyse er afgørende og afhænger af typen af stimulus og regionen blev undersøgt. De kritiske trin til generering og analyse af spatiotemporale kort væske-induceret intestinal motilitet er: 1) korrekt fjernelse af mesenterium fra det dissekerede væv; 2) korrekt billede kalibrering før optagelsen; 3) korrekt fjernelse af artefakter i løbet STmap generering og analyse; 4) korrekt opsætning af analysesystem; og 5) at få det håndelag ved selvkaterisation og suturere segmenterne uden at beskadige dem.
Mens anvendelsen af STmaps af luminal diameter har forbedret evne til at visualisere og analysere fuld tarmmotilitetsmønstrene over en region tarmen, er teknikken bedst bruges, når kombineret medfunktionelle målinger af tryk eller muskelsammentrækning 2,15,20. For eksempel, mens nogle muskelsammentrækninger kan ændre luminale diameter lidt og være synlig på nogle STmaps (dvs. myogene krusninger) kan de faktisk ikke forårsage nogen fremdrift eller sammenblanding af tarmindholdet 25. Dette kan ikke være kendt uden kobling af denne teknik til andre funktionelle målinger. Også arten af mange vævspræparater i denne type system (dvs. et lukket system eller luminal konstant luminal perfusion af et pumpesystem) medfører artefakter inden STmaps. Således skal brugeren være opmærksom på, hvordan deres specifikke forberedelse og eksperimentere orgel kan føre til artefakter i de data og måder at undgå eller udelukke disse artefakter i dataanalyse (f.eks mesenterium-induceret lodrette linjer eller mørke pixelering på grund af vævet manglende evne til at uddrive fluid fra systemet i en lukket præparat luminale). Der er flere metoder til luminal perfusion af en itact intestinal segment foruden et lukket system. En metode er at det i stedet et åbent system, som opretholder en konstant intraluminale / modtryk ved hjælp af en hævet rør og / eller envejsventil på anal afslutningen af fremstillingen 8-10,30. Dette gør det muligt for væske til at flytte ud af præparatet under fremaddrivende kontraktioner.
Da systemet er sat primært at konstatere ændringer i luminale diameter, disse sammentrækninger eller motilitet mønstre, der ikke har stor betydning luminale diameter er ofte vanskelige at visualisere denne protokol. Da ændringer i pixel shading i STmap er baseret på ændringer i luminal diameter, vil tarmmotilitetsmønstrene som ikke forårsager store ændringer i diameter visualiseres godt i denne metode, hvis stærke sammentrækninger er også til stede inden for den samme optagelse. Som beskrevet for visualisering og analyse af ripple-typen kontraktion (Figur 3), indstilling analysen linjer i videooptagelsen tættere to vævet væg kan undgå dette problem. Denne metode reducerer den maksimale diameter vises i STmap, så sammentrækninger, der kun minimalt ændre væv diameter kan visualiseres. En anden mulighed for at løse dette problem er ved at ændre varigheden af den video segment analyseret, at udelukke sammentrækninger som i høj grad påvirker luminale diameter, så at mindre sammentrækninger lettere visualiseres. Dette fører til det potentielle problem med motilitet, der minimalt ændrer luminaldiameteren søger ligner en separat STmap hvor sammentrækninger stærkt ændret luminale diameter. Dette skyldes, at fastsættelsen af hvide pixler på kortet er baseret på den mindste diameter i en given video. Hvis der ikke er meget variation i diameter inden for video (lidt eller ingen sammentrækning af cirkulære muskel) meget små sammentrækninger, der ikke ændrer diameteren af præparatet i høj grad kan ligne peristaltiske sammentrækninger fra en anden video. Derfor er det vigtigt at overveje figurenlegende i øverste højre hjørne af kortet. Hvis forskellen mellem de maksimale og mindste diameter er lille, er det vigtigt at sammenligne STmap til videoen blev genereret fra at bestemme gyldigheden af pixel skygge ændring som repræsenteret i STmap. Således undersøgelse af skalalinjen sammenholdt med den egentlige optagelse er afgørende for korrekt fortolkning af kortet.
Videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning af tarm og colon segmenter er blevet anvendt på en række forskellige arter, herunder zebrafisk 26, mus 25,27 - 30, rotte 7,9,30 - 33, marsvin 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, brushtail possum 12,36, kanin 2,30,37,38, kylling 39, gris 40,41 og human 42. De mest undersøgte arter er marsvin. Dette er ikke overraskende, fordi marsvinet enteriske nervesystem hsom er mest fuldstændigt karakteriseret og historisk set har været dyret mest undersøgte in vitro med hensyn til fremaddrivende motilitet af tarmen 43. Spatiotemporal kortlægning har været det meste anvendt på rørformede segmenter af tarmen fra små dyr; Men studier i kanin og svin ved hjælp af modificerede systemer demonstrere anvendelsen af denne metode til større dyr. I tilfælde af kanin, den fremgangsmåde er identisk med mindre dyr, bortset fra at større segmenter og organbade blev anvendt 30. Den anvendte metode i grisen var at anvende en eksterioriseret løkke af tarmen fra en bedøvet gris stedet nedsænkning af en dissekeret væv-segment i et organbad. Også, blev STmaps genereret af krydskorrelation i stedet for gennemlysning anvendte metode i de fleste undersøgelser 40. Den isolerede, vaskulært perfunderet forberedelse loop til videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning er også blevet anvendt til mindre arter som rotte
Studier af STmaps genereret fra væg bevægelser og ændringer i luminale diameter (også kaldet Dmaps) har tilladt detaljerede beskrivelser af motilitet mønstre såsom fremaddrivende peristaltiske bølger og lokaliserede segmenter sammentrækninger. Mens disse mønstre blev identificeret ved tidligere eksperimentelle metoder, den nuværende tilgang tillader en mere detaljeret definition af lokaliserede kontraktile bevægelser som krusninger og nye anti-peristaltiske sammentrækninger 9,24,25,30,31,42. Opførelsen af STmaps og analyse af udviklingen i motilitet mønster er blevet anvendt på centrale spørgsmål i gastrointestinale motilitet af tarmen og kolon. Disse omfatter: differentiering af neurogene og myogene sammentrækninger og definere den rolle, interstitielle celler af Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, forstå komplekseinteraktioner mellem de cirkulære og langsgående muskellag 2,7,8,11,12,32,39,40, der undersøger effekten af intraluminale næringsstoffer 10,18,19, mikrobielle stammer 34, og viskositeter 12,36 på forskellige motilitet mønstre, og forstå den rolle, som forskellige endogene neurohormonale agenter og eksogene farmakologiske midler 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 i genereringen og ændring af motilitet. Fremtiden for denne teknik indebærer at koble det med andre målinger, herunder tryk, elektrofysiologi og spændinger / kontraktilitet. Nylige undersøgelser har ofte inkorporeret et eller flere af disse målinger i forbindelse med videooptagelse og spatiotemporale kortlægning for at tilvejebringe yderligere detaljer korrelative 2,42. Endvidere kan systemet anvendes til at måle motiliteten i andre rørformede og ikke-rørformede organer. For eksempel har der været gjort forsøg på at måle gastrisk motilitet ved hjælp afet sådant system, men teknikken og software brug raffinement til bedre at kvantificere motilitet i sådan en ikke-rørformet organ 45. Der er ingen tvivl om, at brugen af spatiotemporale teknikker kortlægning alene og i kombination med mere traditionelle analysemetoder vil føre til en mere dybdegående og omfattende forståelse af gastrointestinal motilitet i fremtiden.
Acknowledgments
DMK blev støttet af et IRACDA bevilling fra NIGMS (K12GM093857) til Virginia Commonwealth University. Dette arbejde blev støttet af NIDDKD tilskud DK34153 til John R. Grider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | For Krebs buffer. |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | BP366 | For Krebs buffer. |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Fisher | P285 | For Krebs buffer. |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | For Krebs buffer. |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C7902 | For Krebs buffer. |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328 | For Krebs buffer. |
| Glucose | Sigma | G7021 | For Krebs buffer. |
| Carboxygen (95% O2/5% CO2) | |||
| Dissecting pins | |||
| Dissecting trays/dishes | |||
| Dunkin Hartley Guinea Pigs | Charles River | Strain 051 | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | Freely available online. | |
| GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) | Catamount Inc., St. Albans, Vermont | Includes parts listed below. | |
| Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
| Bath Cameras | Included with GIMM. | ||
| Bath TransIllumination Backlights | Included with GIMM. | ||
| Organ Baths | Included with GIMM. | ||
| Backlight Intensity Controls | Included with GIMM. | ||
| GIMM Processor ImageJ Plugin | Included with GIMM. | ||
| Polyethylene Tubing | Included with GIMM. | ||
| Tubing Connectors | Included with GIMM. | ||
| Masterflex tubing for Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
| Heating Bath/Water Circulator | Included with GIMM. |
References
- Szurszewski, J. H. A 100-year perspective on gastrointestinal motility. Am. J. Physiol. 274 (3 Pt 1), G447-G453 (1998).
- Dinning, P. G., Arkwright, J. W., et al. Temporal relationships between wall motion, intraluminal pressure, and flow in the isolated rabbit small intestine. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (4), G577-G585 (2011).
- Dinning, P. G., Zarate, N., et al. Pancolonic spatiotemporal mapping reveals regional deficiencies in, and disorganization of colonic propagating pressure waves in severe constipation. Neurogastroenterol. Motil. 22 (12), e340-e349 (2010).
- Hoffman, J. M., McKnight, N. D., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The relationship between inflammation-induced neuronal excitability and disrupted motor activity in the guinea pig distal colon. Neurogastroenterol. Motil. 23 (7), 673-e279 (2011).
- Wood, M. J., Hyman, N. H., Mawe, G. M. The effects of daikenchuto (DKT) on propulsive motility in the colon. J. Surg. Res. 164 (1), 84-90 (2010).
- Smith, T. K., Oliver, G. R., et al. A smooth muscle tone-dependent stretch-activated migrating motor pattern in isolated guinea-pig distal colon. J. Physiol. 551 (Pt 3), 955-969 (2003).
- Benard, T., Bouchoucha, M., Dupres, M., Cugnenc, P. H. In vitro analysis of rat intestinal wall movements at rest and during propagated contraction: a new method. Am. J. Physiol. 273 (4 Pt 1), G776-G784 (1997).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Chen, J. H. H., Zhang, Q., et al. Neurogenic and myogenic properties of pan-colonic motor patterns and their spatiotemporal organization in rats. PLoS One. 8 (4), e60474 (2013).
- Gwynne, R. M., Thomas, E. A., Goh, S. M., Sjövall, H., Bornstein, J. C. Segmentation induced by intraluminal fatty acid in isolated guinea-pig duodenum and jejunum. J. Physiol. 556 (Pt 2), 557-569 (2004).
- Lammers, W., Cheng, L. Simulation and analysis of spatio-temporal maps of gastrointestinal motility. Biomed. Eng. Online. 7 (2), (2008).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W., Asvarujanon, P., Chambers, P., Stafford, K. J., Hemar, Y. High definition mapping of circular and longitudinal motility in the terminal ileum of the brushtail possum Trichosurus vulpecula with watery and viscous perfusates. J. Comp. Physiol. B. 177 (5), 543-556 (2007).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J. Vis. Exp. (46), (2010).
- Krauter, E. M., Strong, D. S., Brooks, E. M., Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Changes in colonic motility and the electrophysiological properties of myenteric neurons persist following recovery from trinitrobenzene sulfonic acid colitis in the guinea pig. Neurogastroenterol. Motil. 19 (12), 990-1000 (2007).
- Spencer, N. J., Nicholas, S. J., et al. Mechanisms underlying distension-evoked peristalsis in guinea pig distal colon: is there a role for enterochromaffin cells? Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 301 (3), G519-G527 (2011).
- Sia, T. C., Brookes, S. J., Dinning, P. G., Wattchow, D. A., Spencer, N. J. Peristalsis and propulsion of colonic content can occur after blockade of major neuroneuronal and neuromuscular transmitters in isolated guinea pig colon. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 305 (12), G933-G939 (2013).
- Nicholas, S., Spencer, N. J. Peristalsis and fecal pellet propulsion do not require nicotinic, purinergic, 5-HT3, or NK3 receptors in isolated guinea pig distal colon. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 298 (6), G952-G961 (2010).
- Hurst, N. R., Kendig, D. M., Murthy, K. S., Grider, J. R. The short chain fatty acids, butyrate and propionate, have differential effects on the motility of the guinea pig colon. Neurogastroenterol. Motil. 26 (11), 1586-1596 (2014).
- Kendig, D. M., Hurst, N. R., et al. Activation of the umami taste receptor (T1R1/T1R3) initiates the peristaltic reflex and pellet propulsion in the distal colon. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 307 (11), G1100-G1107 (2014).
- Gwynne, R., Bornstein, J. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292 (4), G1162-G1172 (2007).
- Lammers, W. J. Spatial and temporal coupling between slow waves and pendular contractions. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289 (5), G898-G903 (2005).
- Grider, J. R. Neurotransmitters mediating the intestinal peristaltic reflex in the mouse. J. Pharmacol. Exp. Ther. 307 (2), 460-467 (2003).
- Foxx-Orenstein, A. E., Grider, J. R. Regulation of colonic propulsion by enteric excitatory and inhibitory neurotransmitters. Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 1), G433-G437 (1996).
- D'Antona, G., Hennig, G. W., Costa, M., Humphreys, C. M., Brookes, S. J. Analysis of motor patterns in the isolated guinea-pig large intestine by spatio-temporal maps. Neurogastroenterol. Motil. 13 (5), 483-492 (2001).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292 (3), G930-G938 (2007).
- Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. The J. Exp. Biol. 210 (Pt 6), 1084-1091 (2007).
- Singh, R. D., Gibbons, S. J., et al. Ano1, a Ca2+-activated Cl- channel, coordinates contractility in mouse intestine by Ca2+ transient coordination between interstitial cells of Cajal. J. Physiol. 592 (Pt 18), 4051-4068 (2014).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt 3), 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294 (4), G996-G1008 (2008).
- Costa, M., Dodds, K. N., Wiklendt, L., Spencer, N. J., Brookes, S. J., Dinning, P. G. Neurogenic and myogenic motor activity in the colon of the guinea pig, mouse, rabbit, and rat. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 305 (10), G749-G759 (2013).
- Huizinga, J. D., Martz, S., Gil, V., Wang, X. Y. Y., Jimenez, M., Parsons, S. Two independent networks of interstitial cells of cajal work cooperatively with the enteric nervous system to create colonic motor patterns. Front. Neurosci. 5 (93), (2011).
- Lentle, R. G., De Loubens, C., Hulls, C., Janssen, P. W., Golding, M. D., Chambers, J. P. A comparison of the organization of longitudinal and circular contractions during pendular and segmental activity in the duodenum of the rat and guinea pig. Neurogastroenterol. Motil. 24 (7), 686-695 (2012).
- Bercìk, P., Bouley, L., Dutoit, P., Blum, A. L., Kucera, P. Quantitative analysis of intestinal motor patterns: spatiotemporal organization of nonneural pacemaker sites in the rat ileum. Gastroenterol. 119 (2), 386-394 (2000).
- Wu, R. Y., Pasyk, M., et al. Spatiotemporal maps reveal regional differences in the effects on gut motility for Lactobacillus reuteri and rhamnosus strains. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), e205-e214 (2013).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (8), G749-G761 (2013).
- Janssen, P. W., Lentle, R. G., Asvarujanon, P., Chambers, P., Stafford, K. J., Hemar, Y. Characterization of flow and mixing regimes within the ileum of the brushtail possum using residence time distribution analysis with simultaneous spatio-temporal mapping. J. Physiol. 582 (Pt 3), 1239-1248 (2007).
- Costa, M., Wiklendt, L., et al. An experimental method to identify neurogenic and myogenic active mechanical states of intestinal motility. Front. Syst. Neurosci. 7, 7 (2013).
- Dinning, P. G., Wiklendt, L., et al. Neural mechanisms of peristalsis in the isolated rabbit distal colon: a neuromechanical loop hypothesis. Front. Neurosci. 8, 75 (2014).
- Janssen, P. W., Lentle, R. G., Hulls, C., Ravindran, V., Amerah, A. M. Spatiotemporal mapping of the motility of the isolated chicken caecum. J. Comp. Physiol. B. 179 (5), 593-604 (2009).
- Janssen, P. W., Lentle, R. G., Chambers, P., Reynolds, G. W., De Loubens, C., Hulls, C. M. Spatiotemporal organization of standing postprandial contractions in the distal ileum of the anesthetized pig. Neurogastroenterol. Motil. 26 (11), 1651-1662 (2014).
- Angeli, T. R., Du, P., et al. The bioelectrical basis and validity of gastrointestinal extracellular slow wave recordings. J. Physiol. 591 (Pt 18), 4567-4579 (2013).
- Kuizenga, M. H., Sia, T. C., et al. Neurally mediated propagating discrete clustered contractions superimposed on myogenic ripples in ex vivo segments of human ileum. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 308 (1), G1-G11 (2015).
- Kunze, W. A., Furness, J. B. The enteric nervous system and regulation of intestinal motility. Annu. Rev. Physiol. 61, 117-142 (1999).
- Dinning, P. G., Szczesniak, M. M., Cook, I. J. Twenty-four hour spatiotemporal mapping of colonic propagating sequences provides pathophysiological insight into constipation. Neurogastroenterol. Motil. 20 (9), 1017-1021 (2008).
- Berthoud, H. R., Hennig, G., Campbell, M., Volaufova, J., Costa, M. Video-based spatio-temporal maps for analysis of gastric motility in vitro: effects of vagal stimulation in guinea-pigs. Neurogastroenterol. Motil. 14 (6), 677-688 (2002).
